雷 寧 郝貴杰 黃愛霞 王雨辰 林 鋒① 沈小明 朱俊杰①

大口黑鱸()致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定及其特性分析*

雷 寧1郝貴杰2黃愛霞2王雨辰2林 鋒2①沈小明3朱俊杰1①

(1. 湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 浙江湖州 313000; 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省魚類健康與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省淡水水產(chǎn)研究所 浙江湖州 313001; 3. 德清昊源水產(chǎn)種業(yè)有限公司 浙江湖州 313200)

大口黑鱸()是我國重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類品種, 目前包括細(xì)菌性疾病在內(nèi)的諸多因素影響了其養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。維氏氣單胞菌是引起淡水魚敗血癥和潰瘍綜合征的重要病原菌。從患病大口黑鱸肝臟組織中分離到1株病原菌, 通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性分析、16S rRNA序列和特定毒力基因分析對(duì)其進(jìn)行鑒定, 并通過人工回歸感染試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)分析其致病性和耐藥性。結(jié)果表明該菌為致病性維氏氣單胞菌(), 含有、、、、和等毒力基因; 藥敏試驗(yàn)顯示其對(duì)頭孢曲松、氯霉素、氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、多粘菌素、復(fù)方新諾明、左氟沙星等8種抗生素高度敏感, 對(duì)新霉素、恩諾沙星、慶大霉素、鏈霉素、阿齊霉素、環(huán)丙沙星等6種抗生素中度敏感, 對(duì)其他8種抗生素具有一定耐藥性; 人工回歸感染實(shí)驗(yàn)表明該菌具有較高的致病性, 對(duì)大口黑鱸的半致死濃度為1.4×106CFU/mL。維氏氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的條件性致病菌, 研究結(jié)果揭示了該菌株的部分生物學(xué)特性, 有利于豐富維氏氣單胞菌屬的基礎(chǔ)數(shù)據(jù), 同時(shí)也為鱸魚養(yǎng)殖過程中的病害防控提供了一定的參考依據(jù)。

大口黑鱸; 維氏氣單胞菌; 藥敏試驗(yàn); 毒力基因

大口黑鱸()俗稱加州鱸, 隸屬于鱸形目(Perciformes)、鱸亞目(Porcoidei)、太陽魚科(Cehtrachidae)、黑鱸屬(), 是廣溫性淡水魚類, 肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)豐富、養(yǎng)殖周期短、生長速度快, 是國內(nèi)重要經(jīng)濟(jì)性淡水養(yǎng)殖品種之一。據(jù)統(tǒng)計(jì), 中國大口黑鱸產(chǎn)量占據(jù)全球總產(chǎn)量99.8% (Hussein, 2020), 至2019年, 資料顯示我國大口黑鱸年產(chǎn)量近50×104t。全國已有20多個(gè)省市養(yǎng)殖生產(chǎn)淡水鱸, 養(yǎng)殖面積超過1.33×104hm2(張紅燕等, 2019)。國內(nèi)大口黑鱸最大產(chǎn)區(qū)是華南的廣東地區(qū), 約占全國60%, 華東的浙江、江蘇地區(qū)產(chǎn)量約占全國30% (陳莉莉, 2018)。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大, 區(qū)域生產(chǎn)不平衡、價(jià)格波動(dòng)大、種質(zhì)資源退化及病害等因素, 嚴(yán)重影響了大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展(Hussein, 2020)。細(xì)菌、病毒和寄生蟲等是誘發(fā)大口黑鱸病害的重要原因, 其中細(xì)菌性疾病以柱狀黃桿菌病、氣單胞菌病、諾卡氏菌病為主, 病毒性疾病以病毒性潰瘍病、脾腎壞死病和彈狀病毒病為主, 寄生蟲病以車輪蟲、斜管蟲、指環(huán)蟲、累枝蟲、錨頭鳋等病原為主(國家特色淡水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系, 2021)。而細(xì)菌性疾病是魚類病害中占比極高, 具有傳染性較強(qiáng)、覆蓋區(qū)域廣、流行時(shí)間長的特點(diǎn), 由于新毒株增加快, 導(dǎo)致控制難度大, 其造成的經(jīng)濟(jì)損失約占據(jù)全部疾病所造成總體經(jīng)濟(jì)損失的半數(shù)以上(王玉堂等, 2013)。在淡水魚類細(xì)菌性疾病中, 屬細(xì)菌性敗血病造成的損失最為嚴(yán)重, 其病原體涵括了溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌以及維氏氣單胞菌(藺凌云等, 2018)。

