賈怡文，陳小威，孫尚德，畢艷蘭，崔勝成

(1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州 450001； 2.新疆泰昆集團(tuán)股份有限公司，新疆 昌吉 831100)

我國(guó)飼料資源尤其蛋白飼料資源短缺，棉籽作為大豆以外的第二大優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源，對(duì)其開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。然而，棉籽及其餅(粕)在飼料上的利用率卻不到30%，最主要的原因在于棉籽餅(粕)中存在棉酚、環(huán)丙烯脂肪酸(Cyclopropene fatty acids，CPFAs)抗?fàn)I養(yǎng)因子，致使棉籽餅(粕)在飼料行業(yè)中利用受限[1-3]。環(huán)丙烯脂肪酸是棉酚之外影響棉籽及其餅(粕)利用的第二大抗?fàn)I養(yǎng)因子，影響雞、魚(yú)及一些單胃動(dòng)物的代謝[4-6]。棉籽中含有蘋(píng)婆酸和錦葵酸兩種CPFAs，其中蘋(píng)婆酸毒性較大，會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性，影響糖代謝，導(dǎo)致母雞產(chǎn)蛋率下降以及牛肉肉質(zhì)硬化等[7-9]。

棉籽及其餅(粕)中 CPFAs測(cè)定分析對(duì)其在飼料中的應(yīng)用和脫除研究具有重要意義。相較于傳統(tǒng)Halphen實(shí)驗(yàn)的定性分析，利用色譜技術(shù)進(jìn)行量化分析CPFAs可指導(dǎo)飼料配方中的添加量。通過(guò)苯甲酰衍生化處理后利用雙柱反相高效液相色譜對(duì)棉籽油中的CPFAs進(jìn)行分離，再結(jié)合外標(biāo)法可實(shí)現(xiàn)定量分析，但存在步驟煩瑣、成本高等缺陷[10]。王美霞等[11]通過(guò)全自動(dòng)索氏浸提裝置提取棉籽油，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將棉籽油中脂肪酸成功分離，并證實(shí)肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、錦葵酸、亞油酸、蘋(píng)婆酸、二氫蘋(píng)婆酸和花生酸是棉籽油的特征脂肪酸，但CPFAs與普通脂肪酸的分離效果不佳。目前脂肪酸含量測(cè)定的國(guó)標(biāo)方法有GB/T 21514—2008《飼料中脂肪酸含量的測(cè)定》和GB 5009.168—2016《食品安全國(guó)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測(cè)定》，二者均采用氣相色譜法，但棉籽油脂肪酸的多樣性和CPFAs分子中環(huán)丙烯結(jié)構(gòu)的敏感性使其與普通直鏈脂肪酸的分析檢測(cè)在脂肪酸衍生化、色譜柱選擇和色譜分離條件等方面存在顯著差異[12-14]，從而造成國(guó)標(biāo)方法均難以實(shí)現(xiàn)CPFAs的有效分離[15]。這影響了棉籽及其餅(粕)中CPFAs的量化分析，進(jìn)而限制了為飼料配方中的應(yīng)用提供直接信息。

基于此，本研究利用氣相色譜法量化分析棉籽及其餅(粕)中CPFAs的含量，考察了不同脂肪酸衍生化方法、氣相色譜條件，建立具有較好分離度的色譜操作條件，并進(jìn)一步建立CPFAs的外標(biāo)定量測(cè)定方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)棉籽及其餅(粕)中CPFAs的準(zhǔn)確量化分析，為棉籽及其餅(粕)在飼料中的應(yīng)用提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

棉籽、棉籽餅和棉籽粕，新疆泰昆集團(tuán)股份有限公司提供。蘋(píng)婆酸甲酯 (C20H36O2，純度≥98%)、錦葵酸甲酯(C19H34O2，純度≥95%)標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Matreya脂質(zhì)與生物化學(xué)科技有限公司；37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品,美國(guó)Sigma公司。

Agilent 7890B氣相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；RV 10 control auto V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA科技有限公司；賽多利斯SQP電子天平；FS-100小型粉碎機(jī)，鶴壁市英泰電子電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 棉籽及其餅(粕)中油脂的提取

