劉 剛，朱芳賢，章曉煒，顧 峰，劉莉君，蘇 銳，孟 飛，許海濤，孫飛舟

(1.全國(guó)畜牧總站，北京 100193；2.浙江省畜牧技術(shù)推廣與種畜禽監(jiān)測(cè)總站，杭州 310021；3.蘇州太湖東山湖羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，蘇州 215107)

近年來(lái)，超低溫冷凍保存技術(shù)對(duì)畜禽遺傳資源保種的貢獻(xiàn)越來(lái)越大，在畜禽遺傳資源保護(hù)中發(fā)揮了重要作用[1-6]：①超低溫冷凍保存技術(shù)保種可以規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)，大量回收供體的配子和胚胎，提高安全性，可以克服活體保種中疫病、自然災(zāi)害 (干旱、水災(zāi)、戰(zhàn)爭(zhēng)爆發(fā)等)等因素造成的保種困難；②實(shí)現(xiàn)了遺傳材料的超低溫保存，可長(zhǎng)時(shí)間完整保存畜禽的遺傳信息，防止漂變。目前配子和胚胎冷凍保存的年限為200年以上，尤其是活體保種過(guò)程中群體有效含量降低到一定水平后，受近交和遺傳漂變等因素的制約，活體保種很難成功；③提高了保種效率，省時(shí)省力，節(jié)省資金，快速搶救性地保護(hù)了更多的瀕危畜禽遺傳資源。1992年，受世界銀行中國(guó)農(nóng)業(yè)支持服務(wù)項(xiàng)目資助，中國(guó)開始利用超低溫冷凍技術(shù)保存畜禽的精液、胚胎和體細(xì)胞等遺傳材料。截至2021年底，國(guó)家家畜基因庫(kù)中畜禽遺傳資源冷凍精液、冷凍胚胎、體細(xì)胞等遺傳材料保存總量達(dá)到120萬(wàn)余份，躍居世界首位。湖羊是中國(guó)特有的羔皮用綿羊品種，也是世界著名的多羔綿羊品種，具有性成熟早、繁殖力高、宜舍飼等優(yōu)良特性[7]。據(jù)國(guó)家畜禽遺傳資源品種名錄(2021版)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)綿羊有地方品種44個(gè)、培育品種33個(gè)、引入品種13個(gè)。為了檢驗(yàn)長(zhǎng)期保存的湖羊冷凍胚胎和冷凍精液的制作和保存質(zhì)量，評(píng)價(jià)超低溫冷凍保存技術(shù)保種的效果，同時(shí)為保種場(chǎng)擴(kuò)充血緣，本試驗(yàn)對(duì)國(guó)家家畜基因庫(kù)長(zhǎng)期保存的湖羊冷凍胚胎和冷凍精液進(jìn)行復(fù)蘇利用，對(duì)后代開展性能測(cè)定，驗(yàn)證其遺傳材料長(zhǎng)期超低溫保存效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 孕酮陰道栓(CIDR)，新西蘭DEC國(guó)際有限公司生產(chǎn)，1.9 g/支，批號(hào)：2017.11.20；氯前列烯醇(PG)，上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所生產(chǎn)，0.2 mg/2 mL/支，批號(hào)：2017.06.13；孕馬血清促性腺激素(PMSG)，寧波三生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，1 000萬(wàn)IU/支，批號(hào)：2016.12.15；促黃體素釋放激素A3(促排卵3號(hào))，寧波三生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，20 μg/支，批號(hào)：2017.07.12；精液稀釋劑，法國(guó)卡蘇公司生產(chǎn)，批號(hào)：2018.02.23。