維氏氣單胞菌()隸屬弧菌科、氣單胞菌屬, 屬于革蘭氏陰性菌, 可感染無脊椎動(dòng)物、水生脊椎動(dòng)物以及包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物(Lazado, 2018)。維氏氣單胞菌對(duì)大口黑鱸、草魚() (高彩霞等, 2018)、框鏡鯉() (胡天野等, 2012)、黃顙魚() (朱成科等, 2017)、懷頭鯰() (陸夢(mèng)瑩等, 2017)、藍(lán)曼龍魚() (陳亨利等, 2016)、齊口裂腹魚() (劉港彪等, 2012)、泥鰍() (徐先棟等, 2018)、胭脂魚() (黃文明等, 2013)、鳙魚() (朱若林等, 2017)、中華鱘() (田甜等, 2017)、鯽魚() (王利等, 2013)和羅非魚(Tilapia)(黎炯等, 2011)等魚類都具有一定致病性。維氏氣單胞菌廣泛存在于自然界中, 且有著較強(qiáng)的適應(yīng)性, 是引起淡水魚敗血癥和潰瘍綜合征的重要病原菌(Li, 2020)。水產(chǎn)品作為蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源之一。水產(chǎn)品若被維氏氣單胞菌污染, 人們食用后可能會(huì)誘發(fā)敗血癥及胃腸炎等疾病, 免疫力低下者甚至?xí)l(fā)生死亡(鄧龍君, 2021)。因此, 本研究對(duì)發(fā)病大口黑鱸病原菌進(jìn)行分離鑒定, 通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性分析、16S rDNA 序列鑒定、藥敏試驗(yàn)及毒力基因檢測(cè)對(duì)分離菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行分析, 以期為大口黑鱸維氏氣單胞菌病的診斷和有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

患病大口黑鱸[(10±1.5) cm]采自浙江省湖州市某養(yǎng)殖場(chǎng)。健康大口黑鱸[(7.00±0.65) g, (7.9±0.42) cm]購自湖州湖旺水產(chǎn)種業(yè)有限公司, 在50 L養(yǎng)殖桶內(nèi)暫養(yǎng)7 d后用于感染試驗(yàn)。

胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)和胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基均購于青島海博生物科技有限公司, 細(xì)菌生化微量鑒定管和藥敏試紙購自杭州濱和微生物試劑有限公司, 革蘭氏染色試劑盒購自索萊寶公司, 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司, OneTaq Quick-Load?2×預(yù)混液購自NEB公司, 所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細(xì)菌分離

患病大口黑鱸體表經(jīng)消毒后, 無菌環(huán)境下解剖檢查魚體, 用接種針從內(nèi)臟組織各部位取樣, 分別在TSA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng), 28 °C恒溫培養(yǎng)12 h; 觀察菌落形態(tài), 根據(jù)菌落特征的不同, 挑取優(yōu)勢(shì)菌株在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng), 分離純化得到的菌株命名為LB2101。

1.3 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

根據(jù)革蘭氏染色試劑盒操作說明對(duì)該分離菌進(jìn)行染色。先挑取單菌落涂片固定, 滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液初染1 min, 水洗; 滴加碘液媒染1 min, 水洗; 用95%酒精脫色約45 s, 水洗, 吸干水分; 最后滴加蕃紅復(fù)染1 min, 水洗, 自然晾干; 在100倍油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)以及染色特征, 并拍照保存。

將分離菌株接種于TSB培養(yǎng)基中, 振蕩培養(yǎng)過夜, 低速離心收集菌體, PBS洗滌后滅菌水重懸備用。將處理后的菌液與適量2%鋨酸小心混勻, 后把銅網(wǎng)覆蓋于混合溶液上, 靜置5 min左右; 滴加適量負(fù)染液磷鎢酸溶液于封口膜上, 處理好的銅網(wǎng)轉(zhuǎn)移至負(fù)染液磷鎢酸上靜置2 min左右, 吸去銅網(wǎng)上多余染液, 自然晾干, 透射電子顯微鏡下觀察并拍照保存。

1.4 生理生化特性分析

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠等, 2001)中細(xì)菌鑒定方法, 并采用細(xì)菌微量生化鑒定管對(duì)待測(cè)菌株各項(xiàng)生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定, 每項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均重復(fù)3次并設(shè)置對(duì)照。將分離菌株LB2101接種 TSA培養(yǎng)基, 28 °C培養(yǎng)至長出單菌落。挑取新鮮單菌落分別接種于22種細(xì)菌微量生化鑒定管中, 28 °C培養(yǎng)24 h或48 h, 后根據(jù)測(cè)定結(jié)果分析該菌株的生理生化特性。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒方法提取該分離菌株的DNA。采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行16S rRNA基因序列的擴(kuò)增, 正向引物為27F: 5′-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3′, 反向引物為1492R: 5′-TACG GTTACCTTGTTACGAC-3′, 擴(kuò)增片段大小約1 470 bp。擴(kuò)增反應(yīng)體系(50 μL): DNA模板2 μL, 正向和反向引物各1 μL, OneTaq Quick-Load?2×預(yù)混液25 μL, RNase-Free Water補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增條件: 95 °C預(yù)變性4 min; 95 °C變性30 s, 55 °C退火30 s, 72 °C延伸1 min, 35個(gè)循環(huán)后72 °C延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1% 凝膠電泳檢測(cè)。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序, 根據(jù)核苷酸測(cè)序結(jié)果, 利用NCBI中Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行同源序列比對(duì), 利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建基于細(xì)菌 16S rRNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹, 采用鄰接法(Neighbor joining method)建樹方法進(jìn)行菌株LB2101的系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

