唐浩宇, 劉靖濤, 謝佼昕, 羿超群,3, 劉曉旭,3, 張永軍,*, 孫 洋

(1. 安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重要生物資源保護與利用研究安徽省重點實驗室, 分子酶學(xué)與重大疾病機理研究安徽省重點實驗室,安徽蕪湖 241000; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室,北京 100193;3. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院, 河北保定 071000)

昆蟲嗅覺系統(tǒng)主要由中樞嗅覺系統(tǒng)和外周嗅覺系統(tǒng)兩部分組成(Ong and Stopfer, 2012)，在昆蟲識別外界信號過程中，氣味結(jié)合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)、氣味受體(odorant receptors, ORs)、離子型受體(ionotropic receptors, IRs)、味覺受體(gustatory receptor, GRs)以及昆蟲感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins, SNMPs)等嗅覺相關(guān)蛋白發(fā)揮著至關(guān)重要的作用(Clyneetal., 1999; Coutoetal., 2005; Bentonetal., 2009; Leal, 2013; Joseph and Carlson, 2015; Zhangetal., 2016; Wangetal., 2017)。

1981年，第一個昆蟲OBPs在多音天蠶蛾Antheraeapolyphemus觸角中被鑒定，此后發(fā)現(xiàn)OBPs廣泛存在于其他不同的昆蟲種中(Vogt and Riddiford, 1981)。 OBPs是一類水溶性酸性蛋白，全長約120～160個氨基酸，相對分子量較小，一般為15～20 kD， 序列中有6個保守的半胱氨酸位點(Pelosi and Maida, 1995)。OBPs的主要功能是特異性識別并結(jié)合外界環(huán)境中的氣味分子，運輸脂溶性的氣味分子穿過水溶性的感受器淋巴液到達嗅覺神經(jīng)元樹突膜上的受體，引發(fā)后續(xù)的感受行為(Fanetal., 2011)。目前已經(jīng)從鞘翅目瓢甲科的七星瓢蟲Coccinellaseptempunctata(楊雪嬌等, 2020)、異色瓢蟲Harmoniaaxyridis(韓世鵬等, 2019)、孟氏隱唇瓢蟲Cryptolaemusmontrouzieri(潘暢等, 2016)等鑒定了大量OBPs。研究發(fā)現(xiàn)，孟氏隱唇瓢蟲的CmonOBP2(潘暢等, 2016)、異色瓢蟲的HaxyOBP2(Quetal., 2021)以及銅綠麗金龜Anomalacorpulenta的AcorOBP2(Chenetal., 2019)均在頭部或觸角中高表達。體外競爭結(jié)合實驗數(shù)據(jù)表明，大黑鰓金龜Holotrichiaoblita的HoblOBP2重組蛋白與α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、苯甲酸乙酯以及月桂烯等植物揮發(fā)物組分有較強的結(jié)合能力(Dengetal., 2011)。

多異瓢蟲Hippodamiavariegata屬鞘翅目(Coleoptera) 瓢甲科(Coccinellidae)，是北方農(nóng)田中優(yōu)勢捕食性天敵昆蟲。田間的多異瓢蟲通過其敏銳的嗅覺系統(tǒng)，追蹤植物和植食性害蟲釋放的揮發(fā)物信號來準(zhǔn)確定位多種獵物，在這一過程中多異瓢蟲氣味結(jié)合蛋白等相關(guān)化學(xué)感受蛋白發(fā)揮了重要作用。近年來，有關(guān)多異瓢蟲的研究多集中在生物學(xué)特性 (姜巖等, 2022)、殺蟲劑毒性研究以及捕食功能反應(yīng)(Maryametal., 2020)等方面，而多異瓢蟲的嗅覺相關(guān)蛋白的功能研究鮮有報道。

