萬 紅，趙 釗，梁花蕾，崔海容，劉虎威

（武昌理工學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430223）

表面等離子體共振（Surface plasma resonance，SPR）是一種光學(xué)生物傳感技術(shù)［1］，當(dāng)光從光密介質(zhì)進(jìn)入光疏介質(zhì)時，會發(fā)生反射與折射，而SPR共振角度會隨著反射光折射率的變化而改變。當(dāng)偶聯(lián)在傳感芯片表面的生物分子與其它分子發(fā)生相互作用時，會引起反射光折射率的改變，通過實時監(jiān)測SPR共振角的變化，即可記錄樣品與固定在SPR芯片上的生物識別分子之間的特異性結(jié)合情況［2］。SPR具有無需標(biāo)記樣品，樣品前處理簡單，樣品用量少，檢測靈敏度高，能實時檢測生物分子間的相互作用，并獲得分子間結(jié)合與解離的信息等優(yōu)點［3-4］，因而被廣泛應(yīng)用于藥物篩選［5-6］、生物檢測［7］和食品分析［8］等領(lǐng)域。

構(gòu)建合適的SPR生物傳感界面是提高檢測靈敏度和選擇性的重要途徑。構(gòu)筑SPR芯片需要考慮如下因素［9-12］：（1）根據(jù)生物分子的特性和目標(biāo)分析物的性質(zhì)以及二者間的相互作用機理，功能化修飾SPR芯片表面，以固定生物識別分子；（2）功能化的芯片表面須具有生物相容性，以保持固定分子的生物活性；（3）提高生物識別分子的負(fù)載量，以增加其與目標(biāo)分子特異性反應(yīng)的量；（4）防止芯片表面的非特異性結(jié)合，減少其它分子的干擾。

構(gòu)筑SPR芯片的主要步驟是首先將芯片表面的金功能化修飾，然后通過吸附或化學(xué)偶聯(lián)的方法在金表面固定生物識別分子。生物識別分子與目標(biāo)分子的相互作用是利用分子中特定的點位或片段與目標(biāo)分子進(jìn)行特異性結(jié)合。根據(jù)生物識別分子的分布和空間取向，生物識別分子的固定方法分為非定向固定和定向固定兩種。生物識別分子的非定向固定是指通過化學(xué)偶聯(lián)方法固定在SPR芯片表面的生物識別分子處于隨機分布狀態(tài)，且分子識別片段的取向也是隨機的；生物識別分子的定向固定是指通過一定的化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)，使生物識別分子均勻地固定在SPR芯片表面，且分子識別片段的取向一致。

1 基于化學(xué)偶聯(lián)的非定向固定法

1.1 自組裝單層膜法

自組裝單層膜法（Self-assembled monolayer，SAM）是利用雙官能團分子的一端巰基與金的共價鍵作用，在芯片表面形成有序單分子組裝體的方法。雙官能團分子的另一端通常為羧基官能團，經(jīng)碳二亞胺活化后，可偶聯(lián)生物識別分子［13］。

自組裝單層膜法能在金表面形成高度有序且致密的單分子膜，通過調(diào)節(jié)雙官能團分子碳鏈的長度，可以調(diào)控生物識別分子與目標(biāo)分析物之間相互作用的效果［14］。自組裝單層膜的厚度較薄，其優(yōu)點是對金表面SPR影響較小，但缺點是生物識別分子的負(fù)載量較小，檢測靈敏度受影響。為克服這一問題，Melaine和Kim等人分別利用單鏈/雙鏈DNA［15］、抗原/抗體形成的三明治結(jié)構(gòu)［16］，負(fù)載納米金粒子，從而增強SPR信號。

自組裝單層膜也可使用巰基化的聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）作為自組裝分子。巰基化的聚乙二醇由于具有巰基烷烴的柔性和有序特性，且羥基（—OH）具有親水性，因此能夠有效地固定生物識別分子，被用于構(gòu)筑SPR芯片的有線性PEG6［17］（圖1）、二巰基化PEG（DSPEG2）［18］和羧基功能化的二巰基PEG（S2PEGCOOH）［19］等。