1.6 藥敏試驗(yàn)

利用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn), 28 °C培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈直徑, 測(cè)定3次取平均值, 根據(jù)杭州濱和微生物試劑有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行細(xì)菌敏感性判定。檢測(cè)的抗生素包含頭孢曲松、氯霉素、氟苯尼考、新霉素、恩諾沙星、強(qiáng)力霉素、阿米卡星、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、諾氟沙星、乙酰螺旋霉素、羧芐西林、青霉素、頭孢噻吩、多粘菌素、痢特靈、慶大霉素、鏈霉素、利福平、阿齊霉素、環(huán)丙沙星、左氟沙星等22種。

1.7 毒力基因檢測(cè)

根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)合成氣溶素基因、細(xì)胞毒性腸毒素基因、脂肪酶基因、膽固醇?；D(zhuǎn)移酶基因、脫氧核糖核酸酶基因、鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)基因及外膜蛋白等毒力相關(guān)基因的特異性引物(見表1), 以病原菌DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL): DNA模板1 μL, 正向和反向引物各0.5 μL, OneTaq Quick-Load?2×預(yù)混液12.5 μL, RNase-Free Water補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增條件: 95 °C預(yù)變性5 min; 95 °C變性30 s, 退火溫度30 s, 72 °C延伸1 min, 35個(gè)循環(huán)后72 °C延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.8 人工回歸感染試驗(yàn)

將分離菌株接種于TSB培養(yǎng)基中, 28 °C振蕩培養(yǎng)12h, 低速離心收集菌體, 用生理鹽水將菌液濃度分別調(diào)節(jié)至1.4×105、1.4×106、1.4×107、1.4×108和1.4×109CFU/mL。健康大口黑鱸隨機(jī)分為6組, 每組30尾, 試驗(yàn)組分別腹腔注射不同濃度菌液, 注射劑量為100 μL/尾, 對(duì)照組注射等量生理鹽水。試驗(yàn)期間水溫控制在28～30 °C。感染后每隔24 h觀察大口黑鱸的臨床表現(xiàn)并統(tǒng)計(jì)死亡情況, 連續(xù)監(jiān)測(cè)7d。從發(fā)病癥狀明顯的大口黑鱸肝臟等組織中分離病原菌, 進(jìn)行分離培養(yǎng)及鑒定, 以確定是否是該分離菌株導(dǎo)致大口黑鱸死亡。

表1 毒力基因PCR擴(kuò)增引物

Tab.1 Primers for virulence gene testing

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

根據(jù)觀察結(jié)果, LB2101菌落具有菌落呈圓形、表面光滑不透明、微隆起、呈現(xiàn)淡黃色。根據(jù)細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果(圖1a), 顯示該菌染色后呈紅色, 呈桿狀, 初步判定為革蘭氏陰性菌。經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)該菌體無側(cè)鞭毛, 極端著生單鞭毛(圖1b)。

2.2 生理生化特性分析

分離菌株LB2101對(duì)精氨酸脫羧酶、葡萄糖產(chǎn)氣、葡萄糖、蛋白胨水、苯丙氨酸、明膠、甘露醇和蔗糖等呈陽性; 而對(duì)賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、氨基酸對(duì)照、葡磷胨水、葡萄糖酸鹽、側(cè)金盞花醇、山梨醇、棉子糖、木糖、水楊素、尿素、枸櫞酸鹽、硫化氫和半固體瓊脂等呈陰性反應(yīng)(見表2)。結(jié)合細(xì)菌生化鑒定結(jié)果并根據(jù)文獻(xiàn)(東秀珠等, 2001)的鑒定方法, 發(fā)現(xiàn)分離菌株LB2101與維氏氣單胞菌的生理生化特性基本一致。

圖1 分離菌株的革蘭氏染色(a)形態(tài)及電鏡照片(b)

表2 分離菌LB2101的理化特性

Tab.2 The physiological and biochemical characteristics of LB2101

注: +表示陽性, –表示陰性

2.3 16S rRNA序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

利用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 其1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(如圖2)所示, 產(chǎn)物大小約1 470 bp。將該分離菌的核酸序列在NCBI庫上進(jìn)行比對(duì), 比對(duì)結(jié)果表明該菌株與維氏氣單胞菌HC050630A-1 (EF669480.1)同源性較高, 兩者同源性達(dá)99.24%; 該菌株16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果(見圖3), 顯示LB2101與維氏氣單胞菌HC050630A-1聚為一個(gè)分支。綜合菌株LB2101的表型、生理生化特征及16S rRNA測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果, 可以判定菌株LB2101屬于維氏氣單胞菌()。

