許 醒，蔡林峰，張倩楠，楊啟正，梁珊珊，李銘殷，李 翀，楊朝勇，2*

（1．廈門大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361005；2．上海交通大學(xué) 分子醫(yī)學(xué)研究院，上海 200217）

17世紀中葉，荷蘭顯微鏡學(xué)家列文虎克與英國科學(xué)家胡克發(fā)現(xiàn)了細胞，揭開了生命體基本單位—細胞的面紗。由于細胞增殖、分化和代謝等過程受到細胞內(nèi)在生命活動以及周圍微環(huán)境的影響，不同細胞在細胞大小、化學(xué)組成、生物活性、生理響應(yīng)對象以及響應(yīng)時間等方面存在異質(zhì)性。為了解碼各種類型細胞的身份、特征和功能狀態(tài)，單細胞分析應(yīng)運而生，其通過對單個細胞的形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)分析，從而了解不同組織、器官及生命體的特征，探究不同生命活動的發(fā)生過程。單細胞測序是單細胞分析中的重要組成部分，其以細胞內(nèi)的RNA、DNA等核酸分子作為研究對象，利用測序技術(shù)進行結(jié)構(gòu)與序列解析，為細胞異質(zhì)性研究提供可靠、準確的研究手段及觀測視野，為揭示生物發(fā)育規(guī)律、疾病發(fā)生發(fā)展機制等提供了重要的技術(shù)手段［1-2］。2019年，“單細胞多組學(xué)技術(shù)”被Nature Methods評為年度技術(shù)方法；2020年，“空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)”被Nature Methods評為年度技術(shù)方法；2022年，空間多組學(xué)被Nature評為值得關(guān)注的七大技術(shù)之一。至此，單細胞測序分析朝著多維度、空間化方向發(fā)展。本文將圍繞單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組分析，系統(tǒng)討論近幾年單細胞轉(zhuǎn)錄組測序、單細胞多組學(xué)測序及空間轉(zhuǎn)錄組分析的研究進展，并總結(jié)及展望其未來的發(fā)展方向。

1 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）通過對單個細胞內(nèi)的RNA（~10 pg）進行提取及文庫制備，利用高通量測序技術(shù)讀取文庫序列獲得全轉(zhuǎn)錄本信息，以辨別細胞類型、狀態(tài)與功能，闡明細胞異質(zhì)性及進化軌跡等。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序靶標檢測通量高，理論上可實現(xiàn)對單細胞全轉(zhuǎn)錄組的同時測量，提高了對單細胞異質(zhì)性的辨別能力；同時，轉(zhuǎn)錄組不僅繼承了基因組的遺傳信息，還反映了細胞基因選擇性表達的詳細情況，細胞分型準確性高。目前，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序已在腫瘤生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、微生物學(xué)等多個領(lǐng)域的研究中得到廣泛應(yīng)用［3-6］。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序主要流程包括單細胞的分離、單個細胞核酸的提取、微量核酸的擴增與建庫等。根據(jù)文庫類型差異分為基于全長轉(zhuǎn)錄組的文庫構(gòu)建法和基于標簽轉(zhuǎn)錄組的文庫構(gòu)建法。

1.1 基于全長轉(zhuǎn)錄組的文庫構(gòu)建法

該文庫構(gòu)建方法針對全長轉(zhuǎn)錄組，對基因、單核苷酸多態(tài)性、可變剪切體具有高檢測能力，并易于定位來源細胞。2009年，湯富酬課題組首次報道了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序方法［7］。該方法利用末端轉(zhuǎn)移酶將poly（A）短鏈添加至逆轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA上，再通過雜交錨定有聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）引物的poly（T）短鏈完成第二鏈合成，進而進行PCR擴增，首次實現(xiàn)了單細胞維度的基因表達異質(zhì)性研究。Sandberg課題組于2014年發(fā)展的Smart-seq2技術(shù)是目前應(yīng)用最廣的單細胞全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)之一。其利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶同時具有模板轉(zhuǎn)化與末端轉(zhuǎn)移酶活性的特點，在cDNA合成至3′端時在其尾部添加一段特殊序列并以此作為引物序列實現(xiàn)PCR擴增［8］。該課題組于2020年提出了Smart-seq3技術(shù)，在cDNA合成過程中引入獨特分子標記（UMI），通過校正擴增偏差實現(xiàn)了對RNA的準確計數(shù)，提高了基因檢出的靈敏度與準確度［9］。

然而，以上基于離心管的建庫方式存在細胞挑取困難，試劑消耗大，核酸反應(yīng)效率低等問題。與之相比，微流控技術(shù)可提供pL至nL級反應(yīng)體系，與單細胞尺寸相匹配，在提高模板反應(yīng)濃度的同時減少了試劑消耗量，具有高轉(zhuǎn)錄本檢出能力及低成本的優(yōu)勢［10-11］。黃巖誼課題組開發(fā)了一種集成式微流控芯片用于全長scRNA-seq分析，提高了基因表達測量的準確性和靈敏度［12］。商業(yè)化平臺Fluidigm C1系統(tǒng)使用了類似的設(shè)計，兼容Smart-seq2等文庫構(gòu)建方式［13］。Sarma等［14］設(shè)計了一種通過濃度梯度驅(qū)動引起流體擴散進行試劑去除和輸送的微流控平臺，可在同一個腔室中完成Smart-seq2全步驟。然而，以上平臺使用泵/閥結(jié)構(gòu)控制流體運動，需要復(fù)雜的芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計與制作工藝。為了簡化微流控芯片的設(shè)計、制作與操控，增加平臺的普適性，本課題組基于具有離散液滴操控功能的數(shù)字微流控芯片結(jié)合Smart-seq2技術(shù)，構(gòu)筑了自動化單細胞轉(zhuǎn)錄組測序平臺（Digital-RNA-seq，圖1A），實現(xiàn)了快速、高效、靈敏及準確的單細胞RNA檢測［15］。Digital-RNA-seq通過在芯片上構(gòu)筑親-疏水特征結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了單細胞的快速、高效和無損分離；采用納升級反應(yīng)體系及疏水界面增加模板的反應(yīng)濃度，減少核酸吸附，實現(xiàn)了高靈敏的基因檢測；借助均勻的液滴生成和油相隔離的反應(yīng)空間減少加樣偏差及外源污染，提高了測量的準確性。相比傳統(tǒng)離心管方法，該平臺減少了近百倍的試劑消耗量，實現(xiàn)了低成本的單細胞轉(zhuǎn)錄組分析。在此基礎(chǔ)上，本課題組進一步將文庫純化、文庫構(gòu)建等部分集成，實現(xiàn)了“細胞進，文庫出”的一體化操作（Cilo-seq），將文庫檢出率提高了1．4倍［16］。

