文竹，李軍，張永洪，黃婧

結(jié)腸癌(colorectal Cancer，CRC)是一種世界范圍內(nèi)最普遍的惡性腫瘤，起源于結(jié)腸組織，近年CRC的發(fā)病率在世界范圍不斷增加[1-2]。手術(shù)或手術(shù)結(jié)合放化療或靶向治療為CRC患者的主要治療策略[3]，當(dāng)癌細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移特性時(shí)，積極采用多方式聯(lián)合治療可明顯延長CRC患者的生存時(shí)間[4-6]。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)是一種鎮(zhèn)痛藥物，具有抗應(yīng)激、抗炎癥的功效[7-8]。近年研究顯示，Dex還具有抗腫瘤活性，如Dex可以抑制卵巢癌細(xì)胞NUTU-19中p38有絲分裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)/核因子-κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)信號(hào)通路激活，有效改善炎癥，提高細(xì)胞的免疫能力[9]。Dex還可通過p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路抑制骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖與遷移[10]。已有研究證實(shí)，Dex應(yīng)用于CRC手術(shù)鎮(zhèn)痛效應(yīng)好，且可以改善血流動(dòng)力學(xué)，保護(hù)心腦功能[11]，但是Dex對(duì)CRC細(xì)胞的影響，其機(jī)制是否涉及p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路，均不清楚。因此本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度Dex及p38MAPK/NF-κB信號(hào)激活劑處理CRC細(xì)胞，在體外探究Dex對(duì)CRC細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人CRC細(xì)胞Caco2，購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑及儀器

右美托咪定注射液購于揚(yáng)子江藥業(yè)公司；GibcoTMDMEM高糖培養(yǎng)液購于Thermo公司；LPS購于上海碧云天；雙抗購于Hyclone公司；CCK-8、Annexin V-FITC/ PI熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于上海生工公司；p53、ki-67、Bax、Bcl-2、p-p38MAPK、p38MAPK、p-NF-κB、NF-κB、GAPDH兔源抗體、羊抗兔IgG購于美國Abcam公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購于中新醫(yī)療儀器有限公司；倒置顯微鏡購于Olympus公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)器購于艾力特生命科學(xué)(上海)有限公司；酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀購于Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取人CRC細(xì)胞Caco2細(xì)胞株，于常溫下融化后移至T 25培養(yǎng)瓶中，輕柔吹打Caco2細(xì)胞，待其充分懸浮后，用含1%雙抗、10%胎牛血清混合液的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱氣象條件設(shè)置為5% CO2、95%O2，溫度設(shè)置在37℃。2 d更換一次培養(yǎng)液；Caco2細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，消化至細(xì)胞從瓶壁脫落后分瓶并傳代培養(yǎng)。

1.3.2 分組

取對(duì)數(shù)生長期的Caco2細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))、Dex低劑量組(1 μmol/L Dex培養(yǎng)液)[12]、Dex高劑量組(3 μmol/L Dex 培養(yǎng)液)、激活劑組(5 μg/mL LPS)[13]、Dex高劑量+激活劑組(3 μmol/L Dex 培養(yǎng)液與5 μg/mL LPS)，各組細(xì)胞按照不同給藥劑量進(jìn)行處理，以1.3.1中培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.3 CCK-8檢測(cè)Caco2細(xì)胞增殖情況

取1.3.2中各組對(duì)數(shù)生長期Caco2細(xì)胞，將Caco2細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104個(gè)/孔，培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)48 h時(shí)后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，此過程中所有培養(yǎng)條件設(shè)置為5% CO2，95% O2，溫度設(shè)置在37℃，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后使用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔Caco2細(xì)胞的吸光度(OD)值，并計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Caco2細(xì)胞凋亡情況

取1.3.2中各組對(duì)數(shù)生長期Caco2細(xì)胞，300 g離心5min，收集Caco2細(xì)胞，使用PBS洗滌Caco2細(xì)胞后，將Caco2細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105個(gè)，300g離心5min棄上清，加入1×Annexin V Binding Buffer工作液重懸各組Caco2細(xì)胞，再向各組Caco2細(xì)胞中加入5 μL的AnnexinV-FITC(標(biāo)記細(xì)胞)和5 μL的PI(染色液)進(jìn)行染色，將混勻的混合溶液，避光染色1 h后于細(xì)胞流式儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5 Western blot增殖、凋亡及p38MAPK/NF-κB通路蛋白的表達(dá)

取1.3.2中各組對(duì)數(shù)生長期Caco2細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，按照全蛋白提取試劑盒說明書，加入裂解液，裂解30分鐘獲取總蛋白。使用BCA蛋白試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，SDS-PAGE分離等量蛋白質(zhì)，按照濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，加入封閉液脫脂牛奶封閉1 h，添加p53、ki-67、Bax、Bcl-2、p38MAPK、p-p38MAPK、NF-κB、p-NF-κB、GAPDH兔源一抗在4℃下孵育過夜，TBST洗滌3次膠后添加羊抗兔IgG(1∶ 1000)常溫下孵育1 h。采用蛋白成像凝膠儀對(duì)增殖(p53、ki-67)、凋亡(Bax、Bcl-2)及p38MAPK/NF-κB通路蛋白條帶拍照并半定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的Dex對(duì)Caco2細(xì)胞增殖能力的影響

與對(duì)照組相比，Dex低、高劑量組Caco2細(xì)胞細(xì)胞增殖率顯著降低(P<0.05)，激活劑組Caco2細(xì)胞細(xì)胞增殖率顯著增加(P<0.05)；與Dex高劑量組相比，Dex低劑量組、Dex高劑量+激活劑組Caco2細(xì)胞細(xì)胞增殖率顯著增加(P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度Dex對(duì)Caco2細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 不同濃度的Dex對(duì)Caco2細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，Dex低、高劑量組Caco2細(xì)胞細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，激活劑組Caco2細(xì)胞細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與Dex高劑量組相比，Dex低劑量組、Dex高劑量+激活劑組Caco2細(xì)胞細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見表2、圖1。