圖1 自組裝膜法固定生物識別分子示意圖［17］Fig．1 Schematic diagram of immobilizing bioreceptor by SAM［17］

為增加表面生物識別分子的負(fù)載量，可使用兩種或多種自組裝分子形成自組裝混合膜，以調(diào)節(jié)膜端基的官能團密度，更多地錨定分子量較大的生物識別分子，從而提高檢測的靈敏度［20-21］。

1.2 多維聚合物膜法

如前所述，SPR芯片表面的自組裝單層膜有序可控，但生物識別分子的負(fù)載量較小。因此，可通過在SPR芯片表面修飾多維聚合物膜來提高生物識別分子的負(fù)載量。一些高分子聚合物由于含有多個活性官能團，這些官能團既能在芯片表面形成穩(wěn)定的薄膜，同時活化后又能偶聯(lián)生物識別分子，因此在SPR芯片制備中得到廣泛的應(yīng)用。

羧甲基化葡聚糖（Carboxymethyl dextran，CMD）常被用于SPR芯片表面形成多維聚合物膜。CMD分子的終端有許多羧基官能團，活化后可以化學(xué)偶聯(lián)生物識別分子。其負(fù)載量比自組裝單層膜高，主要原因是CMD分子的羧基官能團與芯片表面的結(jié)合位點大大增加［22］。He等［23］用羧甲基葡聚糖在芯片表面制備了多維聚合物。經(jīng)EDC/NHS（1-（3-Dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride/NHydroxysuccinimide）活化后，固定蛋白偶合物（卵清蛋白）與抗原。由此制備的SPR傳感芯片可用于檢測生物標(biāo)志物3-硝基酪氨酸，檢測結(jié)果表明SPR生物傳感器的分析性能比酶聯(lián)免疫方法更好。Xia等［24］用CMD聚合物修飾的芯片易于同時共價固定2種生物識別分子，且能高效再生；研究表明采用EDC/NHS活化后固定2種抗體，可同時檢測牛奶和血清中的慶大霉素與三聚氰胺。

由于SPR的感應(yīng)范圍有限，平均穿透深度小于200 nm，靈敏度隨著芯片表面膜厚度的增加呈指數(shù)級下降，聚合物的使用可能會使芯片表面的基質(zhì)層厚度達(dá)200 nm，從而極大地影響了SPR的分析性能［25］。Wang等［26］比較了SAM和CMD功能化芯片的SPR分析性能，發(fā)現(xiàn)SAM功能化芯片具有更高的靈敏度，主要原因是SAM膜更薄，金表面的SPR響應(yīng)信號更強。

聚多巴胺（PDA）薄膜也廣泛應(yīng)用于制備SPR生物傳感器。在弱堿性的水溶液中，多巴胺發(fā)生自發(fā)聚合反應(yīng)，能在各種有機和無機基底表面形成穩(wěn)定的聚多巴胺薄膜。聚多巴胺中的醌基能與生物分子中的胺基或巰基通過邁克爾加成或Schiff堿反應(yīng)形成共價鍵，從而固定生物識別分子。Lee等［27］的研究表明，只需將多巴胺溶液滴加在金表面，多巴胺便可實時聚合，聚多巴胺層的厚度可通過改變沉積時間進(jìn)行控制。此外，端基為胺基的DNA可直接偶聯(lián)到聚多巴胺膜表面，無需添加額外試劑［28］。Toma等［29］在溫和反應(yīng)條件下，在金芯片表面制備了聚多巴胺薄膜，結(jié)果表明在不使用任何偶聯(lián)試劑的條件下，聚多巴胺薄膜表面可共價偶聯(lián)抗體，且抗體偶聯(lián)反應(yīng)速率較快，并可實時調(diào)控（圖2）。

圖2 聚多巴胺固定生物識別分子示意圖［29］Fig．2 Schematic diagram of the PDA immobilization of bioreceptors［29］

與傳統(tǒng)SAM耦合方法相比，將抗體固定到聚多巴胺薄膜可增大生物識別分子的負(fù)載量，原因是薄膜表面結(jié)合位點增加，空間位阻減小，且抑制了EDC/NHS的水解問題［30］。

