馬麗婷, 徐 智, 趙 兵, 陳 妍, 鄧亞琴, 王宇蘊

(云南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院 昆明 650201)

堆肥是目前實現(xiàn)農(nóng)業(yè)有機固體廢棄物和畜禽糞便資源化利用較為有效的方法之一。然而, 一些植物來源的農(nóng)業(yè)有機廢棄物(如玉米秸稈、稻殼等)中的木質素結構復雜, 不易降解。這阻礙了農(nóng)業(yè)有機廢棄物的資源化利用。然而, 木質纖維素降解產(chǎn)生的酚類、醌類等是形成腐殖質的重要前體物質,較高含量的木質纖維素及其降解對腐殖質的形成和穩(wěn)定具有積極作用。而木質纖維素的降解需要大量的水解酶來催化木質纖維素底物的水解。因此,有必要探究一種方法來促進木質纖維素降解酶的產(chǎn)生, 以強化堆肥腐殖化。

堆肥的本質是有機物在微生物和相應酶的作用下轉化為穩(wěn)定、復雜的腐殖酸大分子的過程, 酶在有機廢棄物降解過程中發(fā)揮著關鍵作用, 驅動著生物降解過程的礦化和腐殖化過程。木質纖維素降解酶的產(chǎn)生可能是由真菌和細菌共同作用的結果,真菌和細菌產(chǎn)生木質纖維素降解酶的反應與其自身的特性和環(huán)境變化有關。真菌能夠分泌大量對木質纖維素底物具有催化活性的胞外酶和胞內(nèi)酶, 且在堆肥過程中木質素等難降解物質主要由真菌在堆肥成熟階段進行降解。有學者認為, 在堆肥原料中接種微生物是促進酶活性、提高堆肥質量的一種有效方法, 且酶活性的提高可能受特定功能菌群的影響。黃孢原毛平革菌 (Phanerochaete chrysosporium)是白腐菌中降解木質素最活躍的有效菌種之一,對木質素的降解獨具優(yōu)勢。白腐菌的木質素降解酶系(包括木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶)是木質素降解系統(tǒng)中的主導酶系。在白腐菌對木質纖維素的降解機制中, 木質素過氧化物酶主要氧化木質素中的非酚型結構, 錳過氧化物酶和漆酶則氧化酚型結構, 各種酶協(xié)同作用, 完成對木質素的降解。大量堆肥試驗表明, 在堆肥過程中接種黃孢原毛平革菌促進了酶活性, 從而提高了堆肥物料降解效率和堆肥品質。由于黃孢原毛平革菌適宜的培養(yǎng)溫度為35 ℃, 在堆肥不同時期接種可能會影響木質纖維素降解酶的產(chǎn)生, 進而影響木質素的深度降解。Chen等報道了黃孢原毛平革菌在玉米秸稈和油枯堆肥中的應用, 而黃孢原毛平革菌在畜禽糞便和作物秸稈堆肥不同時期接種對堆肥腐殖化進程的作用尚少清晰報道。

綜上所述, 本研究結合黃孢原毛平革菌的耐溫特性, 在稻殼雞糞不同堆肥時期接種黃孢原毛平革菌, 探討堆肥過程中的酶活性和木質纖維素含量的變化特征, 以期明確堆肥不同時期接種黃孢原毛平革菌對堆肥腐殖化進程的影響。為生物強化高木質素農(nóng)業(yè)廢棄物堆肥處理, 促進堆肥腐殖化過程, 提升堆肥產(chǎn)品質量提供技術支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 堆肥材料

試驗于云南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院土壤肥料實驗室進行。雞糞取自云南農(nóng)業(yè)大學養(yǎng)雞場, 風干粉碎后備用。稻殼購買于云南省昆明市晉寧科貿(mào)有限公司。試驗選用的菌種為黃孢原毛平革菌, 用土豆培養(yǎng)基富集活化培養(yǎng)用于后續(xù)試驗, 菌懸液含有的黃孢原毛平革菌數(shù)量約為10cfu?mL。堆肥原料的基本理化性狀如表1。

表1 堆肥原料的基本理化性質Table 1 Basic physicochemical properties of the compost raw materials