1.1.2 試驗(yàn)用冷凍胚胎和冷凍精液 湖羊種羊群體的冷凍胚胎和冷凍精液在浙江余杭湖羊場(chǎng)(現(xiàn)國(guó)家湖羊保種場(chǎng))和浙江吳興種羊場(chǎng)進(jìn)行制作，并保存于國(guó)家家畜基因庫(kù)。本次研究使用試驗(yàn)材料為1998年制作保存20年的冷凍胚胎36枚，1988年制作保存30年的安瓿冷凍精液27劑(30年冷凍精液組)，1998年制作保存20年的0.25 mL細(xì)管冷凍精液75劑(20年冷凍精液組)。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 為了更好地與目前的湖羊?qū)φ?，試?yàn)選擇在湖羊原產(chǎn)地國(guó)家級(jí)保種場(chǎng)和保護(hù)區(qū)及省級(jí)保種場(chǎng)進(jìn)行，胚胎移植受體羊、冷凍精液配種受體羊、鮮精配種和本交配種受體羊都選擇純種湖羊，其胎次在2～4胎、遺傳背景一致、膘情中等、健康、繁殖性能好(母性好)的公羊和空懷母羊。2018年3月初開始受體羊選擇并單獨(dú)組群，最終選擇了18只公羊和160只母羊，提供相同的飼養(yǎng)管理方式。

1.2 方法

1.2.1 受體羊同期發(fā)情處理 胚胎移植受體采用CIDR+PG+PMSG同期化處理，放栓日為第1天，放栓后第12天撤栓，同時(shí)注射PG 1支、PMSG 300 IU，撤栓后24 h觀察發(fā)情(用公羊試情)，發(fā)情后注射促排卵3號(hào) 1支。冷凍精液人工授精和本交試驗(yàn)羊采用CIDR+PG同期化處理。

1.2.2 胚胎移植

1.2.2.1 冷凍胚胎解凍及鑒定 ①冷凍胚胎解凍及鑒定：從液氮罐中取出裝有胚胎的細(xì)管，室溫下放置10 s后投入32～35 ℃水浴中2 min。用消毒紙巾擦干細(xì)管，剪去封口端，將胚胎推入培養(yǎng)皿中，然后將胚胎依次移入分別含有6%、3%、0甘油的0.1 mol/L蔗糖的PBS解凍液中，分別停留5 min，最后用保存液洗3次，鏡檢。胚胎質(zhì)量依據(jù)《牛羊胚胎質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)規(guī)程(NY/T 1674—2008)》進(jìn)行鑒定，根據(jù)胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的卵裂球輪廓清晰度、明暗度，細(xì)胞密度及卵裂均勻度等形態(tài)結(jié)構(gòu)判斷級(jí)別。發(fā)育正常的胚胎，其卵裂球輪廓清晰，明暗度適中，細(xì)胞密度大，卵裂均勻，細(xì)胞變性率不超過(guò)10%，劃分為A級(jí)胚胎；胚齡與發(fā)育期基本吻合，輪廓清晰，明暗適中或稍暗或稍淡，細(xì)胞密度較小或小型卵裂球過(guò)多，細(xì)胞變性率為10%～20%，劃分為B級(jí)胚胎；輪廓不清晰，色澤過(guò)暗或者過(guò)淡，細(xì)胞密度小，細(xì)胞變性率為30%～40%，劃分為C級(jí)胚胎；退化胚、變性胚劃分為D級(jí)胚胎。

1.2.2.2 胚胎移植 參考《羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程(NY/T 1571—2007)》進(jìn)行胚胎移植，每個(gè)受體移植1～3枚胚胎。

1.2.3 冷凍精液解凍及人工授精

1.2.3.1 試驗(yàn)分組 試驗(yàn)分為30年冷凍精液組、20年冷凍精液組、0年冷凍精液組、鮮精組和本交組。其中鮮精組精液采集于國(guó)家湖羊保種場(chǎng)的12只湖羊公羊，采用相差顯微鏡目測(cè)，精子活力達(dá)到0.6以上進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。0年冷凍精液組的精液采集于國(guó)家級(jí)湖羊湖羊保護(hù)區(qū)(江蘇)的6只公羊，供體公羊均為隨機(jī)選擇，其繁殖性能正常，0年冷凍精液制成后存放于液氮中保存?zhèn)溆?，使用時(shí)解凍后用相差顯微鏡目測(cè)，其解凍后精子活力在40%以上進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。本交組公羊來(lái)源于國(guó)家湖羊保護(hù)區(qū)(江蘇)，隨機(jī)選擇10只采取本交方法配10只試驗(yàn)?zāi)秆?，用于后代生長(zhǎng)發(fā)育和后代繁殖性能等的比較。