表2 不同濃度的Dex對(duì)Caco2細(xì)胞凋亡的影響

圖1 不同濃度的Dex對(duì)Caco2細(xì)胞凋亡的影響。A：對(duì)照組；B:Dex低劑量組；C:Dex高劑量組；D：激活劑組；E:Dex高劑量+激活劑組

2.3 不同濃度的Dex對(duì)Caco2細(xì)胞中增殖與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，Dex低、高劑量組Caco2細(xì)胞中Bax蛋白水平及Bax/Bcl-2顯著升高(P<0.05)，p53、ki-67、Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)，激活劑組Caco2細(xì)胞中Bax蛋白水平及Bax/Bcl-2顯著降低(P<0.05)，p53、ki-67、Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與Dex高劑量組相比，Dex低劑量組、Dex高劑量+激活劑組Caco2細(xì)胞Bax蛋白水平及Bax/Bcl-2顯著降低(P<0.05)，p53、ki-67、Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見表3、圖2。

圖2 不同濃度的Dex對(duì)Caco2細(xì)胞中增殖與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的情況 A：對(duì)照組；B:Dex低劑量組；C:Dex高劑量組；D：激活劑組；E:Dex高劑量+激活劑組

2.4 不同濃度的Dex對(duì)Caco2細(xì)胞中p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，Dex低、高劑量組Caco2細(xì)胞中p-p38MAPK、p-NF-κB水平降低(P<0.05)，激活劑組Caco2細(xì)胞中p-p38MAPK、p-NF-κB水平顯著升高(P<0.05)；與Dex高劑量組相比，Dex低劑量組、Dex高劑量+激活劑組Caco2細(xì)胞中p-p38MAPK、p-NF-κB水平顯著升高(P<0.05)，見表4、圖3。

3 討論

CRC在中國是前五位確診癌癥和因癌死亡原因之一[14]。雖然治療方法不斷改進(jìn)，結(jié)腸癌患者的總體5年相對(duì)生存率仍不高，約為64%[15]。因此，醫(yī)學(xué)界仍在尋找CRC治療的新方式。Dex為高選擇性α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，經(jīng)常作為鎮(zhèn)痛劑使用[7]，對(duì)手術(shù)治療的CRC患者使用Dex不僅可有效鎮(zhèn)痛，還可改善患者凝血功能和免疫能力[16]。且研究顯示，Dex可以抑制胃癌細(xì)胞株的增殖，減輕移植瘤質(zhì)量，并促進(jìn)其自噬和凋亡[17]。本實(shí)驗(yàn)將Dex作用于體外培養(yǎng)的CRC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Dex對(duì)Caco2細(xì)胞也具有抑增殖、促凋亡作用。p53是多種增殖功能調(diào)節(jié)劑，其高表達(dá)可促進(jìn)癌癥的發(fā)生與發(fā)展[18]。ki-67廣泛用作臨床癌癥組織病理學(xué)的癌細(xì)胞增殖標(biāo)志物，其高表達(dá)可以顯著促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[19]?？沟蛲龅鞍譈cl-2與促凋亡蛋白Bax是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和生存的重要蛋白，同屬于Bcl-2家族，Bax/Bcl-2增加是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)因素，二者的表達(dá)情況與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Dex低、高劑量組Caco2細(xì)胞中Bax蛋白水平及Bax/Bcl-2升高，p53、ki-67、Bcl-2蛋白水平降低，且高劑量Dex作用更顯著，進(jìn)一步證實(shí)提示Dex可以抑制Caco2細(xì)胞株增殖，促進(jìn)Caco2細(xì)胞株凋亡。

圖3 p38MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 A：對(duì)照組；B:Dex低劑量組；C:Dex高劑量組；D：激活劑組；E:Dex高劑量+激活劑組

表3 不同濃度的Dex對(duì)Caco2細(xì)胞中增殖與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表4 Dex對(duì)p38MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路可將外部信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核，控制一系列生物學(xué)功能，包括細(xì)胞凋亡、增殖和分化，參與調(diào)控CRC等腫瘤進(jìn)展[21-23]。抑制MAPK和NF-κB等關(guān)鍵蛋白激活可調(diào)節(jié)凋亡蛋白和存活蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制肝癌、膀胱癌等進(jìn)展[24-25]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Dex低、高劑量組Caco2細(xì)胞中p-p38MAPK、p-NF-κB蛋白水平顯著降低，表明Dex可以抑制Caco2細(xì)胞中p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路活化，可能是其促進(jìn)Caco2細(xì)胞凋亡、抑制其增殖的機(jī)制。另外，與Dex高劑量組相比，Dex高劑量+激活劑組Caco2細(xì)胞凋亡率及Bax蛋白水平顯著降低，細(xì)胞增殖率、p-p38MAPK、p-NF-κB、p53、ki-67、Bcl-2蛋白水平顯著升高，表明激活劑可以逆轉(zhuǎn)Dex對(duì)Caco2細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)作用，因此，Dex可能通過抑制p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路來抑制Caco2細(xì)胞增殖，促進(jìn)Caco2細(xì)胞凋亡，推測(cè)在CRC手術(shù)治療時(shí)采用Dex麻醉可能有利于預(yù)后。

綜上所述，Dex可抑制人CRC細(xì)胞Caco2的增殖，并促進(jìn)其凋亡，可能與抑制p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，但本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，因此仍需深入研究。