圖2 菌株LB2101 16S rRNA PCR電泳結(jié)果

注: M: DL2000 DNA Marker; 1: LB2101

圖3 菌株LB2101 16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 藥敏試驗(yàn)

利用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示, 該分離菌株LB2101對(duì)頭孢曲松、氯霉素、氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、多粘菌素、復(fù)方新諾明、左氟沙星等8種抗生素高度敏感, 對(duì)新霉素、恩諾沙星、慶大霉素、鏈霉素、阿齊霉素、環(huán)丙沙星等6種抗生素中度敏感; 對(duì)阿米卡星、諾氟沙星、乙酰螺旋霉素、羧芐西林、青霉素、頭孢噻吩、痢特靈、利福平等8種抗生素具有耐藥性。

表3 菌株LB2101的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

Tab.3 The antimicrobial susceptibility test of LB2101

注: S表示高度敏感, I表示中度敏感, R表示耐藥

2.5 毒力基因檢測(cè)

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖4), 檢測(cè)表明菌株LB2101含有氣溶素基因、細(xì)胞毒性腸毒素基因、脂肪酶基因、膽固醇?；D(zhuǎn)移酶基因、鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)基因和外膜蛋白基因, 但不具有脫氧核糖核酸酶基因。

2.6 人工回歸感染試驗(yàn)

根據(jù)人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果, 試驗(yàn)期間對(duì)照組大口黑鱸未見異常, 試驗(yàn)組出現(xiàn)不同程度死亡情況(詳見表4)。大口黑鱸在感染后第2天開始出現(xiàn)死亡, 1.4×108CFU/mL濃度組48h內(nèi)死亡率達(dá)到100%; 1.4×106CFU/mL濃度組第3天開始出現(xiàn)死亡, 死亡率為50%; 而低濃度組1.4×104CFU/mL在第5天出現(xiàn)發(fā)病癥狀, 但該濃度組卻并未發(fā)生大量死亡。感染后發(fā)病的大口黑鱸出現(xiàn)游泳不正常、鱗片脫落、肛門紅腫、腹部膨大等臨床表現(xiàn)(圖5), 解剖發(fā)現(xiàn)腹腔有積液、肝臟腫大出血, 與自然發(fā)病大口黑鱸的癥狀相似, 且從發(fā)病魚體中可再次分離到該菌, 這充分表明LB2101分離株對(duì)大口黑鱸具有較強(qiáng)的致病性。

圖4 分離菌株毒力基因檢測(cè)

注: M: DL2000 DNA Marker; 1:; 2:; 3:; 4:; 5:; 6:; 7:

表4 分離菌LB2101的回歸感染試驗(yàn)

Tab.4 Pathogenic test of the isolated bacteria LB2101

3 討論

3.1 維氏氣單胞菌的分離鑒定

細(xì)菌性病原菌的鑒定方法有多種, 包括了血清分型、形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定、遺傳學(xué)分析等方法(宋路萍等, 2020)。其中, 16S rRNA基因檢測(cè)被許多學(xué)者認(rèn)為是細(xì)菌鑒定的有效方法(Kita-Tsukamoto, 1993)。16S rDNA序列同時(shí)包含了高度保守序列和高度可變序列, 可用于研究各類生物間的遺傳進(jìn)化關(guān)系(宋路萍等, 2020)。孟令緣等(2021)利用16S rDNA序列測(cè)定方法對(duì)18株金黃色葡萄球菌進(jìn)行鑒定, 結(jié)果表明可將其中15株菌鑒定到種水平。16S rDNA序列分析法可將菌株鑒定到種水平, 表明其鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本研究結(jié)合利用形態(tài)觀察、生理生化測(cè)定及16S rRNA分子鑒定法, 對(duì)從大口黑鱸肝臟中分離出的菌株LB2101進(jìn)行鑒定。本研究通過革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)該分離菌LB2101是革蘭氏陰性菌, 呈桿狀, 具極端單鞭毛; 生理生化結(jié)果可初步判定LB2101為維氏氣單胞菌; 利用16S rRNA分子鑒定法進(jìn)一步證實(shí)菌株LB2101是維氏氣單胞菌()。

圖5 患病大口黑鱸的癥狀

注: a、b和c為自然患病, d、e和f為人工感染。a: 鱗片脫落; b: 腹部膨大, 肛門紅腫; c: 腹腔積液; d、e: 鱗片脫落, 肛門紅腫; f: 肝臟有出血點(diǎn)