圖1 基于數(shù)字微流控的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（digital-RNA-seq）［15］（A）；基于配對微流控芯片的高通量單細胞測序（paired-seq）［25］（B）Fig．1 Single-cell transcriptome sequencing based on digital microfluidics（digital-RNA-seq）［15］（A）；high-throughput single-cell sequencing based on paired microfluidic chip（paired-seq）［25］（B）

1.2 基于標簽轉(zhuǎn)錄組的文庫構(gòu)建法

該文庫構(gòu)建方法主要通過在轉(zhuǎn)錄本一端添加標簽標記細胞來源，從而允許高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組平行分析。Yanai課題組于2016年推出CEL-Seq2技術(shù)，利用隨機寡核苷酸鏈在逆轉(zhuǎn)錄步驟為每個單細胞的轉(zhuǎn)錄本標記上獨一無二的細胞編碼與分子編碼，由此可在后續(xù)擴增過程中將上千個細胞的核酸在同一個反應(yīng)池中進行反應(yīng)，大大降低了人力、試劑與測序成本，使單個測序文庫包含大量單細胞的轉(zhuǎn)錄組信息［17］。為了進一步提高單細胞轉(zhuǎn)錄組分析通量，Macosko課題組和Weitz課題組分別發(fā)展了Drop-Seq與Indrops技術(shù)，基于攜帶有細胞編碼與分子編碼的編碼微球，利用液滴微流控芯片在短時間內(nèi)生成大量油包水液滴，同時將單個細胞與單個微球包裹于同一微液滴中，以此實現(xiàn)高通量單細胞的快速分離及對應(yīng)轉(zhuǎn)錄組信息的標記［18-19］。Shalek課題組和郭國驥課題組將該技術(shù)拓展至微陣列體系中，分別開發(fā)了Seq-Well和Microwell-seq平臺，在微孔中實現(xiàn)了單個細胞與微球的配對、mRNA捕獲、編碼及逆轉(zhuǎn)錄，通過測序技術(shù)，獲得了成千上萬個單細胞的轉(zhuǎn)錄組表達信息［20-21］。此類方法極大提高了單細胞的分析通量，進一步降低了試劑用量和分析成本，推動了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的產(chǎn)業(yè)化進程，如10×Genomics公司的ChromiumTM液滴微流控平臺、BD公司推出的RhapsodyTMSingle-Cell Analysis System等。然而，大多數(shù)方法由于單細胞和編碼微球的包裹基于泊松分布，許多細胞無法與微球成功配對從而造成信息丟失，導(dǎo)致細胞利用率偏低。

為了克服泊松分布，樊榮課題組開發(fā)了一種集成的介電電泳（DEP）-捕獲-納微孔轉(zhuǎn)移方法（dTNT），通過DEP輔助捕獲細胞于微陣列中（捕獲效率達91．84%），然后將整個裝置翻轉(zhuǎn)并改變DEP的方向，使捕獲于DEP陣列中的單細胞落入與其對應(yīng)的大孔徑微陣列中（細胞轉(zhuǎn)移效率為82%），以實現(xiàn)單細胞與單微球在微孔中的高效配對［22］?；诒瞄y控制結(jié)構(gòu)的微流控芯片提供了另一種提高細胞利用率的方法，可實現(xiàn)稀有樣本包括循環(huán)腫瘤細胞、腸類器官的單細胞分析［23-24］。本課題組開發(fā)了Paired-seq技術(shù)（圖1B），通過發(fā)展基于差異流阻原理的單細胞/單微珠操控微流控芯片，實現(xiàn)了單細胞/單微球的高效快速捕獲，成功突破了因泊松分布導(dǎo)致的細胞利用率低的限制，在稀有細胞分析方面具有明顯優(yōu)勢（細胞利用率＞95%）；同時Paired-seq利用泵閥操控結(jié)構(gòu)移除游離RNA以降低背景干擾，并通過皮升級反應(yīng)腔體增加單細胞mRNA的捕獲能力，大大提高了轉(zhuǎn)錄組的基因檢出效率［25］。Paired-seq的分析通量在千級水平，為了提高樣品分析通量，本課題組進一步發(fā)展了一種協(xié)同尺寸排阻和局部準靜態(tài)動力學(xué)的雙層微孔芯片平臺（Well-Paired-seq），用于超高通量的scRNA-seq分析，一個芯片可以分析超過10萬個細胞。通過尺寸排阻原理允許在細胞捕獲微孔和微球捕獲微孔分別捕獲一個細胞和一個微球，并通過準靜態(tài)流體力學(xué)原理確保被捕獲的細胞不被沖洗出去，從而實現(xiàn)細胞的累積捕獲和有效的緩沖交換［26］。Well-Paired-seq保證了高密度的單細胞/微球配對，實現(xiàn)了優(yōu)異的細胞捕獲效率（~91%）、細胞/微球配對效率（~82%）和細胞游離RNA去除效率。Well-Paired-seq的超高通量分析能力、高效細胞捕獲效率和高游離RNA去除效率等優(yōu)勢在細胞圖譜繪制、細胞異質(zhì)性分析、稀有細胞亞群分析中具有重要的應(yīng)用價值。