基于自組裝單層膜法和多維聚合物膜法實現(xiàn)功能化的芯片均可偶聯(lián)DNA、抗體、生物素和蛋白質(zhì)等生物識別分子，但固定的生物識別分子的取向是隨機的，不利于與目標(biāo)分析分子的有效結(jié)合。生物識別分子的定向固定，是使識別分子的取向適合與目標(biāo)分子結(jié)合，從而充分利用芯片表面固定的生物識別分子，提高SPR傳感的靈敏度。此外，影響SPR檢測選擇性的主要因素是檢測樣品中物質(zhì)在芯片表面的非特異性吸附。在定向固定法中，芯片表面往往形成的是單分子層膜，且分子取向一致，增加了特異性反應(yīng)，降低了非特異性吸附，從而提高檢測的選擇性；非定向固定法中，芯片表面往往形成的是多層膜，且分子取向隨機，導(dǎo)致非特異性吸附較強，但檢測的選擇性較低。因此，生物識別分子的定向固定成為研究熱點，也是提高分析靈敏度和選擇性的重要途徑。

2 基于生物識別分子親和性的定向固定法

2.1 利用DNA定向固定生物識別分子

巰基化的單鏈DNA可在SPR芯片的金表面形成自組裝膜，然后與生物分子（如抗體、生物素）標(biāo)記的DNA通過堿基配對互補關(guān)系雜交形成雙鏈DNA，從而固定目標(biāo)生物分子。Ladd等［31］首先在金芯片上用標(biāo)記生物素巰基烷烴形成自組裝膜，然后用親和素偶聯(lián)單鏈DNA，再通過雜交將DNA標(biāo)記的人絨毛膜促性腺激素抗體固定在SPR表面（如圖3A），由此制備的SPR芯片對人絨毛膜促性腺激素的檢出限為0．5 ng/mL。Bombera等［32］設(shè)計并構(gòu)建了一種用于細(xì)胞實時分選的DNA-DNA-抗體SPR生物芯片，研究了定向化的分子和細(xì)胞之間的相互作用。Leroy等［33］采用DNA定向偶聯(lián)抗CD19和抗CD90IgG，分別捕獲B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，使用限制性內(nèi)切酶切割DNA-蛋白偶聯(lián)物，監(jiān)測細(xì)胞的釋放（如圖3B）。

DNA與低分子量抗原偶合物也可用于構(gòu)建SPR生物傳感器，Tort等［34］將類固醇半抗原-DNA偶合物，通過基因雜交偶聯(lián)至SPR芯片表面，實驗結(jié)果表明其對抗血清（As147、As170和As138）有較好的識別作用（如圖3C）。

DNA折紙是指通過長的單鏈DNA支架，與數(shù)百條與之互補配對的短鏈DNA相互配對后，折疊成一定形狀，具有很好的生物相容性的DNA微觀結(jié)構(gòu)。這種DNA微觀結(jié)構(gòu)不僅能定向固定生物識別分子，而且可以形成生物識別分子陣列，大大提高芯片表面的負(fù)載量。利用DNA折紙技術(shù)［35］，將結(jié)合凝血酶的核酸適配體定向固定至DNA微觀結(jié)構(gòu)中，檢測凝血酶的量可低至6．1 nmol（如圖3D）。

圖3 DNA定向構(gòu)建SPR芯片F(xiàn)ig．3 SPR chips constructed by DNA-directed immobilization