3.2 維氏氣單胞菌的毒力與致病性分析

維氏氣單胞菌可以感染大口黑鱸(楊超等, 2021)、草魚(高彩霞等, 2018)、鳙魚(朱若林等, 2017)、藍(lán)曼龍魚(陳亨利等, 2016)、鯽魚(王利等, 2013)、羅非魚(黎炯等, 2011)和胭脂魚(黃文明等, 2013)等多種水生魚類, 感染后臨床癥狀存在一定差異, 但大致都出現(xiàn)鱗片脫落、肛門紅腫及腹部有積液等臨床表現(xiàn)。該菌屬的致病性由多重因素決定, 涉及水生態(tài)環(huán)境以及毒力因子的分泌表達(dá)等。已知維氏氣單胞菌具有多種毒力因子, 如氣溶素、腸毒素、外膜蛋白、鞭毛、溶血素、細(xì)胞外蛋白酶、脂多糖和S層等(宋明芳等, 2018)。氣溶素通過與糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白相結(jié)合, 與宿主細(xì)胞發(fā)生相互作用在質(zhì)膜上形成一個(gè)通道, 從而引發(fā)小離子的滲透、激活G蛋白和某些細(xì)胞類型的凋亡(Abrami, 2003)。而細(xì)胞毒性腸毒素, 作為維氏氣單胞菌重要毒力因子之一, 它具有使腸道絨毛和小腸隱窩退化的作用, 可刺激腸道促進(jìn)其分泌作用從而導(dǎo)致小腸上皮細(xì)胞廣泛性損失(熊廣澤等, 2021)。外膜蛋白則是革蘭氏陰性菌的重要結(jié)構(gòu)特征, 它能夠促進(jìn)細(xì)菌黏附作用和增強(qiáng)致病性(宋明芳等, 2018)。有研究表明基因缺失可導(dǎo)致維氏氣單胞菌的毒力和粘附力顯著降低, 而基因編碼蛋白屬于外膜蛋白(Yang, 2019), 這間接說明外膜蛋白與維氏氣單胞菌的毒力或致病性密切相關(guān)。此外, 鞭毛在氣單胞菌侵染魚類細(xì)胞系的過程中也起著關(guān)鍵作用, 它的存在可作為菌株具有致病性的特征之一, 可增強(qiáng)病原細(xì)菌與真核細(xì)胞表面間的相互作用(Merino, 1997; Gavín, 2003)。

其中, 氣溶素()是維氏氣單胞菌感染魚類過程中最重要、最豐富的毒力因子之一(Foysal, 2019)。Li等(2020)從多種魚類體中分離出87株維氏氣單胞菌, 毒力基因檢測(cè)結(jié)果表明氣溶素()檢出率為88.51%。氣溶素的存在可作為判定菌株是否具有毒力的標(biāo)志(趙武義, 2018)。本研究檢測(cè)了維氏氣單胞菌7種毒力相關(guān)基因, 結(jié)果表明該分離菌株LB2101同時(shí)含有氣溶素()、細(xì)胞毒性腸毒素()、脂肪酶()、膽固醇?；D(zhuǎn)移酶()、鞭毛()和外膜蛋白()等多種致病性毒力因子, 但不具有脫氧核糖核酸酶()毒力基因。綜合人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果, 病魚出現(xiàn)鱗片脫落、肛門紅腫及腹腔積液等明顯癥狀, 充分表明本分離菌株具有顯著的致病性。

3.3 維氏氣單胞菌的藥敏性分析

不同養(yǎng)殖環(huán)境中分離出的維氏氣單胞菌, 其對(duì)抗生素的耐藥性會(huì)存在一定差異。如鄧龍君和楊超等分別從四川和佛山某養(yǎng)殖場(chǎng)分離得到維氏氣單胞菌, 藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明兩菌株對(duì)氟苯尼考和大觀霉素都敏感, 均對(duì)復(fù)方新諾明和阿莫西林產(chǎn)生耐藥性, 但在四環(huán)素、卡那霉素和多西環(huán)素上存在不同耐藥性(鄧龍君, 2021; 楊超等, 2021)。而本研究發(fā)現(xiàn)該分離菌株LB2101對(duì)氟苯尼考、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、新霉素、多粘菌素B和強(qiáng)力霉素等敏感, 對(duì)青霉素、乙酰螺旋霉素、羧芐西林和利福平等具有耐藥性, 這與鄧龍君(2021)和楊超等(2021)的試驗(yàn)結(jié)果都有差異, 說明了不同菌株間存在藥物敏感性差異。造成菌株間耐藥性差異的原因, 這可能是與養(yǎng)殖地區(qū)和抗生素種類等因素相關(guān), 不同養(yǎng)殖地區(qū)其抗菌藥物的使用類型、用藥劑量和用藥方式往往不同, 可能會(huì)形成不同的藥物環(huán)境或養(yǎng)殖環(huán)境。有研究證明, 病原細(xì)菌耐藥性與苗種來源、養(yǎng)殖水平和模式、菌株來源、分離年份及各地用藥習(xí)慣有關(guān)(胡大勝, 2010; 丁正峰等, 2011; 鄧玉婷等, 2019)。

3.4 大口黑鱸維氏氣單胞菌病的防治技術(shù)

