徐澤榮，金文芳，孫云鵬，劉勁松,2,3，王國凱,2,3*

（1.安徽中醫(yī)藥大學 藥學院，安徽 合肥 230012；2.中藥研究與開發(fā)安徽省重點實驗室，安徽 合肥230012；3.藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012）

糖尿病在中醫(yī)上被稱為消渴癥，它是由于胰島β 細胞不能正常分泌胰島素，使胰島素相對或絕對不足而引起的。目前，糖尿病是除了心血管疾病、腫瘤以外的第三大疾病，嚴重影響了人們的生活和健康?，F(xiàn)在醫(yī)學上對糖尿病病因尚未完全明確，可能與環(huán)境、遺傳、自身免疫等原因有關。據(jù)相關文獻報道，近些年來，糖尿病發(fā)病程度逐漸趨于嚴重化及患病人群逐漸趨于年輕化[1]。目前，臨床上用于治療糖尿病的藥物作用靶點單一、耐藥性和副作用等問題一直存在[2]。因此，研究糖尿病的病理機制及尋找安全、低毒、高效的藥物尤其重要。

大葉桃花心木為楝科桃花心木屬植物，別名美洲紅木，因其提取物和單體化合物表現(xiàn)出多種生物活性備受研究者關注[3-4]。近些年，從大葉桃花心木樹葉、樹皮以及果實中分離得到大量的檸檬苦素類化合物。檸檬苦素為降三萜類化合物[5]，藥理學研究表明檸檬苦素除了具有抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、抗真菌[8]和抗病毒[9]等生物活性外，還具有良好的降糖作用[10]。雖然有文獻報道檸檬苦素具有明顯降血糖效果，然而，對于其治療糖尿病的活性成分和作用機制仍缺乏了解。

網(wǎng)絡藥理學是在大數(shù)據(jù)的背景下，通過對網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫的多方面挖掘，來研究藥物與疾病之間存在的潛在復雜關系。利用網(wǎng)絡藥理學來預測中藥治療糖尿病的作用機制和篩選活性成分的研究近些年來不勝枚舉，本研究旨在借助網(wǎng)絡藥理學方法，并通過分子對接技術進行驗證，探究大葉桃花心木檸檬苦素治療糖尿病的生物學機制，同時希望能夠篩選出降糖活性更好的檸檬苦素類化合物，為后續(xù)疾病的研究和藥物研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大葉桃花心木檸檬苦素活性成分收集和相關靶點的篩選

通過檢索相關文獻獲得大葉桃花心木檸檬苦素化合物的化學結(jié)構(gòu)[11]，利用ChemBioDraw 畫出這些化合物化學結(jié)構(gòu)式并導入到Swiss ADME 中，以同時滿足高胃腸吸收（GI absorption high）和類藥性（Druglikeness）五個條件中兩個yes 為標準進行篩選，篩選后的化合物導入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http://swisstargetprediction.ch/）進行靶點預測。

1.2 糖尿病相關靶點的收集

分 別 在GeneCards（http://www.genecards.org/）、OMIM（http://www.omim.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、Drugbank（https://go.drugbank.com/）及PharmGkb（https://www.pharmgkb.org/）等網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫中檢索“diabetes”，獲取糖尿病疾病相關靶點。整合以上數(shù)據(jù)庫中獲得的靶點，除去重復項，建立疾病靶點數(shù)據(jù)庫。

1.3 藥物與疾病交集靶點的篩選

將藥物靶點和疾病靶點基因名上傳至Venny 2.1.0平臺（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），取二者交集，獲得檸檬苦素治療糖尿病的共有靶點的韋恩圖。

1.4 藥物-靶點網(wǎng)絡關系的構(gòu)建

為更清楚直觀的表明大葉桃花心木檸檬苦藥物靶點和糖尿病疾病靶點之間的聯(lián)系，將獲得的共有靶點和篩選后的化合物導入到Cytoscape 3.7.1 軟件中構(gòu)建檸檬苦素-靶點相互作用網(wǎng)絡。