1.2 試驗設計

試驗設置3個處理: 不接種(T1)、堆肥降溫期(第18天)接種黃孢原毛平革菌(T2)、堆肥初期(第0天)接種黃孢原毛平革菌(T3) 3個處理, 每個處理3次重復。T1處理將風干的稻殼和雞糞按1∶1.27的比例混合, 控制C/N為25, 調節(jié)含水量為52%。T2和T3處理分別于不同時期在T1的基礎上添加黃孢原毛平革菌(菌液添加重量為總有機物料干重的0.5%)。試驗采用堆肥式反應器(100 L)堆肥, 每個反應器并聯(lián)組成一套曝氣系統(tǒng), 每個堆肥反應器通氣速率為6 L?min, 每小時通氣3次, 每次2 min。試驗發(fā)酵時間為36 d, 堆肥前6 d每3 d翻堆一次, 第6～36 天則每6 d翻堆一次。

分別在堆肥0 d、3 d、6 d、12 d、18 d、24 d、

30 d和36 d采用五點采樣法在堆體內(nèi)部均勻取樣。每次采樣時, 各重復均采集9個樣品, 其中3個樣品風干粉碎用來測定C/N、木質素含量、纖維素含量,3個樣品保存于4 ℃冰箱中用于測定pH、種子發(fā)芽率和腐殖質組分相關指標, 最后3個樣品保存于—80 ℃冰箱中用來測定酶活性。

1.3 分析方法

每天上午9: 00用水銀溫度計測定堆體中心溫度, 同時測定環(huán)境溫度并記錄; pH、C/N根據(jù)文獻[7]測定; 種子發(fā)芽指數(shù)(GI)用水芹(Oenanthe javanica)種子根據(jù)文獻[11]測定, 計算種子發(fā)芽指數(shù)的公式如下:

木質過氧化物酶(LiP)和錳過氧化物酶(MnP)活性按文獻[12]測定, 纖維素含量(CC)、木質素含量(LC)的測定參考文獻[13], 降解率(DR)的測定參考文獻[14]。

腐殖酸含量(HS)、富里酸含量(FA)和胡敏酸含量(HA)按文獻[15]測定。

1.4 數(shù)據(jù)計算及處理

式中: HA-C為胡敏酸碳含量, FA-C為富里酸碳含量,HS-C為腐殖質碳含量, TOC為總有機碳含量。

采用SPSS 19 統(tǒng)計軟件和Office excel軟件進行數(shù)據(jù)處理及分析, RDA 分析利用 Canoco 5.0 軟件完成。

2 結果與分析

2.1 接種黃孢原毛平革菌對堆肥進程的影響

2.1.1 堆肥溫度、pH、C/N和種子發(fā)芽指數(shù)(GI)的變化

堆體內(nèi)部溫度是表征好氧堆肥發(fā)酵過程中微生物活性與有機物料腐熟進程的主要指標, 也是整個堆肥工藝中的關鍵因素之一。如圖1a所示, T1、T2和T3處理均在堆肥第2天進入高溫期, 持續(xù)高溫(≥50 ℃) 時間分別為10 d、12 d和10 d, 均滿足高溫堆肥的無害化處理標準要求; T2處理在堆肥降溫期接種外源黃孢原毛平革菌后, 溫度呈先上升后下降趨勢, 最高溫度達到50.5 ℃。原因可能與降溫期的溫度是黃孢原毛平革菌繁殖代謝的適宜溫度,保證其有效活性, 促進堆體再次發(fā)酵有關; 與T1處理相比, T3處理高溫持續(xù)時間沒有明顯差異, 說明黃孢原毛平革菌在堆肥初期接種效果不佳。

圖1 不同時間接種黃孢原毛平革菌對堆肥過程中堆肥物料理化性質的影響Fig.1 Changes of physicochemical properties of compost materials during composting with inoculation of Phanerochaete chrysosporium in different times

pH是影響微生物活動的重要因素, 是直接反映堆肥內(nèi)部酸堿程度的重要指標。如圖1b所示, 堆肥pH變化范圍為6.0～9.0, 整個堆肥過程是一個趨堿的過程。T1、T2和T3處理的pH均在前12 d呈上升趨勢, 在12 d時分別為8.98、8.96和8.56。原因可能與高溫期(圖1a)堆肥能夠釋放大量的氨有關。隨著堆肥進程的持續(xù), T1、T2和T3處理的pH呈逐漸下降趨勢, 堆肥結束時, 各處理的pH分別為8.30、8.10和7.59, 這與Chen等的研究結果一致。