通過(guò)油脂提取方法的篩選，確定采用GB/T 6433—2006中的方法對(duì)棉籽及其餅(粕)中油脂進(jìn)行提取。

1.2.2 棉籽油脂肪酸衍生化

(1)堿式甲酯化：準(zhǔn)確稱取棉籽油0.1 g，用正己烷定容于10 mL容量瓶?jī)?nèi)；用移液管準(zhǔn)確移取3 mL樣液于小瓶中，加入2 mL氫氧化鈉-甲醇溶液，劇烈混勻7 min，靜置待分層后，將上清液移至試管中，加入約1 g無(wú)水硫酸鈉，取上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾，所得濾液即為試樣的待測(cè)液。

(2)簡(jiǎn)易堿式甲酯化：準(zhǔn)確稱取0.1 g棉籽油置于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，用色譜級(jí)正己烷定容；用移液管準(zhǔn)確移取3 mL樣液于小瓶中，加入2 mL甲醇鈉，劇烈混勻7 min，放置約1 min，混合溶液出現(xiàn)分層，將上清液移至試管中，加入約1 g無(wú)水硫酸鈉，取上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾，所得濾液為試樣的待測(cè)液。

(3)三氟化硼甲酯化：準(zhǔn)確稱取0.1 g棉籽油置于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，用色譜級(jí)正己烷定容；用移液管準(zhǔn)確移取3 mL樣液于25 mL燒瓶中，加入沸石，用移液管移取7 mL甲醇溶液于燒瓶中。連接回流裝置，回流過(guò)程中不斷攪動(dòng)燒瓶，煮沸并計(jì)時(shí)7 min，至溶液變透明。從冷凝管上端用移液管加入7 mL三氟化硼-甲醇溶液，繼續(xù)回流1 min，再加入2.4 mL正己烷回流1 min，最后撤掉熱源，取出燒瓶，加入氯化鈉飽和溶液至燒瓶的頸部，靜置分層30 min，將上清液移至試管內(nèi)，加入約1 g無(wú)水硫酸鈉，取上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾，所得濾液為試樣的待測(cè)液。

(4)硫酸催化甲酯化：準(zhǔn)確稱取0.1 g棉籽油置于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，用色譜級(jí)正己烷定容；用移液管準(zhǔn)確移取3 mL樣液于20 mL具塞試管中，加入2 mL 1%硫酸-甲醇溶液混勻，置于70℃水浴加熱60 min，冷卻后加入飽和氯化鈉溶液至溶液分層，將上清液放至試管內(nèi)，加入約1 g無(wú)水硫酸氫鈉，取上清液經(jīng) 0.45 μm濾膜過(guò)濾，所得濾液為試樣的待測(cè)液。

1.2.3 環(huán)丙烯脂肪酸含量的測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

準(zhǔn)確稱取蘋(píng)婆酸甲酯25 mg和錦葵酸甲酯5 mg于10 mL容量瓶中，用色譜級(jí)正己烷溶解并定容，搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為2.5 mg/mL和0.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-18℃下保存?zhèn)溆?。臨用前分別取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行氣相色譜(GC)分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 GC分析條件

配有氫火焰離子化檢測(cè)器的氣相色譜儀，進(jìn)樣口與檢測(cè)器溫度均為280℃，載氣為高純氮?dú)?99.999%)，分流比為1∶20；初始柱溫為100℃, 以一定的速率升至220℃；進(jìn)樣量為1 μL。

1.2.3.3 定量分析

相對(duì)含量測(cè)定：采用峰面積歸一化法，根據(jù)錦葵酸或蘋(píng)婆酸甲酯相應(yīng)峰面積對(duì)所有脂肪酸甲酯峰面積總和的占比來(lái)計(jì)算錦葵酸和蘋(píng)婆酸的含量。

絕對(duì)含量測(cè)定：采用外標(biāo)法，通過(guò)錦葵酸或蘋(píng)婆酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，分別將其峰面積代入方程，并根據(jù)甲酯與相應(yīng)脂肪酸的換算系數(shù)計(jì)算脂肪酸絕對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