鑒于維氏氣單胞菌其致病機(jī)理尚未清楚, 在養(yǎng)殖生產(chǎn)中主要以預(yù)防為主, 這其中防治的有效防治手段包括疫苗和免疫增強(qiáng)劑。水產(chǎn)上針對(duì)維氏氣單胞菌的疫苗已有研究, 如滅活疫苗(任燕等, 2019)、減毒疫苗(徐一軻等, 2019)、菌影疫苗(徐展等, 2014)、菌蛻疫苗(閆兵兵等, 2017)等。研究表明五味子、雞血藤、苦諫樹皮、丹參、烏梅、蘇木、五倍子、丁香、艾葉、石榴皮和地榆等中草藥, 對(duì)于維氏氣單胞菌有較好的抑制作用, 可用于預(yù)防維氏氣單胞菌感染(馬秀慧等, 2018; 朱成科等, 2018; 王寶屯等, 2021)。此外, 還可以通過調(diào)節(jié)魚體自身免疫力進(jìn)行防控, 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在飼料中添加益生菌(如干酪乳桿菌、屎腸球菌)和免疫調(diào)節(jié)劑(如百泰A、酵母細(xì)胞壁、?；撬?等可顯著增強(qiáng)魚體自身的非特異性免疫力, 有效提高抗維氏氣單胞菌感染的能力(郁歡歡等, 2014; 張海朋等, 2017; 鞠安琪等, 2018)。除此之外, 部分抗生素對(duì)維氏氣單胞菌也有著較強(qiáng)的抑菌效果。但抗生素濫用會(huì)導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象產(chǎn)生耐藥性, 而且抗生素殘留會(huì)引發(fā)水產(chǎn)品質(zhì)量安全問題, 間接性危害人類健康, 目前很多抗生素已經(jīng)列入禁用或限用范疇。因此, 在實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)于維氏氣單胞菌的防治, 需要根據(jù)國家漁業(yè)用藥標(biāo)準(zhǔn)合理用藥, 以選用適宜的中草藥、益生菌等為宜, 實(shí)現(xiàn)綠色養(yǎng)殖, 做到減量用藥。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從患病大口黑鱸肝臟組織中分離到1株病原菌, 通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性分析、16S rRNA序列和特定毒力基因分析對(duì)其進(jìn)行鑒定, 并通過人工回歸感染試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)分析其致病性和耐藥性, 結(jié)果表明分離獲得的維氏氣單胞菌是一種導(dǎo)致鱸魚發(fā)病的條件性致病菌。研究結(jié)果揭示了維氏氣單胞菌菌株的部分生物學(xué)特性, 有利于豐富該菌屬的基礎(chǔ)數(shù)據(jù), 為鱸魚養(yǎng)殖過程中的病害防控提供了有效的參考依據(jù)。

丁正峰, 薛暉, 王曉豐, 等, 2011. 江蘇主要水產(chǎn)病原菌耐藥譜系監(jiān)測(cè)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 39(2): 344-347.

馬秀慧, 姜海波, 羅學(xué)評(píng), 等, 2018. 中草藥對(duì)羅非魚源維氏氣單胞菌體外抑菌效果研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)(16): 174-176, 179.

王玉堂, 陳昌福, 呂永輝, 2013. 水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物致病菌耐藥性檢測(cè)數(shù)據(jù)實(shí)際作用[J]. 中國水產(chǎn)(10): 57-61.

王利, 魏勇, 2013. 鯽魚維氏氣單胞菌的分離鑒定及耐藥表型檢測(cè)[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)(3): 101-103.

王寶屯, 顏遠(yuǎn)義, 毛燦, 等, 2021. 82種中草藥及其復(fù)方對(duì)花鱸源維氏氣單胞菌的體外抑菌效果[J]. 華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 53(3): 64-72.

王惠, 2014. 不同動(dòng)物源性維氏氣單胞菌的生物特性及四種毒力基因比較研究[D]. 長春: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué): 19-23.

鄧玉婷, 譚愛萍, 張瑞泉, 等, 2019. 廣東主要水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū)氣單胞菌耐藥狀況的調(diào)查分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 50(11): 2375-2383.

鄧龍君, 2021. 大口黑鱸維氏氣單胞菌的分離鑒定及其感染的病理損傷[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 50(1): 164-171.

東秀珠, 蔡妙英, 2001. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京: 科學(xué)出版社: 106-120.

田甜, 張建明, 杜合軍, 2017. 中華鱘源維氏氣單胞菌的分離鑒定及其藥敏特性[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 44(6): 1011-1017.

邊宇, 錢宏偉, 孟慶峰, 等, 2013. 維氏氣單胞菌RCR快速檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 中國獸藥雜志, 47(1): 1-3.

朱成科, 王建, 周燕, 等, 2018. 150種中草藥體外抑殺維氏氣單胞菌的藥效研究[J]. 淡水漁業(yè), 48(1): 80-85, 96.

朱成科, 劉桂嘉, 張爭世, 等, 2017. 黃顙魚源維氏氣單胞菌Aha和gyrB基因雙重PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 39(10): 810-814.