細胞原位編碼技術(shù)是另一類基于標簽轉(zhuǎn)錄組的文庫構(gòu)建技術(shù)。該方法無需利用微液滴及微陣列對細胞進行分隔，而是將細胞本身作為單獨的反應(yīng)器。同時，該方法無需使用編碼微球，通過組合拆分方法即可對大量單細胞進行細胞及分子編碼。Shendure課題組和Seelig課題組將大量細胞分配至96或384孔板中，利用含有編碼序列的引物對cDNA進行標記，其后將所有細胞回收并重新分配至含有新編碼序列的引物的96或384孔板中，對cDNA進行下一輪標記，然后重復(fù)組合-拆分過程［27-28］。此時，編碼容量隨著組合-拆分次數(shù)的增加呈指數(shù)型增長。因此，該方法的細胞分析通量極大，但由于需要不斷地進行拆分混合操作，文庫構(gòu)建存在繁瑣性與復(fù)雜性。近期，Bock課題組將細胞原位編碼技術(shù)與液滴微流控技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了單細胞組合流體索引技術(shù)scifi-RNA-seq［29］。該方法通過在384孔板中將透化的細胞（核）隨機等分，使用孔板中的預(yù)標第一輪條形碼實現(xiàn)cDNA的合成與標記。然后，將含有預(yù)索引cDNA的細胞（核）隨機混合，使用具有高度過載的標準微流控液滴發(fā)生器進行封裝，使大多數(shù)液滴包含多個細胞（核）。在這些過載的液滴中，轉(zhuǎn)錄本用液滴內(nèi)第二輪條形碼進行標記。因此，在同一分裂池中的所有細胞共享第一輪條形碼，在同一液滴中的所有細胞共享第二輪條形碼，兩種條形碼的組合可唯一編碼來自同一單個細胞的轉(zhuǎn)錄本。與傳統(tǒng)多輪組合拆分技術(shù)相比，scifi-RNA-seq更為簡便高效；與單一液滴微流控方法相比，scifi-RNA-seq允許每個液滴內(nèi)包裹多個細胞，大大提高了分析細胞通量，避免了傳統(tǒng)液滴方法因包裹多個細胞導(dǎo)致的錯誤。

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序主要朝著3個方向發(fā)展：（1）更高基因檢出率；（2）更高通量；（3）更高細胞利用率。然而，目前仍面臨以下兩大問題：基于全長轉(zhuǎn)錄組的文庫構(gòu)建法相對于基于標簽轉(zhuǎn)錄組的文庫構(gòu)建法基因檢測能力更高，但是犧牲了高通量分析的能力，高基因檢出率與高分析通量難以兼得；超高通量與高細胞利用率（尤其是針對稀有細胞）的分析仍難以平衡，靈活性強、樣品適用范圍廣的操縱平臺仍有待進一步開發(fā)。

2 單細胞多組學(xué)測序分析

單個細胞的表型往往受到不同分子（如DNA、RNA及蛋白質(zhì)）的共同調(diào)控，單細胞單組學(xué)分析難以提供全面的細胞異質(zhì)性信息。與之相比，單細胞多組學(xué)分析可以從多種分子層面揭示細胞特性，同時將不同組學(xué)信息直接關(guān)聯(lián)，更加深入地研究單細胞狀態(tài)、功能與生長過程及其分子調(diào)節(jié)機制［30］。目前，單細胞轉(zhuǎn)錄組及其與其它組學(xué)的聯(lián)合分析在技術(shù)開發(fā)與整合分析方面已取得了初步進展。

2.1 單細胞轉(zhuǎn)錄組和基因組聯(lián)合分析

基因組是決定細胞內(nèi)遺傳變異分子機制的源代碼，而轉(zhuǎn)錄組決定了細胞的特定功能?；蚪M和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析通過探究DNA拷貝數(shù)、DNA編碼區(qū)與非編碼區(qū)如何決定轉(zhuǎn)錄組表達水平，從而建立基因組和轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)性，并闡述選擇性表達分子作用機制，如RNA編輯、調(diào)控變異和等位基因特異性表達［31］。另外，對不同細胞的基因組和轉(zhuǎn)錄組進行聯(lián)合分析，可進一步區(qū)分遺傳亞克隆，同時進行譜系示蹤。單細胞轉(zhuǎn)錄組和基因組的聯(lián)合分析步驟主要包括單細胞分離、細胞裂解、DNA/RNA分離、基因組/轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建。

DR-seq和G&T-seq是單細胞DNA和RNA平行分析的開創(chuàng)性工作［32-33］。DR-seq在挑取并裂解單細胞后，mRNA經(jīng)測序適配子（Ad-1x）進行反轉(zhuǎn)錄；接著以適配子（Ad-2）為引物，進行cDNA與基因組DNA的線性預(yù)擴增；之后將產(chǎn)物分成兩個部分，分別用于MALBAC全基因組文庫構(gòu)建及CEL-seq轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建。DR-seq避免了DNA和RNA的物理分離，減少了核酸的損失及操作繁瑣度，但易造成DNA與RNA間的相互污染。G&T-seq利用寡聚poly（T）包被的磁珠從細胞裂解液中物理分離含poly（A）尾的mRNA，接著對DNA和mRNA分別進行MDA基因組文庫構(gòu)建和Smart-seq2轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建。這種單細胞DNA/RNA分離方式可適用于多種下游建庫方法，亦可將所獲得的DNA用于甲基化組研究。然而由于該方法針對poly（A）尾mRNA，難以應(yīng)用于非編碼RNA的測量。湯富酬課題組發(fā)展的ScTrio-seq采用溫和裂解法，在保持細胞核完整的同時裂解細胞膜以獲得所有胞質(zhì)RNA，通過移取上清液實現(xiàn)RNA/細胞核的分離，并將細胞核內(nèi)DNA用于全基因組和甲基化組的同時分析［34］。然而，為了在移取上清液的過程中避免細胞核的不慎吸取，該方法保留了部分上清液，造成RNA的損失。為了提高RNA的回收量，SIDR-seq利用抗體修飾磁珠標記單個細胞，然后采用低滲裂解策略在細胞質(zhì)膜上進行穿孔以釋放RNA，并通過磁分離方式實現(xiàn)RNA/細胞核的分離，允許不同類型的下游文庫構(gòu)建［34］。