C/N比通常用來反映堆肥物料的營養(yǎng)平衡狀況,同時也是評價堆肥腐熟程度的重要指標之一。如圖1c所示, 在整個堆肥過程中, 堆肥處理C/N比均呈下降趨勢, 這與Chen等的研究結果一致。堆肥結束時, T1、T2和T3處理的C/N比分別為15.36、14.54和14.67, T2和T3處理較T1處理差異顯著(P＜0.05)。依據(jù)堆肥腐熟要求(C/N＜15), 堆肥結束后,T2和T3處理能夠滿足要求, 且T2處理最低, 原因是降溫期外源接種黃孢原毛平革菌以后, 一定程度上促進了堆體再次發(fā)酵(圖1a), 使得微生物再次消耗碳源, 降低堆肥C/N值。

種子發(fā)芽指數(shù)(GI)一直被認為是反映堆肥產(chǎn)品腐熟程度和無害化最可靠、最敏感、最有效的重要指標。當GI＞50%時, 堆料毒性較低; 當GI＞80%,堆料完全腐熟不會影響植株的生長發(fā)育。如圖1d所示, 堆肥結束時, T1、T2和T3處理的GI值分別為81.24%、95.46%和83.18%。按照腐熟標準GI＞80%要求, 所有處理均能在堆肥結束時達到這一標準。其中T2處理的GI值高于T1和T3處理, 并呈顯著差異(P＜0.05), 進一步說明降溫期外源接種黃孢原毛平革菌對堆肥進程的強化作用。

2.1.2 堆肥過程中酶活性的變化

圖2a表明, 木質素過氧化物酶(LiP)的活性呈先升后降趨勢, 接種菌劑的T2和T3處理的峰值均高于對照T1處理。堆肥結束時, T1、T2和T3處理Lip活性分別為7.60 U?L、29.68 U?L和9.96 U?L;T2處理Lip活性顯著(P＜0.05)高于T1和T3處理。由圖2b可知, 錳過氧化物酶(MnP)活性呈波動上升趨勢; T1和T3處理均在堆肥12 d達到峰值, 分別為61.42 U?L和80.51 U?L; T2處理在堆肥36 d達到峰值(92.56 U?L); 3個處理峰值間差異顯著(P＜0.05)。與T1和T3處理相比, 在堆肥降溫期接種黃孢原毛平革菌顯著促進了其后堆肥的LiP和MnP的活性。這些結果與Chen等、Zeng等的研究結果一致。

圖2 不同時間接種黃孢原毛平革菌對堆肥過程中堆肥物料酶活性的影響Fig.2 Changes of enzymes activities of compost materials during composting with inoculation of Phanerochaete chrysosporium in different times

2.1.3 堆肥纖維素、木質素及有機物料降解的變化

在整個發(fā)酵過程中, 纖維素、木質素含量整體均呈下降趨勢(圖3a, 3b)。就纖維素含量而言, T1、T2和T3處理分別從初始的0.29 g?g、0.30 g?g和0.28 g?g下 降 至0.19 g?g、0.09 g?g和0.15 g?g(圖3a); 木質素含量分別從初始堆肥時的0.23 g?g、0.24 g?g和0.24 g?g下降到0.14 g?g、0.03 g?g和0.07 g?g(圖3b)。堆肥結束時, 與T1和T3相比, T2處理木質素含量分別降低78.57%和57.14%, 纖維素含量分別降低52.63%和40.00%, 差異顯著(P＜0.05)。有機物料累計降解率在整個發(fā)酵過程中呈上升趨勢(圖3c)。堆肥結束時, T1、T2和T3處理的累計降解率分別為17.09%、30.15%和20.25%; 其中T2處理較T1和T3處理顯著增加76.41%和48.89% (P＜0.05),進一步印證了在降溫期接種黃孢原毛平革菌對堆肥進程的促進作用。

圖3 不同時間接種黃孢原毛平革菌對堆肥過程中堆肥物料纖維素含量、木質素含量和有機物料降解率的影響Fig.3 Changes of cellulose content, lignin content and organic material degradation rate of compost materials during composting with inoculation of Phanerochaete chrysosporium in different times