2.2 利用蛋白A/G定向固定生物識別分子

蛋白A（Protein A）來源于金黃色葡萄球菌的一個株系，含有多個可與免疫球蛋白（IgG）分子的Fc段特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。蛋白G（Protein G）是從G類鏈球菌中分離出的胞壁蛋白，不僅可結(jié)合IgG的Fc段，還能結(jié)合IgG的Fab段，對于大多數(shù)哺乳動物的IgG有著更高的親和力。在芯片表面先用巰基羧酸自組裝膜，再用EDC/NHS試劑活化羧基，然后通過偶聯(lián)的方法將免疫球蛋白固定在芯片表面，得到的免疫球蛋白的特異位點是隨機分布的。如果活化羧基后，先偶聯(lián)蛋白G［36］，再固定人體生長激素免疫球蛋白，便可實現(xiàn)免疫球蛋白的定向固定，使芯片表面固定的人體生長激素抗體增加2．6倍。為了有效地克服芯片在洗滌過程中抗原/抗體的離解，使用化學(xué)交聯(lián)劑交聯(lián)抗原/抗體后，可使人體生長激素抗體的檢測靈敏度增加3．5倍。Paiva等［37］用二硫化碳作為交聯(lián)劑與蛋白A的胺基相聯(lián)，通過硫元素與金表面形成共價鍵固定蛋白A。另外加入納米金，可以負(fù)載更多的蛋白A。用蛋白A固定IgG能夠使IgG的結(jié)合位點取向一致，二硫化碳還起到防止IgG非特異性吸附的作用（如圖4），可使檢測抗體的量增加2．6倍。

圖4 二硫化碳功能化蛋白A定向固定受體示意圖［37］Fig．4 Schematic diagram of functionalization of protein A with carbon disulfide and direct immobilization of the receptor［37］

值得注意的是，由于蛋白A和蛋白G作用于免疫球蛋白分子特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，將會影響抗原、抗體的相互作用，從而影響檢測的靈敏度。

2.3 利用“點擊化學(xué)”定向固定生物識別分子

“點擊化學(xué)”（Click chemistry）的代表反應(yīng)是由疊氮化物和炔烴作用形成共價鍵。該反應(yīng)條件溫和，特異性高，穩(wěn)定性好，甚至能在活細(xì)胞中進(jìn)行，且能保持生物分子的生物活性。Van't Veer等［38］研究發(fā)現(xiàn)，將疊氮基團引入重鏈抗體分子中，然后在芯片表面引入環(huán)辛炔，通過銅（Ⅰ）催化疊氮化物-炔烴環(huán)發(fā)生加成反應(yīng)后，再將重鏈抗體定向固定在芯片表面，制備的SPR芯片檢測靈敏度可提高10倍以上（見圖5）。為消除催化劑銅（Ⅰ）鹽對生物分子的毒性，避免生物分子因結(jié)構(gòu)改變而失活，可在無銅條件下實現(xiàn)點擊化學(xué)。Trilling等［39］用含疊氮基團的青霉素結(jié)合蛋白質(zhì)（Penicillin-binding proteins，PBPs），通過疊氮化物-炔烴環(huán)加成反應(yīng)，將PBPs均勻地固定在二芐基環(huán)辛炔涂層表面，結(jié)果顯示，定向固定的PBPs仍保持生物活性，與特異性蛋白結(jié)合后SPR信號顯著增強。

圖5 疊氮修飾重鏈抗體分子固定示意圖［38］Fig．5 Schematic diagram of orientation of immobilized VHHs with tailor-made modifications［38］

2.4 利用氨基三乙酸定向固定生物識別分子

氨基三乙酸（Nitrilotriacetic acid，NTA）可用于蛋白質(zhì)定向固定化，其原理是NTA分子和金屬離子（如Ni2+、Co2+、Zn2+、Cu2+）之間形成4配位的螯合物，螯合物中金屬離子的另2個游離態(tài)結(jié)合位點與六組氨酸（Hexa-histidine，His6）標(biāo)記蛋白質(zhì)的2個連續(xù)的組氨酸形成配位鍵。His6是融合重組蛋白純化和檢測的常用標(biāo)簽，可重組到蛋白質(zhì)中的特定位置，因此可在SPR芯片表面均勻地定向固定His6標(biāo)記蛋白，用于分子識別。Wasserberg等［40］重組了帶有His6標(biāo)簽的紅色熒光蛋白（TagRFP），用（His6）-Ni2+∶NTA方法在芯片表面固定TagRFP（圖6）。結(jié)果表明，固定在芯片表面的TagRFP穩(wěn)定性增加了1個數(shù)量級，且所有TagRFP生物活性位點的取向一致。由于蛋白質(zhì)的3D空間結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，帶有1種His6標(biāo)簽的蛋白質(zhì)可能因NTA螯合物錨點較少而不夠穩(wěn)定，無法確保蛋白質(zhì)在表面定向固定。因此，可在蛋白質(zhì)分子中引入多個His6標(biāo)簽，但要注意引入的幾個His6標(biāo)簽必須結(jié)合在特定位置，因此對于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的設(shè)計要求更高。