朱若林, 馬騰, 陳露, 等, 2017. 鳙魚維氏氣單胞菌的分離鑒定及其毒力基因檢測(cè)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 44(2): 229-233.

任燕, 時(shí)云朵, 曾偉偉, 等, 2019. 維氏氣單胞菌滅活疫苗對(duì)草魚免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響及其保護(hù)效果[J]. 中國生物制品學(xué)雜志, 32(7): 726-731.

劉港彪, 王利, 王吉坤, 等, 2012. 齊口裂腹魚維氏氣單胞菌16S rDNA序列分析[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志, 33(1): 92-96.

閆兵兵, 姜娜, 羅琳, 等, 2017. 維氏氣單胞菌菌蛻疫苗免疫后鯉免疫應(yīng)答與基因表達(dá)特征[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 44(6): 1395-1404.

楊超, 董浚鍵, 劉志剛, 等, 2021. 大口黑鱸源維氏氣單胞菌的分離鑒定[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué), 17(3): 54-61.

宋明芳, 張冬星, 張海鵬, 等, 2018. 維氏氣單胞菌毒力因子的研究進(jìn)展[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué), 48(8): 1038-1042.

宋路萍, 楊振蘋, 王斌, 等, 2020. 基于16S rDNA快速鑒定細(xì)菌的PCR測(cè)序方法的建立及其進(jìn)化關(guān)系分析[J]. 中國醫(yī)藥科學(xué), 10(17): 86-91.

張紅燕, 袁永明, 賀艷輝, 等, 2019. 中國淡水鱸養(yǎng)殖生產(chǎn)現(xiàn)狀分析[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)(4): 112-114.

張海月, 康元環(huán), 陳龍, 等, 2016. 不同動(dòng)物源性維氏氣單胞菌OMPAⅠ基因的克隆及比較研究[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué), 46(5): 607-610.

張海朋, 谷巍, 鞠安琪, 等, 2017. 飼料中添加干酪乳桿菌對(duì)鯉魚非特異性免疫力和抗病力的影響[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 53(7): 85-88.

陸夢(mèng)瑩, 胡秀彩, 呂愛軍, 等, 2017. 鯰源維氏氣單胞菌的分離鑒定及藥敏特性[J]. 大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 32(5): 563-567.

陳亨利, 莫金龍, 康元環(huán), 等, 2016. 藍(lán)曼龍魚致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 52(6): 115-118.

陳莉莉, 2018. 加州鱸飼料市場(chǎng)最全調(diào)查, 一文看懂如今產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、痛點(diǎn)和契機(jī)[J]. 當(dāng)代水產(chǎn), 43(2): 80-81, 83.

郁歡歡, 薛敏, 韓芳, 等, 2014. 幾種免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)花鱸生長性能、免疫力以及細(xì)菌感染后存活率影響的比較研究[J]. 動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào), 26(8): 2386-2396.

國家特色淡水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系, 2021. 中國淡水鱸產(chǎn)業(yè)發(fā)展報(bào)告[J]. 中國水產(chǎn)(3): 40-48.

孟令緣, 牛沁雅, 廉魯昕, 等, 2021. 基于16S rDNA序列、MALDI-TOF-MS和VITEK的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的鑒定[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 21(10): 197-205.

趙武義, 2018. 加州鱸源維氏氣單胞菌的鑒定與分析[D]. 成都: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué): 4-5.

胡大勝, 2010. 廣西水產(chǎn)養(yǎng)殖主要細(xì)菌病的監(jiān)測(cè)與耐藥性調(diào)查[J]. 中國科技成果(13): 49-51.

胡天野, 吳同壘, 孟慶峰, 等, 2012. 框鏡鯉維氏氣單胞菌的生物學(xué)特性[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 48(8): 18-21.

徐一軻, 孫愉宸, 盛強(qiáng)龍, 等, 2019. 維氏氣單胞菌的、及敲除菌株減毒活疫苗篩選[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 50(2): 186-190.

徐先棟, 李燕華, 王海華, 等, 2018. 臺(tái)灣泥鰍幼魚紅點(diǎn)病病原的分離鑒定及藥敏分析[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 37(4): 522-526.

徐展, 孟慶峰, 王偉利, 等, 2014. 維氏氣單胞菌菌影疫苗的構(gòu)建及其溶菌動(dòng)力學(xué)研究[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 36(12): 982-984.

高彩霞, 任燕, 王慶, 等, 2018. 草魚源致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定及藥物敏感性分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 45(3): 409-415.

黃文明, 王利, 冀國楨, 等, 2013. 胭脂魚維氏氣單胞菌和中間氣單胞菌的鑒定及藥物敏感性[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 32(4): 210-214.

藺凌云, 潘曉藝, 袁雪梅, 等, 2018. 淡水魚蝦細(xì)菌病診斷與防控技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 中國動(dòng)物檢疫, 35(6): 83-88.