鑒于色譜柱對(duì)脂肪酸分離效果的影響，固定升溫速率(2.0 ℃/min)和氮?dú)饬魉?0.6 mL/min)下，考察了常見(jiàn)的3種色譜柱SGE BPX-70色譜柱(30.0 m×250 μm×0.25 μm)、HP-88色譜柱(0.25 mm×0.25 μm×100 m)、DB-1ht毛細(xì)管柱(28.0 m×250 μm× 0.1 μm)對(duì)棉籽油脂肪酸(衍生化方法采用1.2.2中簡(jiǎn)易堿式甲酯化)的分離效果，如圖1所示。

圖1 不同色譜柱對(duì)棉籽油脂肪酸的分離效果

由圖1a可以看出，以中等極性填料的SGE BPX-70色譜柱分離時(shí)，脂肪酸沒(méi)有得到很好的分離。HP-88色譜柱是填料為氰丙基芳基聚硅氧烷的毛細(xì)管柱，具有強(qiáng)極性。由圖1b可知，雖然HP-88色譜柱柱長(zhǎng)有100 m，但是棉籽油脂肪酸在60 min內(nèi)仍未得到有效分離，12 min時(shí)出現(xiàn)溶劑峰，57 min時(shí)出現(xiàn)棕櫚酸峰，不利于脂肪酸的檢測(cè)。DB-1ht毛細(xì)管柱為非極性高溫柱，耐受溫度達(dá)400℃。從圖1c可知，DB-1ht 毛細(xì)管柱對(duì)棉籽油脂肪酸具有良好的分離效果。

綜上，選取DB-1ht非極性毛細(xì)管柱作為環(huán)丙烯脂肪酸的分離柱。

在采用標(biāo)準(zhǔn)品確認(rèn)錦葵酸(MLV)和蘋(píng)婆酸(STC)出峰位置的基礎(chǔ)上，利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)環(huán)丙烯脂肪酸進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)證。GC-MS條件：DB-SMS毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.32 mm×1 μm)，離子源溫度230℃，EI源離子化方式，四極桿溫度150℃，全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍 (m/z)40～500，溶劑延遲時(shí)間3 min。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 棉籽油中錦葵酸、蘋(píng)婆酸和二氫蘋(píng)婆酸的GC-MS離子峰譜圖

從圖2可知，錦葵酸(圖2a)和蘋(píng)婆酸(圖2b)及另一種環(huán)丙烷脂肪酸，即二氫蘋(píng)婆酸(圖2c)[16]被證實(shí)存在于棉籽中。

2.1.2 程序升溫速率對(duì)分離效率的影響

采用DB-1ht非極性毛細(xì)管柱作為分離柱，在0.6 mL/min氮?dú)饬魉傧驴疾炝顺绦蛏郎厮俾蕦?duì)棉籽油脂肪酸分離的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 程序升溫速率對(duì)棉籽油脂肪酸中錦葵酸(MLV)和蘋(píng)婆酸(STC)分離效果的影響

從圖3a可知，在3.0℃/min升溫速率下45 min內(nèi)完整分離出全部脂肪酸，錦葵酸和蘋(píng)婆酸分別出現(xiàn)在31.0 min和33.8 min，但油酸和亞油酸沒(méi)能被很好地分離。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是升溫速率太快，不利于脂肪酸的分離。從圖3b可知，在 2.0 ℃/min升溫速率下，在60 min內(nèi)脂肪酸可以被很好地分離，錦葵酸和蘋(píng)婆酸分別出現(xiàn)在41.6 min和45.8 min。蘋(píng)婆酸和錦葵酸的出峰時(shí)間相差大，同時(shí)其他脂肪酸也得到良好的分離，有利于進(jìn)行定量分析。從圖3c可知，1.5 ℃/min升溫速率下，在60 min內(nèi)并未呈現(xiàn)出完整的分離峰，錦葵酸峰出現(xiàn)在51.2 min，而60 min內(nèi)并未出現(xiàn)蘋(píng)婆酸的峰。綜上所述，選擇最佳升溫速度為2.0 ℃/min。

2.1.3 氮?dú)饬魉賹?duì)分離效率的影響

采用DB-1ht非極性毛細(xì)管柱作為分離柱，在恒定升溫速度2.0℃/min下考察了氮?dú)饬魉賹?duì)棉籽油脂肪酸的分離效果，結(jié)果如圖4所示。