1.5 藥物-疾病靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡圖的構(gòu)建

將得到的藥物與疾病的共有靶點導入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/cgi/）進行在線分析，建立藥物靶點-疾病靶點相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡圖，并根據(jù)度值（Degree）大小篩選治療疾病的關鍵靶點。

1.6 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

采用計算機R 語言中clusterProfiler 程序包，以P＜0.05為篩選條件對交集靶點進行GO富集和KEGG通路分析，并進行可視化處理。

1.7 大葉桃花心木檸檬苦素與糖尿病關鍵靶點分子對接

選擇藥物-疾病靶點相互作用網(wǎng)絡中度值較大的5 個關鍵靶點與其對應的活性成分進行分子對接，利用ChemBio3D 對化合物能量最小化處理后保存為mol 2 格式。在PDB 數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/structure)中下載關鍵靶點蛋白的pdb 格式，利用Pymol Win軟件進行去水去配體處理后保存。利用Autodock Vina 軟件將治療糖尿病的關鍵靶點與相應的活性化合物進行分子對接。分子對接成功后，其結(jié)果利用Discovery Studio 軟件進行可視化處理。另外，將選擇的關鍵靶點蛋白的原共晶配體提取出來再與原來的蛋白進行自對接，來評估對接方法的準確性和可靠性，通過比較原共晶配體的坐標體系計算均方根偏差（RMSD）,當RMSD ≤2.0 ?，表示對接結(jié)果可靠。

2 結(jié)果

2.1 大葉桃花心木檸檬苦素活性成分收集和相關靶點的篩選

檢索相關文獻，共得到117 個大葉桃花心木檸檬苦素類化合物，其中有26 個檸檬苦素通過了Swiss ADME的篩選，能預測到靶點的化合物有25 個，見表1。利用Swiss Target Predition 共預測到藥物潛在靶點431 個；GeneCards、OMIM、TTD 等數(shù)據(jù)庫預測到糖尿病相關靶點個數(shù)，見表2，去重后共獲得疾病靶點1 314 個。最后，將上述藥物靶點與疾病靶點進行對比匹配，獲得與檸檬苦素治療糖尿病相關的共有靶點132個，見圖1。

表1 通過篩選的26 個檸檬苦素基本信息Tab. 1 Basic information of screened 26 limonoids

表2 不同數(shù)據(jù)庫收集到的疾病靶點個數(shù)Tab. 2 Number of disease targets collected from different databases

將通過篩選的化合物與上述得到的132 個共有靶點上傳至Cytoscape 3.7.1 軟件，獲得檸檬苦素-靶點相互作用網(wǎng)絡圖，見圖2。

2.2 大葉桃花心木檸檬苦素治療糖尿病核心靶點分析

將得到的132 個共有靶點導入到String 數(shù)據(jù)庫中，最低相互作用閾值取 “medium confidence”（≥0.4）的靶點獲得蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡關系，再將String 數(shù)據(jù)庫中獲得的相關數(shù)據(jù)導入Cytoseape 3.7.1軟件，調(diào)整后得到藥物與疾病的蛋白相互作用圖，見圖3。該網(wǎng)絡中包含132 個節(jié)點和1 050 條邊，平均節(jié)點度值為15.9。其中，度值較大的靶點有TNF、AKT1、SRC、EGFR、STAT3 等，可認為這些靶點是大葉桃花心木檸檬苦素發(fā)揮藥效治療糖尿病的關鍵靶點，見表3。

表3 檸檬苦素治療糖尿病的關鍵靶點信息Tab. 3 Information on key targets of limonoids in the treatment of diabetes