然而，以上方法均局限于細胞的分析通量。為了解決這一問題，Shendure課題組采用組合拆分策略實現(xiàn)了高通量單細胞基因組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析（sci-L3，圖2A）［36］。細胞被固定及核小體剝離后，分散至多孔板中；在每個孔板中，對細胞基因組進行基于Tn5酶的片段化及插入反應(yīng)，對轉(zhuǎn)錄組進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，通過Tn5插入引物及逆轉(zhuǎn)錄引物分別對細胞的基因組及轉(zhuǎn)錄組標記第一輪編碼；將所有細胞混合，重新隨機拆分至孔板中，通過連接技術(shù)添加包含有T7啟動子的第二輪編碼；將所有細胞重新拆分，并進行間隙擴展形成雙鏈T7啟動子，隨后經(jīng)過體外轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄和第二鏈合成，添加第三輪編碼。同一個細胞內(nèi)的RNA與DNA共享相同的細胞編碼，通過測序數(shù)據(jù)中不同的文庫結(jié)構(gòu)區(qū)分RNA/DNA來源，最終實現(xiàn)高通量單細胞RNA/DNA的聯(lián)合分析。然而，該方法的基因組覆蓋率只有20%，因此集高通量、高覆蓋率于一體的單細胞基因組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析方法仍有待開發(fā)。

圖2 高通量單細胞基因組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合測序（sci-L3）［36］（A）；高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)聯(lián)合測序（multi-Paired-seq）［43］（B）；高通量單細胞染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析（SNARE-seq）［47］（C）Fig．2 High-throughput single-cell genome and transcriptome sequencing（sci-L3）［36］（A）；high-throughput single-cell simultaneous transcriptome and proteins sequencing（multi-Paired-seq）［43］（B）；high-throughput single-cell chromatin accessibility and transcriptome sequencing（SNARE-seq）［47］（C）

2.2 單細胞轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組聯(lián)合分析

蛋白質(zhì)作為表型的直接輸出者，直接反映細胞當(dāng)下的生理狀態(tài)和細胞功能。轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的聯(lián)合測量有助于解釋轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性如何轉(zhuǎn)化為功能表型多樣性，深入理解轉(zhuǎn)錄/翻譯后修飾過程；同時有助于揭示RNA層面無法區(qū)分的表型差異，并探討特定細胞亞型的基因表達網(wǎng)絡(luò)和功能調(diào)控類型。

基于熒光探針雜交或?qū)崟r定量熒光PCR的傳統(tǒng)RNA/蛋白測量法由于受到熒光光譜重疊和引物種類限制，靶標檢測及細胞分析通量有限［37-38］?；谖⒘骺丶夹g(shù)和高通量測序技術(shù)的CITE-seq和REAP-seq有效解決了這一問題［39-40］。該類方法利用含有抗體編碼及poly（A）的DNA序列標記并偶聯(lián)特定抗體，從而將蛋白信息轉(zhuǎn)化為核酸信息；接著借助Drop-seq及10×Genomics技術(shù)平臺在標記抗體孵育細胞后將單個細胞及編碼微球共包裹于液滴中，細胞裂解所釋放的mRNA和標記抗體DNA在堿基互補配對原則下被編碼微球捕獲。通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得帶有細胞編碼、分子編碼的cDNA與標記抗體DNA，對所有產(chǎn)物進行擴增與測序，首次實現(xiàn)了成千上萬個單細胞轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)的聯(lián)合分析，不僅提高了分析通量，且可用于低豐度蛋白檢測。在此基礎(chǔ)上，Abate課題組將DNA標記抗體更替為靶向特定蛋白的核酸適體，減少了抗體使用量并降低了成本［41］。Smibert課題組進一步將該類方法與T細胞/B細胞受體、細胞標簽等分析結(jié)合，拓展了單細胞領(lǐng)域的多模態(tài)分析［42］。為了提高單細胞利用率，減少泊松分布帶來的細胞損失，本課題組結(jié)合抗體編碼與Paired-seq技術(shù)［25］發(fā)展了高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)聯(lián)合測序平臺（multi-Paired-seq，圖2B）［43］。該平臺在標記抗體孵育細胞后將單個細胞通入微流控芯片，基于差異流阻原理進行單細胞/單微球的順序捕獲與配對；接著利用含poly（T）的編碼微球捕獲細胞裂解釋放的mRNA及標記抗體DNA，通過逆轉(zhuǎn)錄、擴增、建庫及測序構(gòu)建單細胞轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)的表達矩陣。multi-Paired-seq證實了其在細胞利用水平、蛋白質(zhì)檢測準確性等方面的優(yōu)越性，并成功揭示了單細胞在mRNA與對應(yīng)蛋白間的表達差異性。