圖4 氮?dú)饬魉賹?duì)棉籽油脂肪酸中錦葵酸(MLV)和蘋(píng)婆酸(STC)分離效果的影響

從圖4可知：當(dāng)?shù)獨(dú)饬魉贋?.0 mL/min時(shí)，錦葵酸和蘋(píng)婆酸的出峰時(shí)間分別為37.4 min和41.6 min；當(dāng)?shù)獨(dú)饬魉贋?.6 mL/min時(shí)，錦葵酸和蘋(píng)婆酸色譜峰分別出現(xiàn)在41.6 min和45.8 min；而在氮?dú)饬魉贋?.4 mL/min時(shí)，在45.5 min和49.7 min分別出現(xiàn)錦葵酸和蘋(píng)婆酸。可見(jiàn)，隨著氮?dú)饬魉俚慕档?，脂肪酸分離圖中錦葵酸和蘋(píng)婆酸色譜峰的出現(xiàn)時(shí)間向右移動(dòng)。為了實(shí)現(xiàn)在適當(dāng)時(shí)間內(nèi)得到較好的脂肪酸分離效果，氮?dú)饬魉龠x擇0.6 mL/min。

2.2 衍生化方法對(duì)環(huán)丙烯脂肪酸分析的影響

為了準(zhǔn)確測(cè)定環(huán)丙烯脂肪酸的含量，在優(yōu)化的色譜條件基礎(chǔ)上對(duì)4種衍生化方法(堿式甲酯化、簡(jiǎn)易堿式甲酯化、三氟化硼甲酯化、硫酸催化甲酯化)進(jìn)行了系統(tǒng)比較。相同質(zhì)量的棉籽油經(jīng)過(guò)不同衍生化后所得的GC圖譜如圖5所示。

圖5 4種不同甲酯化條件下的棉籽油脂肪酸GC圖譜

從圖5可知，在堿式甲酯化、簡(jiǎn)易堿式甲酯化和三氟化硼甲酯化后的GC圖譜中均觀察到錦葵酸和蘋(píng)婆酸。然而，硫酸催化甲酯化后的GC圖譜中沒(méi)有觀察到錦葵酸和蘋(píng)婆酸的峰，且其他脂肪酸的峰值也較低。

不同衍生化方法對(duì)錦葵酸和蘋(píng)婆酸的出峰面積和相對(duì)含量的影響如表1所示。從表1可知：堿式甲酯化所得的錦葵酸峰面積為76.69，脂肪酸相對(duì)含量為0.75%，蘋(píng)婆酸峰面積為40.51，相對(duì)含量為0.39%；簡(jiǎn)易堿式甲酯化后的錦葵酸峰面積為43.75，相對(duì)含量為0.72%，蘋(píng)婆酸峰面積為21.87，相對(duì)含量為0.36%；三氟化硼甲酯化所得的錦葵酸峰面積為34.07，相對(duì)含量為0.68%，蘋(píng)婆酸峰面積為17.08，相對(duì)含量為 0.34%。4種處理方法得到的錦葵酸和蘋(píng)婆酸峰面積大小均為堿式甲酯化>簡(jiǎn)易堿式甲酯化>三氟化硼甲酯化>硫酸催化甲酯化，可知堿式甲酯化的衍生化效果最好，這與文獻(xiàn)[10，17-18]報(bào)道一致。因此，選擇堿式甲酯化方法進(jìn)行衍生化。

表1 不同衍生化方法對(duì)棉籽油中錦葵酸和蘋(píng)婆酸峰面積及相對(duì)含量的影響

通過(guò)對(duì)棉籽油進(jìn)行堿式甲酯化后的色譜分析并結(jié)合GC-MS分析棉籽油主要脂肪酸組成及含量，結(jié)果如表2所示。

表2 棉籽油脂肪酸組成及相對(duì)含量

由表2可知，棉籽油共檢出13種脂肪酸，以亞油酸(55.446%)、棕櫚酸(22.476%)、油酸(15.229%)和硬脂酸(2.084%)為主，還含有順式異油酸(0.824%)、肉豆蔻酸(0.691%)、棕櫚油酸(0.506%)、十七烯酸(0.074%)、十七酸(0.088%)、花生酸(0.270%)、錦葵酸(0.720%)、蘋(píng)婆酸(0.370%)和二氫蘋(píng)婆酸(0.308%)。