1.2.3.2 冷凍精液解凍及精液質(zhì)量鑒定 30年安瓿冷凍精液解凍方法為在60 ℃溫水中快速解凍14 s，20年和0年的0.25 mL細(xì)管冷凍精液解凍方法為在38 ℃溫水中解凍15 s。冷凍精液質(zhì)量依據(jù)《山羊冷凍精液(GB 20557—2006)》對(duì)精液活力、密度和畸形率等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3.3 人工授精 將不同組的精液稀釋到每毫升精液中直線向前運(yùn)動(dòng)精子數(shù)在3 000萬(wàn)個(gè)左右，采用內(nèi)窺鏡子宮角輸精手術(shù)進(jìn)行人工授精，每只羊輸入0.7 mL，含2 400萬(wàn)個(gè)直線運(yùn)動(dòng)精子。

1.2.4 胚胎移植羊和冷凍精液后代羔皮性能評(píng)定 羔皮性能以一級(jí)羔皮率指標(biāo)評(píng)價(jià)，根據(jù)《小湖羊皮(GB/T 14629.1—2018)》和《湖羊(GB 4631—2006)》標(biāo)準(zhǔn)對(duì)試驗(yàn)羊及后代羊的花紋類型、花紋面積、花紋寬度、毛長(zhǎng)、花紋緊密度、羔皮等級(jí)進(jìn)行鑒定并給予等級(jí)評(píng)定。

1.2.5 胚胎移植羊和冷凍精液后代生長(zhǎng)發(fā)育測(cè)定 根據(jù)《綿、山羊生產(chǎn)性能測(cè)定的技術(shù)規(guī)范(NY/T 1236-2006)》標(biāo)準(zhǔn)對(duì)胚胎移植羊和冷凍精液后代的初生重、斷奶重、6月齡體重和體尺等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,用Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 胚胎保存效果

2.1.1 復(fù)蘇胚胎形態(tài)鑒定 本試驗(yàn)共解凍胚胎36枚，其中，A級(jí)胚胎22枚，B級(jí)胚胎7枚，C級(jí)胚胎5枚，D級(jí)胚胎2枚。按C級(jí)以上為有效胚胎計(jì)，冷凍胚胎復(fù)蘇利用率達(dá)到94.44%(34/36)，A級(jí)胚胎率達(dá)到61.11%(22/36)。

2.1.2 胚胎移植效果及后代羔皮性能 從2018年8月29日開始胚胎移植試驗(yàn)，對(duì)19只符合移植的受體母羊進(jìn)行移植，13只懷孕分娩，受胎率為68.42%；共移植胚胎34枚，出生17只羔羊，沒有畸形個(gè)體，胚胎復(fù)蘇移植產(chǎn)羔率為50.00%，成活羔羊16只，羔羊成活率為94%，一級(jí)羔皮率為31.25%，經(jīng)過(guò)鑒定，其體型外貌符合純種湖羊特征，并保持了當(dāng)年湖羊的羔皮特性。

2.2 精液保存效果

2.2.1 精液質(zhì)量檢測(cè) 30年冷凍精液組、20年冷凍精液組、0年冷凍精液組、鮮精組精液檢測(cè)結(jié)果見表1。30年和20年冷凍精液組精子活力均高于30%，且30年冷凍精液組精子活力高于20年組。

表1 精液質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 冷凍精液配種后代性能 由表2可知，試驗(yàn)中保存30年的冷凍精液受胎率為58.57%，羔羊一級(jí)羔皮率為42.03%，毛色更加潔白、波浪形花紋更加明顯，再現(xiàn)了30年前湖羊羔皮性能的典型特征；保存20年冷凍精液受胎率為53.66%，羔羊一級(jí)羔皮率為23.81%，二者后代均沒有畸形個(gè)體；保存30年冷凍精液受胎率均極顯著高于20年和0年冷凍精液組(P<0.01)，極顯著低于鮮精組和本交組(P<0.01)。保存30年冷凍精液羔羊一級(jí)羔皮率極顯著高于其他組(P<0.01)。