然而以上方法均局限于細胞膜蛋白的分析。為了實現(xiàn)細胞膜內(nèi)蛋白的聯(lián)合測量，Mulder課題組將人工合成的標記RNA與抗體偶聯(lián)，令其進入固定后的細胞后于原位與磷酸化蛋白結(jié)合，并基于CELseq技術(shù)為每一個細胞的RNA及標記抗體的合成RNA進行編碼、擴增與測序，最終實現(xiàn)了單細胞mRNA及膜內(nèi)磷酸化蛋白的聯(lián)合分析［44］。因此，當(dāng)前的單細胞轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)聯(lián)合分析正朝著高通量、多模態(tài)方向發(fā)展。然而，DNA/RNA標記抗體偶聯(lián)效率有限，制備工藝繁瑣，商品化的DNA標記抗體價格昂貴，可替代的核酸適體種類有限，亟需開發(fā)高效便捷的蛋白標記方法以提高單細胞轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析的普適性與廣泛性。

2.3 單細胞轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳組聯(lián)合分析

細胞內(nèi)表觀遺傳標記變化廣泛，如DNA甲基化修飾、組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、染色質(zhì)可及性等，其通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與構(gòu)象促進/抑制轉(zhuǎn)錄組表達。因此，對轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組進行聯(lián)合分析可以解析染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與構(gòu)象變化對細胞基因表達的可塑性，并構(gòu)建細胞表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示基因表達調(diào)控機制；同時，二者的同時分析可幫助鑒別細胞發(fā)育和疾病發(fā)展過程中的特殊標記并實現(xiàn)遺傳譜系示蹤。

染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合檢測為揭示單個細胞的基因調(diào)控機制提供了強有力的工具。Cao等基于組合拆分策略發(fā)展了Sci-CAR技術(shù)，通過將細胞核隨機分配于多孔板中并依次進行原位逆轉(zhuǎn)錄與Tn5酶打斷標記，為RNA文庫及染色質(zhì)可及性文庫添加第一輪編碼；接著將所有細胞核合并并重新分配于多孔板中，對其進行裂解后將產(chǎn)物分成兩部分，在PCR過程中添加第二輪編碼；由于來自同一細胞的RNA文庫及染色質(zhì)可及性文庫擁有相同編碼，因此可關(guān)聯(lián)同一單細胞的轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性并作聯(lián)合分析［45］。為了進一步提高分析通量，Zhu等在Sci-CAR的基礎(chǔ)上，增加了三輪基于連接反應(yīng)的編碼，將單細胞分析通量提高至1×107［46］。為了提高分析靈敏度并減少復(fù)雜操作，Chen等提出了SNARE-seq（圖2C），通過在透化的細胞核內(nèi)進行Tn5酶標記反應(yīng)并引入與標簽適配子互補的含有poly（A）的夾板序列作為介導(dǎo)，利用液滴微流控技術(shù)將單個細胞核與編碼微球包裹于同一液滴中，使編碼微球可同時捕獲夾板序列和mRNA，并利用測序技術(shù)進行染色質(zhì)可及性與轉(zhuǎn)錄組信息讀?。?7］。相比Sci-CAR，SNARE-seq多檢測到了4~5倍的可及DNA。Greenleaf課題組使用Cy5標記DNA偶聯(lián)的綠色熒光蛋白（GFP）抗體對HEK293細胞表達的核定位GFP進行染色，然后基于10×Genomics液滴微流控平臺生成單細胞染色質(zhì)可及性文庫和轉(zhuǎn)錄組文庫，通過一次測序即實現(xiàn)了對內(nèi)源性核蛋白豐度、染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組的定量分析［48］。然而以上方法均基于細胞核進行，犧牲了細胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄本；此外均將產(chǎn)物分成兩部分以進行染色質(zhì)可及性文庫與轉(zhuǎn)錄組文庫的獨立制備，導(dǎo)致了一半信息的丟失。因此，基于全細胞水平的染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組文庫集中構(gòu)建方法仍有待開發(fā)。

單細胞DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析可鑒別突變產(chǎn)生的遺傳譜系，全面揭示細胞間的異質(zhì)性，同時探討DNA甲基化修飾對基因表達的調(diào)控規(guī)律。scM&T-seq通過流式細胞儀分選單個細胞，然后利用oligo-dT磁珠對細胞內(nèi)的DNA及RNA進行物理分離，并對其分別進行甲基化文庫（scRRBS）及轉(zhuǎn)錄組文庫（Smart-seq2）構(gòu)建［49］。同年報道的scMT-seq利用相似的方法對單個細胞中的DNA及RNA進行分離，并分別進行全基因組水平的甲基化文庫（scWGBS）和轉(zhuǎn)錄組文庫（Smart-seq2）構(gòu)建［50］。然而，以上兩種方法易在DNA/RNA的物理分離過程中造成核酸損失。為了解決這一問題，Luo等發(fā)展了單管操作snmCT-seq技術(shù)，將單個細胞分選至384孔板，在逆轉(zhuǎn)錄和cDNA擴增過程中用5mC-dCTP代替dCTP，因此cDNA鏈上全部的C堿基均為甲基化的；隨后進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，發(fā)生C＞T轉(zhuǎn)變。而gDNA中少量胞嘧啶是甲基化的，其他胞嘧啶都是未甲基化的，因此可通過測序進行RNA及gDNA來源序列區(qū)分，從而實現(xiàn)單細胞轉(zhuǎn)錄組和甲基化組的聯(lián)合分析［51］。然而該方法未事先對GC區(qū)域進行富集，在測量甲基化位點時需加大測序深度在全基因組范圍內(nèi)搜尋，成本昂貴。

為了進一步增加單細胞的多模態(tài)分析，構(gòu)建多維表觀遺傳調(diào)控圖譜，scNMT-seq和scChaRM-seq在DNA/RNA分離后，引入甲基轉(zhuǎn)移酶標記可及的DNA，僅使開放染色質(zhì)上GCH位點未甲基化的胞嘧啶全部甲基化，其他位置的甲基化狀態(tài)保持不變，通過比對GpC和CpG位點同時辨別單細胞染色質(zhì)可及性區(qū)域和DNA甲基化修飾［52-53］。RNA部分用于構(gòu)建scRNA-seq文庫，從而實現(xiàn)單細胞甲基化、染色質(zhì)可及性及轉(zhuǎn)錄組三組學(xué)的聯(lián)合分析。然而，目前涉及甲基化的單細胞多組學(xué)分析由于操作步驟較為繁瑣，難以利用液滴微流控或組合拆分策略提高分析通量，因此高通量、高靈敏的多維表觀遺傳組與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析方法開發(fā)是該領(lǐng)域未來的發(fā)展方向。