2.2 接種黃孢原毛平革菌對堆肥腐殖化的影響

2.2.1 腐殖質(HS)、胡敏酸(HA)和富里酸(FA)含量的變化

腐殖質(HS)、胡敏酸(HA)和富里酸(FA)含量的變化反映了稻殼雞糞堆肥的腐殖化過程。堆肥HS含量變化如圖4a所示, 在堆肥前期(0～17 d), T3處理HS含量高于其他處理; 而堆肥降溫期和腐熟期(18～36 d), T2處理HS含量顯著增加, 從36.51 g?g(第18天)持續(xù)增加至76.30 g?g(第36天); 堆肥結束時, T2處理HS含量顯著高于T1和T3處理(P＜0.05)。

FA是腐殖質中分子量較小、組成簡單、活性較高的組分。堆肥過程中FA含量變化如圖4b所示, FA含量呈先升高再下降的趨勢。堆肥前期(0～17 d), 各處理FA含量呈上升趨勢, T3處理FA含量顯著(P＜0.05)高于其他處理, 可能與堆肥第0天接種黃孢原毛平革菌有直接關系。在堆肥后期(18～36 d),FA含量總體呈下降的趨勢, FA含量的持續(xù)降低過程與HS穩(wěn)定性逐漸增強過程相印證, 這可能是因為在微生物的作用下FA轉化形成結構更復雜的HA。T2處理的FA含量從第30天開始下降, 比T1和T3推遲12 d (圖4b), 且第36 天FA含量顯著高于T1和T2處理(P＜0.05)。這與第18天接種黃孢原毛平革菌促進了木質素和纖維素的降解(圖3a, 3b), 產(chǎn)生了新的FA有直接關系。

作為HS的主要成分, 在堆肥過程中, HA含量變化趨勢與HS含量變化一致(圖4c)。T1、T2和T3處理HA含量從堆肥初期的7.75 g?kg、7.75 g?kg和7.52 g?kg分別上升至堆肥結束時的29.50 g?kg、55.93 g?kg和32.75 g?kg。與T1和T3處理相比,T2處理的HA含量顯著增加(P＜0.05)。進一步驗證了降溫期外源接種黃孢原毛平革菌有助于深化纖維素、木質素的降解, 促進HA的形成。

圖4 不同時間接種黃孢原毛平革菌對堆肥過程中堆肥物料腐殖質組分和腐熟指標的影響Fig.4 Changes of humus components contents and maturity indexes of compost materials during composting with inoculation of Phanerochaete chrysosporium in different times

2.2.2 腐殖化率(HR)、胡富比(HA/FA)和胡敏酸百分比(PHA)的變化

堆肥腐殖化率(HR)是評價堆肥腐殖化程度的重要指標, HR的增加說明堆肥過程中可溶性有機碳含量增加。如圖4d所示, 堆肥過程中HR呈上升趨勢; 堆肥結束時, T1、T2和T3處理的HR值分別為25.06%、36.45%和30.43%, 且T2處理的HR顯著高于T1和T3處理(P＜0.05)。表明在稻殼和雞糞堆肥降溫期外源接種黃孢原毛平革菌可提升堆肥腐殖化程度。

胡富比(HA/FA)和胡敏酸百分比(PHA)是表征堆肥腐殖質品質的重要指標, HA/FA在腐殖化過程中增加說明堆肥過程中小分子的FA轉化成了大分子的HA, 增加了腐殖質的復雜程度; PHA在腐殖化過程中增加則表明HS結構復雜性增強。堆肥結束時, T2處理HA/FA和PHA分別為2.72和73.39%(圖4e, 4f), 顯著高于T1和T3處理(P＜0.05)。

2.3 接種黃孢原毛平革菌對堆肥腐殖化的促進作用

腐殖質的形成與木質素和纖維素的降解密切相關, 而木質素和纖維素的降解與木質纖維素降解酶的活性密切相關。LiP和MnP都屬于木質素降解酶系, LiP主要氧化木質素中的非酚型結構, MnP則主要氧化酚型結構, 各種酶協(xié)同作用, 以HO或O作為電子受體, 能夠使木質素結構單元的連接鍵斷裂,使芳香烴結構去甲基化, 從而實現(xiàn)木質素的降解。本研究結果表明, 木質素(LC)和纖維素(CC)含量與木質纖維素降解酶(LiP、MnP)的活性呈顯著負相關(P＜0.05, P＜0.01) (圖5a), 這一結果支持了LiP和MnP促進木質素和纖維素降解的觀點。另外, 冗余分析(RDA)結果表明, 降解率(DR, 解釋度=88.2%,P=0.002)、纖維素含量(CC, 解釋度=74.3%, P=0.002)和木質素含量(LC, 解釋度=72.5%, P=0.002)對腐熟指標的影響最為顯著(圖5b)。這一結果支持了木質素和纖維素的降解促進HS形成的觀點, 木質素和纖維素的深度降解促進了HS結構的復雜性, 使HS結構更加穩(wěn)定。