表2 試驗(yàn)羊受胎產(chǎn)羔情況及后代羔皮性能

2.3 胚胎移植羊和冷凍精液后代生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖情況

2.3.1 胚胎移植羊和冷凍精液后代生長(zhǎng)發(fā)育情況 由表3可知，胚胎移植羊初生重、斷奶重、6月齡體重、體高和胸圍等指標(biāo)均高于其他組(P<0.05)，30年冷凍精液和20年冷凍精液組后代初生重、斷奶重、6月齡體尺與0年冷凍精液、鮮精組和本交組差異均不顯著(P>0.05)。本交組后代初生重、斷奶重、6月齡體重、6月齡體高和6月齡胸圍等指標(biāo)低于胚胎復(fù)蘇羊、30年冷凍精液和20年冷凍精液組(P<0.05)。

表3 胚胎移植羊和冷凍精液后代生長(zhǎng)發(fā)育情況

2.3.2 胚胎移植羊和冷凍精液后代繁殖情況 由表4可知，試驗(yàn)出生的9只胚胎移植羊母羊100%受胎產(chǎn)羔，其后代平均產(chǎn)羔數(shù)和繁殖成活率都高于鮮精組和本交組(P<0.05)，一級(jí)羔皮率明顯高于鮮精組和本交組(P<0.01)，也高于30年和20年冷凍精液組(P<0.05)。30年和20年冷凍精液組后代都能正常受胎產(chǎn)羔，受胎率高于鮮精組和本交組；30年和20年冷凍精液組平均產(chǎn)羔數(shù)和繁殖成活率低于鮮精組和本交組，但差異均不顯著(P>0.05)，30年冷凍精液組的一級(jí)羔皮率高于20年冷凍精液組(P<0.05)，30年冷凍精液組的一級(jí)羔皮率高于鮮精組及本交組(P<0.01)，20年冷凍精液組也高于鮮精組和本交組(P<0.05)。

3 討 論

3.1 胚胎保存效果分析

胚胎超低溫冷凍保存是在極低的溫度(—196 ℃)下保存動(dòng)物胚胎，處于超低溫下的胚胎新陳代謝幾乎完全停止，可以達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的。學(xué)者們先后在牛[8]、綿羊[9]、山羊[10]、馬[11]、豬[12]等畜種進(jìn)行了冷凍保存試驗(yàn)，并得到移植后代。朱士恩等[13]將小鼠擴(kuò)張囊胚分別在液氮中冷凍保存1 h、1年和2年，解凍后囊胚形態(tài)恢復(fù)率分別為100%、98%和98%。本試驗(yàn)中冷凍胚胎復(fù)蘇利用率達(dá)到91.67%，A級(jí)胚胎率達(dá)到33.3%，表明胚胎長(zhǎng)期保存后也有好的恢復(fù)率。胚胎冷凍保存10年以上進(jìn)行移植在中國(guó)還未有報(bào)道，Whittingham等[14]開展了小鼠胚胎的長(zhǎng)期冷凍試驗(yàn)，將小鼠胚胎的冷凍時(shí)間延長(zhǎng)到8個(gè)月，并對(duì)胚胎進(jìn)行異地移植，獲得成功。王光亞等[15]對(duì)奶山羊的胚胎進(jìn)行長(zhǎng)期冷凍保存，將冷凍保存的時(shí)間延長(zhǎng)到819 d，成功獲得成活羔羊。尹海科等[16]報(bào)道冷凍8年的布爾山羊胚胎移植成功，胚胎復(fù)蘇移植產(chǎn)羔率為41%，以上報(bào)道表明胚胎冷凍保存后可以復(fù)蘇。胡振尉等[17]在1985年制作湖羊保種胚胎時(shí)解凍34枚胚胎，有24枚可以利用(占70.58%)，其中10枚胚胎用外科手術(shù)法移植給3只受體母羊，2頭懷孕，受胎率66.6%，產(chǎn)活羔3只，胚胎復(fù)蘇移植產(chǎn)羔率33.3%，低于本試驗(yàn)胚胎復(fù)蘇移植產(chǎn)羔率50.00%，因此本試驗(yàn)也表明胚胎長(zhǎng)期冷凍保存后可以復(fù)蘇，且隨著繁殖技術(shù)提高也可以獲得好的冷凍胚胎復(fù)蘇移植效果。