3 空間轉(zhuǎn)錄組分析

在單細胞轉(zhuǎn)錄組測序中，單細胞的獲取依賴于組織解離，因此丟失了細胞的空間信息?？臻g轉(zhuǎn)錄組技術(shù)是結(jié)合成像、生物標記、測序及生物信息學(xué)等工具對組織切片的基因表達進行空間定位的一項技術(shù)，可揭示各細胞類型在組織中的空間分布、各細胞群體間的相互作用以及繪制不同組織區(qū)域的基因表達圖譜，對于理解疾病和癌癥的發(fā)生機制具有深遠的應(yīng)用價值［54-55］。當(dāng)前的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)主要分為激光顯微切割、熒光原位雜交、熒光原位測序以及原位捕獲技術(shù)四大類。

3.1 激光顯微切割法

結(jié)合二代測序技術(shù)的激光顯微切割法是空間轉(zhuǎn)錄組研究的有力工具。我國中科院景乃禾、韓敬東和彭廣敦課題組發(fā)展了Geo-seq，利用激光顯微切割直接分離組織中特定位點的細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序，以充分獲得組織中各位點的全轉(zhuǎn)錄組信息［56］。為了進一步實現(xiàn)單細胞分辨率的測量，Nichterwitz等［57］開發(fā)的LCM-seq將激光顯微鏡切割與Smart-seq2結(jié)合，實現(xiàn)了單細胞水平的空間轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)合二代測序技術(shù)的激光顯微切割法在稀有組織或部分降解組織樣本分析中具有優(yōu)勢，然而面臨細胞形態(tài)破壞、空間分辨率有限、細胞逐個切割分離耗時長等問題。

3.2 熒光原位雜交法

熒光原位雜交法利用標記的熒光探針確定組織或細胞中的RNA/DNA豐度，并逐漸發(fā)展至單分子分辨水平。傳統(tǒng)的單分子熒光雜交技術(shù)（smFISH）受到熒光光譜重疊限制，只能檢測3~4種目標RNA。組合標記技術(shù)通過多種熒光標記的組合可有效提高熒光原位雜交通量。蔡龍課題組發(fā)展的seqFISH技術(shù)，在每輪雜交中利用24個標記有單一顏色的FISH探針與每個轉(zhuǎn)錄本雜交；成像后將探針剝離，在下一輪的雜交中使用擁有相同序列但標記不同熒光團的探針與相同的靶標雜交［58］。通過連續(xù)幾輪雜交、成像和探針剝離，參與每一輪雜交的不同熒光排序形成了每個轉(zhuǎn)錄本的獨特條形碼。利用F種熒光團數(shù)目，經(jīng)過N輪雜交后，seqFISH可對F×N種轉(zhuǎn)錄本進行條形碼編碼，提高了靶標檢測通量。然而該方法存在因熒光信號的非特異性雜交引入的潛在錯誤率，這種錯誤隨順序雜交而累積，因此對基因表達鑒定的準確性提出了重大挑戰(zhàn)。為了降低潛在錯誤率，莊小威課題組發(fā)展了MERFISH技術(shù)，應(yīng)用于RNA、染色質(zhì)DNA三維結(jié)構(gòu)等靶標測量［59-61］。在MERFISH中，每種RNA被設(shè)計與192個編碼探針雜交，該編碼探針由一個靶向序列與兩個讀出熒光探針組成。在每一輪雜交中，通過系列的熒光探針靶向靶標RNA并讀取熒光信號，產(chǎn)生的信號在相應(yīng)的一輪中記為“1”，無熒光信號的一輪記為“0”；經(jīng)過N輪雜交后，每個位點可生成由N個二進制編碼所組成的條形碼，通過與所設(shè)計的靶標條形碼比對，獲得該位點的具體靶標RNA信息。同時，MERFISH設(shè)計了一種糾錯編碼策略，通過設(shè)定二進制位編碼的最小漢明距離以選擇相差更明顯的編碼，在遇到1個熒光標記識別錯誤時可通過人為修改回歸正確的編碼標記，提高了轉(zhuǎn)錄本檢測的準確性。

為了進一步提高RNA的檢測通量，蔡龍課題組發(fā)展了升級版seqFISH技術(shù)（intron seqFISH）［62-63］。在該技術(shù)中，所設(shè)計的探針由一個靶向靶標基因內(nèi)含子的特異性序列和4個延伸序列組成，每一段延伸序列可與對應(yīng)的讀出探針雜交成像。在每一輪成像中采用3組標記有不同熒光團的探針，通過對4個序列雜交的疊加圖像進行數(shù)據(jù)處理，可以在單輪中獲得12個偽彩色的圖像。通過5輪雜交（另一輪進行誤差修正），intron seqFISH可解碼10 421種轉(zhuǎn)錄本。盡管具有高靶標檢測通量，但該方法需對樣品進行數(shù)十輪的雜交反應(yīng)，步驟復(fù)雜、成本高。為了減少雜交次數(shù)，李景虹課題組發(fā)展了基于調(diào)控核酸雜交熱力學(xué)的DNA序列編碼的熒光標記技術(shù)（SeqEA，圖3A）［64］。SeqEA利用含有識別單元（R）和編碼單元（B1、B2．．．．）的編碼鎖式探針，在R識別靶標RNA后引發(fā)滾環(huán)擴增（RCA）反應(yīng)，產(chǎn)生一個具有幾百個與鎖式探針序列互補DNA的單鏈產(chǎn)物，并通過與熒光標記的檢測探針P1和P2雜交實現(xiàn)成像。通過熱力學(xué)計算指導(dǎo)的編碼模塊B1序列能夠精確調(diào)控B1-P1雜交鏈的雜交效率，從而調(diào)控結(jié)合到RCA產(chǎn)物的P1數(shù)量，并利用所產(chǎn)生的熒光信號差異對不同轉(zhuǎn)錄本進行熒光編碼。該方法利用DNA序列作為高密度的信息存儲載體，具有可編程、模塊化及分子水平編碼穩(wěn)定等特點，減少了熒光探針使用數(shù)目及雜交次數(shù)，可實現(xiàn)高通量、易操作的單分子、單核苷酸分辨率的轉(zhuǎn)錄本空間分析。綜上所述，現(xiàn)有的熒光原位雜交法在空間分辨率及靶標檢測通量上具有優(yōu)勢，但其缺點在于需要合成大量熒光探針，昂貴耗時，且僅能對已知的靶標轉(zhuǎn)錄本進行測量。