圖6 NTA定向固定生物受體示意圖［40］Fig．6 Schematic diagram of NTA strategy for oriented immobilization of bioreceptors［40］

為增加蛋白質(zhì)配位復(fù)合物的穩(wěn)定性，His6標(biāo)記蛋白質(zhì)可附著在羧甲基化葡聚糖膜上，并使用交聯(lián)劑固定，使用此方法可獲得穩(wěn)定的高密度定向生物識別分子的SPR芯片。用固定His6標(biāo)記的人碳酸酐酶檢測藥物4-羧基苯磺酰胺，檢出限為14 nmol/L，具有較高靈敏度［41］。

為提高在SPR生物傳感芯片上固定His6標(biāo)記蛋白質(zhì)的均勻性和負(fù)載量，可使用其他NTA復(fù)合物。如將三氨五乙酸硫醇（DPTA）或甲苯二吡咯硫醇（DPM）與形成銅（Ⅱ）的配合物自組裝至SPR金芯片表面，可實現(xiàn)His6標(biāo)記的Janus激酶2（GST-His6-JAK2）的定向固定［42］。實驗結(jié)果表明，與用DPTACu（Ⅱ）定向固定蛋白相比，用DPM-Cu（Ⅱ）配合物定向固定的GST-His6-JAK2蛋白的動力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)均有較好的提升，主要原因是DPM的空間位阻更小。

3 結(jié)論與展望

利用表面化學(xué)原理和納米技術(shù)設(shè)計與制備功能化的芯片，定向固定生物識別分子，是提高SPR生物傳感器檢測靈敏度和選擇性的有效途徑。將來應(yīng)努力開發(fā)通用的定向固定方法，以廣泛應(yīng)用于不同的SPR傳感器。

（1）將氧化石墨烯等2D納米材料應(yīng)用于SPR生物傳感器的研究取得了一些進(jìn)展［43-44］，但局限于增加芯片表面立方體空間，需引入納米金粒子，以增強SPR響應(yīng)。要進(jìn)一步開發(fā)各種2D納米材料，修飾芯片表面，以增加定向固定化生物識別分子的負(fù)載量，提高檢測的靈敏度。

（2）利用蛋白本身的結(jié)構(gòu)特性，開發(fā)出針對特定類別的蛋白固定技術(shù)。如針對常見的帶有組氨酸殘基的蛋白，捕獲鎳離子常用的配體是三齒配體氨基三乙酸［45-46］，有關(guān)二齒配體亞氨基二乙酸的報道并未應(yīng)用于SPR技術(shù)中，而一般認(rèn)為由于二齒配體相對于三齒配體的空間位阻較小，在蛋白固定中可能會表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。

（3）利用生物技術(shù)，如定點突變、從頭設(shè)計、蛋白質(zhì)融合等重組蛋白［47-48］，在生物識別分子表面引入固定化基團，達(dá)到一步定向固定生物識別分子的目的。

總之，SPR技術(shù)的發(fā)展不僅使人們能高效快速地篩選藥物，研究生物分子的相互作用，而且有可能提供更靈敏的環(huán)境污染物監(jiān)測、癌癥標(biāo)志物監(jiān)測和食品安全分析方法。在SPR傳感芯片上有效固定生物分子是一個重要的研究領(lǐng)域。我們相信，隨著各種固定化技術(shù)的完善及新技術(shù)的出現(xiàn)，SPR技術(shù)必將得到更快的發(fā)展，為科學(xué)研究和社會經(jīng)濟發(fā)展提供更強大的分析手段。