圖5 木質纖維素含量與木質纖維素降解酶活性之間的相關性(a)及堆肥腐熟程度和理化參數(shù)之間的冗余分析(b)Fig.5 Correlation between lignocellulose content and lignocellulose-degrading enzymes activities (a), and redundancy analysis between compost maturity indexes and compost physicochemical parameters (b)

結合之前的描述, 在稻殼和雞糞堆肥的降溫期接種黃孢原毛平革菌顯著提高了LiP和MnP的活性, 促進了木質素和纖維素的降解, 表明在稻殼和雞糞堆肥的降溫期接種黃孢原毛平革菌通過提高木質纖維素降解酶(LiP、MnP)的活性, 促進了木質素和纖維素的降解, 從而強化堆肥腐殖化。

3 討論

本研究在雞糞和稻殼堆肥的不同階段接種黃孢原毛平革菌, 以探究其對堆肥腐殖化進程的影響。3個處理的溫度變化表明在不同階段進行的微生物接種增強了堆肥中的生物活性, 說明外源添加黃孢原毛平革菌促進了有機化合物降解和增加微生物活性。同時在降溫期接種微生物后, 溫度明顯二次升高, 與Chen等報道的結果相似, 表明降溫期接種可以延長堆肥的嗜熱階段, 促進有機物的再次降解。

就酶活性而言, T2處理在降溫期接種黃孢原毛平革菌后, LiP和MnP的活性均顯著提高(P＜0.05),這些結果與Chen等、Zeng等的研究結果一致。此外, T2處理木質素和纖維素含量較T1和T3相比顯著降低(P＜0.05); 從有機物料累積降解率來看, T2處理較T1和T3處理顯著增加76.41%和48.89%(P＜0.05)。這些結果可能與T2處理中酶活性的變化有關, 因為在堆肥降溫期接種黃孢原毛平革菌避免了高溫, 菌種生長良好, 產(chǎn)生了更高的酶活性, 促進了對木質素和纖維素等難降解物質的降解, 與Zeng等的研究結果相似。

T2處理腐殖質、胡敏酸和富里酸含量也顯著高于T1和T3處理。原因可能是在以稻殼為主要原料的木質素廢棄物堆肥過程中, 黃孢原毛平革菌在降溫期接種, 由于適宜的溫度有效保持其活性的同時,增強微生物繁殖代謝能力, 分泌了大量關鍵降解酶(圖2), 促進了纖維素和木質素的深度降解(圖3), 大量的微生物利用難降解的纖維素和木質素等物質作為碳源, 纖維素和木質素被降解產(chǎn)生酚類、醌類等HS的重要前體物質使腐殖質結構更加復雜和穩(wěn)定,加快堆肥腐熟的同時強化了腐殖化進程, 并提高了堆肥產(chǎn)物品質。這些結果表明, 在堆肥降溫期外源接種黃孢原毛平革菌可以通過提高木質纖維素降解酶活性, 促進木質纖維素降解, 強化堆肥的腐殖化過程。

4 結論

研究結果表明, 降溫期接種黃孢原毛平革菌有利于木質素降解酶LiP、MnP活性提高, 促進木質素和纖維素的深度降解和堆肥的腐殖化程度。 堆肥結束時, 與不接種的堆肥相比, 降溫期接種黃孢原毛平革菌的堆肥木質素和纖維素含量降低了78.57%和52.63%, 與堆肥第0天接種相比, 木質素和纖維素含量降低了57.14%和40.00%; 腐殖質含量分別比不接種和堆肥第0天接種高67.84%和52.33%。在堆肥降溫期外源接種黃孢原毛平革菌通過提高木質纖維素降解酶活性, 促進木質纖維素降解, 有利于堆肥的熟化和質量提高。