3.3 熒光原位測序法

熒光原位測序法利用單堿基特異性熒光雜交和DNA連接反應(yīng)對組織中已知或未知轉(zhuǎn)錄本的序列進行原位測定?？聵s秦等發(fā)展的原位測序（ISS）技術(shù)將細胞固定透化后，在原位逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA上雜交一個含有DNA標簽（或帶有幾個堿基缺口）的鎖式探針，并利用DNA聚合和連接反應(yīng)填充間隙，通過RCA反應(yīng)在細胞內(nèi)產(chǎn)生高密度的DNA納米球；利用標記有獨特?zé)晒獾暮怂崽结樑c待測序列雜交，通過邊連接邊測序策略讀取DNA標簽（或待測轉(zhuǎn)錄本）的具體序列［65］。2016年Cartana公司正式將該技術(shù)商品化。該方法雖首次實現(xiàn)了待測轉(zhuǎn)錄本的原位測序，但僅對靶標位點的已知序列進行測定。Church課題組發(fā)展的FISSEQ技術(shù)，利用隨機引物產(chǎn)生cDNA后通過單鏈DNA環(huán)化酶對cDNA進行環(huán)化，經(jīng)RCA信號放大后對轉(zhuǎn)錄本本身進行測序以獲取轉(zhuǎn)錄本序列信息，從而實現(xiàn)對未知靶標的測量［66，76］。然而FISSEQ的測序結(jié)果中rRNA含量高（40%~80%），可測得的mRNA種類少（~200種）；同時FISSEQ產(chǎn)生的讀長較短（5~30 bp），難以充分揭示單細胞間基因表達的差異。為了增加測序讀長，同時提高成像分辨率，Church課題組進一步發(fā)展了Exseq技術(shù)（圖3B）［67］。該技術(shù)通過增加一輪非原位的經(jīng)典二代測序獲得全長的轉(zhuǎn)錄組信息，同時與原位測序數(shù)據(jù)（作為空間碼）進行匹配，成功獲得長讀長轉(zhuǎn)錄組的空間位置信息；此外，Exseq結(jié)合擴展顯微鏡技術(shù)將生物大分子、小分子等交聯(lián)到可吸水放大的丙烯酰胺凝膠上，通過組織吸水放大（~4倍放大）減少了成像信號的堆積干擾，實現(xiàn)了納米尺度的RNA原位測序分析。整體而言，盡管熒光原位測序在對未知靶標的測量及在空間分辨率上具有優(yōu)勢，但其轉(zhuǎn)錄本檢測效率低、測序讀長短、圖像處理復(fù)雜等問題仍有待進一步解決，同時需要整合算法分析尋找細胞邊界以確定RNA分子歸屬的細胞。

3.4 原位捕獲技術(shù)

原位捕獲技術(shù)的核心是利用具有空間位置信息的DNA標簽引物捕獲并標記轉(zhuǎn)錄本的空間位置。近幾年原位捕獲技術(shù)發(fā)展迅猛，并朝著提高空間分辨率及空間多組學(xué)聯(lián)合分析兩個方向發(fā)展。2016年St?hl課題組首次提出了原位捕獲技術(shù)（ST）［68］。ST將含有空間編碼、分子編碼的mRNA特異捕獲引物簇固定于載玻片表面以制備空間編碼玻片；接著將組織切片貼于空間編碼玻片，并對其進行固定、染色與成像；利用玻片上的引物捕獲經(jīng)透化后的組織釋放的mRNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄過程生成含有空間編碼的cDNA，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組文庫制備、高通量測序與分析，將轉(zhuǎn)錄組序列映射至原空間位置，實現(xiàn)高覆蓋度的組織空間轉(zhuǎn)錄組測量分析。之后，ST技術(shù)被成功轉(zhuǎn)化為商品化平臺（10×Genomics Visium）。雖然該方法分析面積大（6．5 mm×6．5 mm），但需要將大量DNA空間編碼探針固定于載玻片表面，修飾成本高，且空間分辨率有限（55 μm/編碼點陣），難以達到單細胞水平。為了進一步提高空間分辨率，Rodriques等用編碼微球代替ST的空間點陣列，發(fā)展了Slide-seq技術(shù)［69］。Slide-seq將空間編碼、分子編碼與捕獲序列修飾于編碼微球上，并將微球緊密堆積在玻璃一側(cè)形成單層結(jié)構(gòu)。每個微球的空間編碼不同，可采用SOLiD技術(shù)進行空間編碼的解碼。由于微球的直徑為10 μm，與單個細胞的尺寸相近，因此Slide-seq方法的空間分辨率可達10 μm。Vickovic等［70］發(fā)展的高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組（HDST）通過使用2 μm編碼微球并結(jié)合順序雜交策略進行微球解碼，將分辨率提高至2 μm水平。李俊熙課題組發(fā)展了Seq-scope技術(shù)，基于Illumina測序芯片構(gòu)建空間編碼陣列后，對組織的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)進行解析，將空間分辨率提高至1 μm水平［71］。我國華大基因也推出了Stereo-seq技術(shù)，利用自組裝的DNA納米球制備空間編碼陣列，進一步將空間分辨率提高至220 nm，并且可分析的組織面積達到42．25 cm2，遠高于其他技術(shù)［72］。