2.3 GC測(cè)定環(huán)丙烯脂肪酸的方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 重復(fù)性評(píng)價(jià)

在優(yōu)化的色譜條件下，按1.2.3方法利用標(biāo)準(zhǔn)品建立錦葵酸甲酯(Y=1.646X-1.063，R2= 0.997，線性范圍1～250 μg/mL)和蘋(píng)婆酸甲酯(Y=1.333X-2.499，R2= 0.998，線性范圍5～1 250 μg/mL)的線性回歸方程。利用線性回歸方程對(duì)棉籽中的CPFAs含量進(jìn)行了分析。表3為GC測(cè)定棉籽中CPFAs的重復(fù)性評(píng)價(jià)分析結(jié)果，重復(fù)過(guò)程包括棉籽油的提取、衍生化和GC分析得到兩種CPFAs的含量。從表3可知:提油率平均值為28.19%，RSD為2.63%(<5%)，重復(fù)性良好；外標(biāo)法測(cè)定的錦葵酸和蘋(píng)婆酸平均含量以及RSD分別為2.73 mg/g、1.32%(< 5%)和1.07 mg/g、2.13%(<5%)。由此可知，衍生化和GC分析過(guò)程也具有良好重復(fù)性。綜上可知，所建立的GC測(cè)定CPFAs含量的方法重復(fù)性良好。

表3 GC測(cè)定棉籽中CPFAs的重復(fù)性評(píng)價(jià)分析結(jié)果

2.3.2 回收率評(píng)價(jià)

為考察GC對(duì)CPFAs的準(zhǔn)確性，對(duì)建立方法的回收率進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果如表4所示。從表4可知：錦葵酸的回收率在84.737%～108.037%之間，平均值為96.965%，RSD為10.865%；蘋(píng)婆酸的回收率在84.388%～113.291%之間，平均值為97.447%，RSD為13.876%。說(shuō)明此方法準(zhǔn)確可靠。

表4 CG測(cè)定棉籽油中的CPFAs回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 棉籽及其餅(粕)中的環(huán)丙烯脂肪酸含量

利用建立的環(huán)丙烯脂肪酸GC測(cè)定法分析了棉籽、棉籽餅和棉籽粕中錦葵酸和蘋(píng)婆酸的含量，結(jié)果如表5所示。

表5 氣相色譜測(cè)定棉籽及其餅(粕)中環(huán)丙烯脂肪酸含量

由表5可知：棉籽中錦葵酸和蘋(píng)婆酸的含量分別為2.62 mg/g和1.02 mg/g；棉籽餅和棉籽粕中的錦葵酸含量分別為0.68 mg/g和0.09 mg/g，蘋(píng)婆酸含量分別為0.27 mg/g和0.04 mg/g。

3 結(jié) 論

本文主要研究了棉籽及其餅(粕)中環(huán)丙烯脂肪酸含量的測(cè)定方法。通過(guò)探究堿式、簡(jiǎn)易堿式、硫酸催化甲酯化和三氟化硼甲酯化等4種衍生化方法，證實(shí)堿式甲酯化具有最佳效果；通過(guò)優(yōu)化氣相色譜條件得到最優(yōu)條件為采用DB-1ht毛細(xì)管柱，氮?dú)饬魉贋?0.6 mL/min,升溫程序?yàn)閺?00℃以2℃/min的速率上升到220℃，結(jié)合外標(biāo)法定量。該方法的重復(fù)性和回收率良好。采用建立的方法測(cè)得棉籽、棉籽餅和棉籽粕中的錦葵酸含量分別為2.62、0.68 mg/g 和0.09 mg/g，蘋(píng)婆酸含量分別為1.02、0.27 mg/g 和0.04 mg/g。該方法為棉籽及其餅(粕)中環(huán)丙烯脂肪酸量化測(cè)定提供了技術(shù)依據(jù)和指導(dǎo)，有利于為其在飼料工業(yè)中配方添加提供直接信息以及為環(huán)丙烯脂肪酸脫除提供技術(shù)支撐。