2.3 GO 富集分析

將符合條件的靶點利用clusterProfiler 程序包進行GO 功能富集分析。以P＜ 0.05 為篩選條件，通過R語言繪制氣泡圖進行可視化處理。排名前10 的GO功能富集分析結(jié)果，見圖4。GO 富集分析主要是從生物過程（BP）分析、分子功能（MF）分析和細胞組分（CC）分析三個部分來描述基因功能。GO-BP的分析結(jié)果進行統(tǒng)計學分析并按照相關度排列，發(fā)現(xiàn)大葉桃花心木檸檬苦素主要通過信號釋放（signal release）、對藥物的反應（response to drug）、肽基-酪氨酸磷酸化（peptidyl-tyrosine phosphorylation）等生物過程發(fā)揮對糖尿病的治療作用；GO-CC 結(jié)果發(fā)現(xiàn)大葉桃花心木檸檬苦素主要通過調(diào)節(jié)膜筏（membrane raft）、膜筏微區(qū)（membrane microdomain）、神經(jīng)元胞體（neuronal cell body）等細胞組分來發(fā)揮治療糖尿病的作用；GO-MF 分析結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)大葉桃花心木檸檬苦素主要通過調(diào)節(jié)蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）、內(nèi)肽酶活性（endopeptidase activity）、蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）等分子功能發(fā)揮治療糖尿病的作用。

2.4 KEGG 通路富集分析

將上述得到的132 個共同靶點利用clusterProfiler程序包進行KEGG 通路富集分析。同樣以P＜0.05為篩選條件，選擇其中顯著性最大的20 條通路通過R 語言繪制柱狀圖進行可視化處理，見圖5。

KEGG分析結(jié)果表明，共獲得158條富集通路（P＜0.05）。排名靠前的20 條通路如圖5 所示。為整體考察基因與通路之間的關系，我們?nèi)∫陨细患潭茸铒@著的10 條通路做藥物-靶點-通路相互作用網(wǎng)絡，見圖6。由圖可知，一條通路可以富集到多個基因，而一個基因又可以同時出現(xiàn)在多條通路上，表明大葉桃花心木檸檬苦素是通過多通路、多靶點來治療糖尿病。另外，我們以大葉桃花心木檸檬苦素參與胰島素信號通路為例，利用R 語言繪制靶點在關鍵通路中發(fā)揮作用過程可視化圖，見圖7，紅色靶點代表大葉桃花心木檸檬苦素中活性成分的關鍵靶點在該信號通路中所參與的過程，這些靶點在該信號通路中起著關鍵作用。表明這些關鍵通路可以作為研究大葉桃花心木檸檬苦素治療糖尿病的方向。

2.5 成分-靶點分子對接及驗證結(jié)果

選取度值前5 的關鍵靶點和其對應的化合物進行了分子對接驗證，見表4。結(jié)合能小于0，說明受體分子與配體分子能自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能絕對值越高，對接能力越強，對接后的分子越穩(wěn)定。對接結(jié)果顯示大葉桃花心木檸檬苦素與糖尿病受體蛋白的結(jié)合能均小于-6 kcal/mol，說明大葉桃花心木檸檬苦素與關鍵靶點能較穩(wěn)定的結(jié)合。分子對接可視化結(jié)果見圖8。

表4 成分-關鍵靶點的分子對接結(jié)果表Tab. 4 Molecular docking results of components and key targets

3 討論

通過檢索文獻并利用網(wǎng)絡藥理學數(shù)據(jù)庫進行活性篩選，共有26 個大葉桃花心木檸檬苦素通過篩選。其中部分化合物已有實驗證實其降糖效果。LAU W K 等[12]研究表明6-O-acetylswietenolide 可以通過增加GLUT4 向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運誘導肌細胞攝取葡萄糖，從而達到降低血糖的效果；DUAN J Y 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，6-deoxyswietenine、swietenolide、proceranolide 等對胰島素抵抗的HepG2 細胞有更好的促進作用，swietenolide能顯著提高胰島素抵抗HepG2 細胞PPARγ 蛋白的表達。另外，通過成分-靶點網(wǎng)絡圖可以得到，6-deoxyswietemahonin A、3-O-acetylswietenolide、swieteliacate B、fissinolide、proceranolide 等化合物節(jié)點度值較高，這也提示這幾個化合物可能有著更好的降糖作用，有待進一步研究。