3.2 冷凍精液保存效果分析

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，保存30年和20年的冷凍精液，解凍后活力均在30%以上，與制作時(shí)(1988年和1998年)的活力相當(dāng)。冷凍精液質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果中，20年冷凍精液活力低于30年冷凍精液，可能因?yàn)?0年冷凍精液是以安瓿為載體，制作時(shí)(1988年)技術(shù)成熟，而20年冷凍精液是以細(xì)管為載體，制作時(shí)(1998年)是才開始研究推廣的技術(shù)。配種試驗(yàn)結(jié)果表明，保存30年和20年冷凍精液受胎率都達(dá)到了制作年代的受胎率。胡振尉等[17]1985年開展了湖羊冷凍精液的輸精試驗(yàn)，其情期受胎率在36.5%～75.0%，其中保存30年冷凍精液比20年受胎率高，與保存30年的活力高于20年的相關(guān)；保存30年和20年冷凍精液的后代成活率與鮮精組和本交組的后代成活率基本一致。以上結(jié)果說(shuō)明冷凍精液長(zhǎng)期保存后質(zhì)量和配種效果變化不明顯。

3.3 胚胎移植羊和冷凍精液后代遺傳性能和適應(yīng)性

試驗(yàn)結(jié)果顯示，30年冷凍精液后代一級(jí)羔皮率高于20年胚胎移植羊和20年冷凍精液后代以及鮮精組和本交組；胚胎移植羊一級(jí)羔皮率是31.25%，高于2019年湖羊保種場(chǎng)的26.05%(242/929)，與1989年制作胚胎時(shí)保種場(chǎng)的湖羊一級(jí)羔皮率(34.08%)相當(dāng)(數(shù)據(jù)來(lái)源于余杭保種場(chǎng)1989年測(cè)定數(shù)據(jù))，試驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明胚胎移植羊和冷凍精液后代保持了當(dāng)年湖羊羔皮特性。本試驗(yàn)羔皮等級(jí)結(jié)果符合湖羊養(yǎng)殖發(fā)展歷史，即從20世紀(jì)90年代后期開始，由于市場(chǎng)需求，湖羊選育目標(biāo)以肉用為主，羔皮性能不再是主要指標(biāo)，一級(jí)羔皮率有所下降。后代生產(chǎn)性能測(cè)定結(jié)果顯示，胚胎移植羊初生重、斷奶重、6月齡體重等指標(biāo)均高于其他組，可能是由于母羊產(chǎn)羔數(shù)少，羔羊得到更多的母乳。冷凍精液后代各項(xiàng)指標(biāo)與鮮精組及本交組差異不顯著，胚胎移植羊100%受胎產(chǎn)羔，30年和20年冷凍精液后代都能正常受胎產(chǎn)羔，受胎率與鮮精組及本交組差異不顯著，以上結(jié)果說(shuō)明胚胎移植羊和冷凍精液后代可以適應(yīng)當(dāng)前的生存環(huán)境，并能正常生長(zhǎng)和繁殖。下一步將利用分子生物學(xué)方法[6,18-21]對(duì)后代羊進(jìn)行深入分析。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)保存20年的湖羊冷凍胚胎、20年和30年的冷凍精液進(jìn)行復(fù)蘇，并連續(xù)跟蹤近2年，對(duì)胚胎移植羊和冷凍精液后代生長(zhǎng)、繁殖性能進(jìn)行測(cè)定，其冷凍胚胎復(fù)蘇率超過(guò)94%，冷凍精液復(fù)蘇后活力均超過(guò)30%；胚胎移植羊和冷凍精液后代體型外貌鑒定均符合純種湖羊特征，保持了湖羊原來(lái)的外貌特征，尤其是保持了當(dāng)年的羔皮性能；其后代生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖性能與現(xiàn)在的湖羊基本保持一致。研究充分證實(shí)了利用超低溫冷凍技術(shù)長(zhǎng)期保存湖羊冷凍精液和冷凍胚胎的方法是可行的，這是畜禽保種方式的重大突破，對(duì)地方品種保種具有重要意義。

致 謝：江蘇省畜牧總站張志峰，浙江省畜牧技術(shù)推廣與種畜禽監(jiān)測(cè)總站馬敏彪和劉雅麗，浙江華麗牧業(yè)有限公司白麗華和白慧琴，長(zhǎng)興永盛牧業(yè)有限公司胡志宏，天津市畜牧研究所張效生等參與了大量基礎(chǔ)性工作。