熊廣澤, 張焱, 2021. 魚源維氏氣單胞菌的研究進(jìn)展[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué), 67(9): 76-80.

黎炯, 葉星, 盧邁新, 等, 2011. 羅非魚維氏氣單胞菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志, 32(3): 132-136.

鞠安琪, 谷巍, 張海朋, 等, 2018. 屎腸球菌對(duì)鯉魚非特異性免疫酶活性和抗病力的影響[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué), 48(2): 228-233.

ABRAMI L, FIVAZ M, GLAUSER P E,, 2003. Sensitivity of polarized epithelial cells to the pore-forming toxin aerolysin [J]. Infection and Immunity, 71(2): 739-746.

FOYSAL J, MOMTAZ F, ALI H,, 2019. Molecular characterization and interactome analysis of aerolysin () gene from fish pathogen: The pathogenicity inferred from sequence divergence and linked to histidine kinase () [J]. Journal of Fish Diseases, 42(4): 465-475.

GAVíN R, MERINO S, ALTARRIBA M,, 2003. Lateral flagella are required for increased cell adherence, invasion and biofilm formation byspp [J]. FEMS Microbiology Letter, 224(1): 77-83.

HUSSEIN G H G, CHEN M, QI P P,, 2020. Aquaculture industry development, annual price analysis and out-of-season spawning in largemouth bass[J]. Aquaculture, 519: 734901.

KITA-TSUKAMOTO K, OYAIZU H, NANBA K,, 1993. Phylogenetic relationships of marine bacteria, mainly members of the family, determined on the basis of 16S rRNA sequences [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 43(1): 8-19.

LAZADO C C, ZILBERG D, 2018. Pathogenic characteristics ofisolated from the liver of a diseased guppy () [J]. Letters in Applied Microbiology, 67(5): 476-483.

LI T, RAZA S H A, YANG B T,, 2020.infection in commercial freshwater fish: a potential threat to public health [J]. Animals (Basel), 10(4): 608.

MERINO S, RUBIRES X, AGUILAR A,, 1997. The role of flagella and motility in the adherence and invasion to fish cell lines byserogroup O: 34 strains [J]. FEMS Microbiology Letters, 151(2): 213-217.

NAWAZ M, KHAN S A, KHAN A A,, 2010. Detection and characterization of virulence genes and integrons inisolated from catfish [J]. Food Microbiology, 27(3): 327-331.

YANG B T, ZHANG D X, WU T L,, 2019. Maltoporin (LamB protein) contributes to the virulence and adhesion ofTH0426 [J].Journal of Fish Diseases, 42(3): 379-389.

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF PATHOGENICIN

LEI Ning1, HAO Gui-Jie2, HUANG Ai-Xia2, WANG Yu-Chen2, LIN Feng2, SHEN Xiao-Ming3, ZHU Jun-Jie1

(1. College of Life Science, Huzhou University, Huzhou 313000, China; 2. Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture, Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Key Laboratory of Fish Health and Nutrition of Zhejiang Province, Institute of Freshwater Fisheries, Huzhou 313001, China; 3. Deqing Haoyuan Aquatic Seed Industry Co., Ltd., Huzhou 313200, China)

In China,is an important economic freshwater farmed fish species. At present, the healthy development ofaquaculture industry has been affected by many factors, including bacterial diseases.is an important pathogen causing septicemia and ulcer syndrome in freshwater fish. A bacterial strain was isolated and identified from liver of diseasedby morphological, physiological, and biochemical approaches, and 16S rRNA sequence and specific virulence gene analysis. The pathogenicity and drug resistance were analyzed by artificial regression infection test and drug sensitivity test. Results show that the strain was pathogenic, and it contained virulence genes such as,,,,, and. The strain was highly sensitive to 8 antibiotics (ceftriaxone, chloramphenicol, florfenicol, doxycycline, tetracycline, polymyxin, cotrimoxazole, and levofloxacin), moderately sensitive to 6 antibiotics (neomycin, enoxacin, gentamicin, streptomycin, azithromycin, and ciprofloxacin), and was resistance to other 8 antibiotics, as revealed in our drug sensitivity test. The bacterium was pathogenic to, and the median lethal dose was 1.4×106CFU/mL as shown in our artificial regression infection experiment.is a conditional pathogen in aquaculture, and some biological characteristics of this strain were documented, which is beneficial to enrich the basic data of, and provides some scientific basis and reference for the prevention and control of diseases inculture.

;; drug sensitivity test; virulence gene

S917.1

10.11693/hyhz20220200045

*浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目, 2019C02082號(hào); 浙江省科技專項(xiàng), 2021YSZX007號(hào), 2021C02069-2-02號(hào)。雷 寧, 碩士研究生, E-mail: yleining@163.com

朱俊杰, 副教授, E-mail: zhjj@zjhu.edu.cn; 林 鋒, 副研究員, E-mail: wwlinfeng@163.com

2022-02-28,

2022-04-07