大葉桃花心木檸檬苦素治療糖尿病的蛋白相互作用網(wǎng)絡結(jié)果提示TNF、AKT1、SRC、EGFR、STAT3 可能是大葉桃花心木檸檬苦素發(fā)揮藥效治療糖尿病的關鍵靶點。其中，TNF 可以損傷胰島β 細胞，抑制胰島素信號的傳遞，進而引起胰島素抵抗[14]；AKT1 作為胰島素信號傳遞的經(jīng)典因子，可以改善外周細胞中糖代謝的表達水平[15]；SRC 是一種非受體絡氨酸激酶，對神經(jīng)元的增殖和分化有著重要的生理作用[16]；EGFR 可通過多條途徑進行信息傳遞，其激活可增加體內(nèi)胰島素循環(huán)，增加胰島素巨噬細胞胰島自噬，可以維持胰島結(jié)構(gòu)和功能[17]；STAT3 可參與各種機制，可以在心肌梗死、肥厚、糖尿病性心肌病時起到心臟保護作用[18]。

為了闡明以上篩選出的關鍵靶點在基因功能和信號通路中的作用，本次研究中對大葉桃花心木檸檬苦素治療糖尿病的關鍵靶點進行了通路富集分析。其中，胰島素信號通路主要是由PI3K/Ras/MAPK2 等多種途徑介導發(fā)揮效應，當胰島素信號通路異常時，可引發(fā)炎癥因子、信號傳導因子、脂肪細胞因子等分泌異常干擾胰島素傳遞從而導致胰島素抵抗，胰島素抵抗是引發(fā)糖尿病及其并發(fā)癥的主要機制之一[19]；有研究表明，糖尿病與前列腺癌有一定的關系，糖尿病患者體內(nèi)激素如睪酮、胰島素的改變，可通過PIK3/AKT 途徑促進前列腺癌的發(fā)生和進展[20]；神經(jīng)活性配體－受體相互作用通路可通過調(diào)節(jié)降糖蛋白作為調(diào)節(jié)糖尿病蛋白的主要通路[21]。鈣離子信號通路是參與調(diào)控胰島β 細胞增殖和調(diào)亡的重要通路，當鈣離子信號通路相關蛋白被激活，可以增加胰島β 細胞增殖，促進胰島素分泌[22]；另外，GO 富集分析MF、BP、CC 預測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大葉桃花心木檸檬苦素可能存在多種途徑干預糖尿病的治療或病程發(fā)展。

分子對接結(jié)果顯示關鍵靶點與其對應化合物結(jié)合能均小于-6 kcal/mol。可視化結(jié)果表明，蛋白質(zhì)受體與活性成分配體多是以氫鍵、疏水鍵等產(chǎn)生穩(wěn)定結(jié)合；分子對接結(jié)果驗證表明，共晶配體與蛋白質(zhì)對接，RMSD 值均＜2.0 ?，說明對接方法可靠。

4 結(jié)論

本研究首次利用網(wǎng)絡藥理學方法和分子對接技術初步闡明了大葉桃花心木檸檬苦素通過多靶點，多通路的方式來治療糖尿病的作用機制。篩選得到大葉桃花心木檸檬苦素化合物26 個，取交集后得藥物治療糖尿病的靶點132 個。并分析得到TNF、AKT1、SRC 等可能是檸檬苦素治療糖尿病的關鍵靶點。但是本次研究僅是在大數(shù)據(jù)背景下探討了大葉桃花心木檸檬苦素治療糖尿病可能的活性成分及機理，為后續(xù)研究提供一定的理論依據(jù)，后期仍需開展體內(nèi)外活性實驗對結(jié)果的可靠性加以驗證。