在空間多組學(xué)研究方面，樊榮課題組發(fā)展的DBiT-seq技術(shù)開創(chuàng)了先河（圖3C）［73］。不同于利用空間陣列或微（納）球捕獲釋放的mRNA，DBiT-seq利用微流控技術(shù)對組織細胞進行原位的空間編碼標記，實現(xiàn)了空間轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)的聯(lián)合測量。以甲醛固定的組織玻片為起始材料，將其與識別目標蛋白的DNA標簽修飾抗體（ADT）混合物共孵育；接著將含有50個平行微通道的微流體芯片放置在組織玻片上，以引入第一組DNA條碼（A1~A50），其通過oligo-dT結(jié)合mRNA或ADT的poly（A）尾部；原位逆轉(zhuǎn)錄后，將與第一個芯片通道垂直的微流控芯片放置在組織載玻片上，以引入第二個DNA條形碼（B1~B50），使其與含有A條形碼的cDNA連接，從而生成AiBj（i=1~50，j=1~50）數(shù)組。從組織中提取cDNA，并通過PCR擴增制備測序文庫，通過識別cDNA及抗體DNA標簽上連接的空間編碼AiBj重建空間表達圖。依照類似的方法，該課題組進一步將該方法拓展至空間分辨的染色質(zhì)可及性（spatial-ATAC-seq）及組蛋白修飾（Spatial-CUT&Tag）研究，有望實現(xiàn)表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)等多種組學(xué)的聯(lián)合分析［74-75］。

圖3 基于調(diào)控核酸雜交熱力學(xué)的DNA序列編碼的熒光標記技術(shù)（SeqEA）［64］（A）；納米級分辨率的完整組織RNA原位測序技術(shù)（Exseq）［67］（B）；基于確定性標記的空間轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)聯(lián)合測序技術(shù)（DBiT-seq）［73］（C）Fig．3 DNA-sequence-encoded rolling circle amplicon for single-cell RNA imaging based on nucleic acid hybridization regulation（SeqEA）［64］（A）；in situ RNA sequencing in intact biological systems with nanoliter resolution（Exseq）［67］（B）；spatially multi-omics sequencing via deterministic barcoding in tissue（DBiT-seq）［73］（C）

本文在表1中對各類方法進行了直接對比。

表1 空間轉(zhuǎn)錄組分析方法對比Table 1 Comparison of spatial transcriptome analysis methods

綜上所述，原位捕獲技術(shù)因具有分析通量高、靈敏度高、可分析的組織面積大、可進行多模態(tài)分析等優(yōu)點，成為單細胞空間分辨分析的重要技術(shù)。然而，盡管當(dāng)前的原位捕獲技術(shù)已實現(xiàn)納米級分辨率，但基于微球/納米球的編碼方法需利用高通量測序儀對芯片上每一個編碼位置進行從頭測序以獲得每個地理坐標位置的編碼序列，過程復(fù)雜、耗時長、成本高，限制了其大規(guī)模應(yīng)用；同時亞細胞水平的空間轉(zhuǎn)錄本定位研究仍然受限。開發(fā)制備易、通量高、成本低、面積大、靈敏度高、分辨率高的原位捕獲技術(shù)并進行應(yīng)用拓展是這一領(lǐng)域的未來發(fā)展方向。

4 結(jié)論與展望

本文綜述了單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組分析的前沿進展，總結(jié)并討論了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序、單細胞多組學(xué)測序和空間轉(zhuǎn)錄組分析方法?？梢钥吹?，當(dāng)前的單細胞測序技術(shù)正朝著空間化與多組學(xué)化方向發(fā)展。盡管目前單細胞多組學(xué)及空間轉(zhuǎn)錄組分析在揭示單細胞異質(zhì)性及細胞間的相互作用方面取得了重要突破，但仍面臨若干重大挑戰(zhàn)：首先，用于樣品制備或測序的自動化設(shè)備成本較高，且需要權(quán)衡細胞數(shù)量和測序深度以控制成本；第二，大多數(shù)單細胞轉(zhuǎn)錄組研究局限于poly（A）尾mRNA分析，而鮮有非多聚腺苷酸RNA（如非編碼RNA、小RNA等）的聯(lián)合分析，亟需發(fā)展針對全轉(zhuǎn)錄組的單細胞空間多組學(xué)研究方法；第三，目前基于原位捕獲的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究雖擁有了較高的基因測量數(shù)，但單細胞或亞細胞的空間分辨率有限，而基于成像的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究雖擁有納米級分辨率，但基因檢測數(shù)目有限，兼具高基因檢測通量和高空間分辨率的分析方法是未來的發(fā)展方向；第四，當(dāng)前的空間轉(zhuǎn)錄組分析局限于二維空間水平，盡管已有一些課題組利用連續(xù)切片組織進行二維空間基因表達分析，然后采用算法分析重構(gòu)三維圖譜［77］，但這種方法仍存在過程復(fù)雜、切片質(zhì)量無法保證等問題，完美的三維結(jié)構(gòu)重塑仍未解決。因此，開發(fā)低成本、全方位、高通量、高分辨的單細胞空間多組學(xué)分析方法，實現(xiàn)對單個細胞更為細致、全面及準確的描述和精準單細胞圖譜構(gòu)建，將更具研究及應(yīng)用潛力。