本研究團隊前期通過成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析，從多異瓢蟲鑒定出包括HvarOBP2在內(nèi)的12個OBP基因，并陸續(xù)開展功能研究。組織表達譜分析發(fā)現(xiàn)HvarOBP2在雌雄成蟲觸角中特異性高表達(未發(fā)表數(shù)據(jù))，推測其可能具有重要的化學(xué)感受功能。本研究圍繞HvarOBP2的配體結(jié)合特性進行研究，克隆了HvarOBP2開放閱讀框(open reading frame, ORF)，原核表達并純化后得到了重組HvarOBP2蛋白，通過熒光競爭結(jié)合實驗研究了重組HvarOBP2蛋白與40種候選植物揮發(fā)物組分以及24種蚜蟲相關(guān)揮發(fā)物組分的結(jié)合能力，解析其配體結(jié)合特征，以期闡明多異瓢蟲氣味結(jié)合蛋白的化學(xué)感受功能，為天敵昆蟲保護利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx及組織收集

多異瓢蟲成蟲采自新疆庫爾勒地區(qū)，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所廊坊科研中試基地建立室內(nèi)種群，飼養(yǎng)條件為溫度24±1℃，相對濕度60%±10%，光周期16L∶8D，以桃蚜Myzuspersicae飼喂并維持種群。收集羽化2-5 d的多異瓢蟲雌雄成蟲(各200頭)觸角，放入無RNA酶的1.5 mL離心管中，液氮迅速處理后置于-80℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 HvarOBP2基因的鑒定和序列分析

利用Illumina HiSeq 2500技術(shù)平臺對5日齡多異瓢蟲成蟲觸角進行轉(zhuǎn)錄組測序，共3次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)準(zhǔn)備雌、雄成蟲觸角各300對。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)建立本地數(shù)據(jù)庫，并在GenBank中下載其他鞘翅目昆蟲的OBPs核酸序列作為“query”，利用軟件TBtools 1.098685中 BLASTN程序確定多異瓢蟲的候選OBPs基因，所有候選OBPs再通過NCBI網(wǎng)站上的BLASTX程序進行驗證(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)(Wangetal., 2020)，使用Expasy(https:∥web.expasy.org/compute_pi/)(蘇旭等, 2019)預(yù)測蛋白分子量及等電點，使用SignalP-5.0 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號肽(Bendtsenetal., 2004)。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

用勻漿器在液氮中研磨收集好的多異瓢蟲觸角，采用Trizol試劑提取總RNA，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳和IMPLEN超微量分光光度計NanoPhotometer N60檢測總RNA的質(zhì)量和濃度。以提取的總RNA為模板，采用FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。

1.4 HvarOBP2開放閱讀框擴增

根據(jù)HvarOBP2序列設(shè)計特異性引物(正向引物: 5′-ATGTTCAAATTTTTATTTTTGGTTTCTTG-3′; 反向引物: 5′-TCAATGGATAAAAGCTGCATTCAA-3′)，以1.3節(jié)合成的cDNA第1鏈為模板，擴增其ORF。PCR反應(yīng)體系: 2×Phanta Max Master Mix 25 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各2 μL, ddH2O 17 μL, cDNA模板4 μL。PCR擴增程序: 94℃預(yù)變性3 min; 94℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，通過Axygen膠回收試劑盒(康寧公司)回收PCR產(chǎn)物，然后連接至pCloneEZ-NRS-BluntAmp/HC(中美泰和公司)克隆載體上，轉(zhuǎn)化入TreliefTM5α(擎科生物公司)感受態(tài)細胞，測序獲得序列正確的質(zhì)粒。然后用信號肽預(yù)測程序SignalP-5.0 Server去除HvarOBP2基因的信號肽序列，設(shè)計特異性引物(正向引物: 5′-CACCGTGAGCGAACAATGGA-3′; 反向引物: 5′-TCAATGGATAAAAGCTGCATTCAA-3′)，以序列正確的質(zhì)粒為模板采用上述同樣PCR程序擴增其編碼區(qū)CDS。最后將PCR產(chǎn)物連接到pBM30(博邁德公司)表達載體，轉(zhuǎn)化至TreliefTM5α感受態(tài)細胞，測序驗證獲得序列正確質(zhì)粒。

1.5 HvarOBP2重組蛋白表達與純化

將pBM30/HvarOBP2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入蛋白表達宿主細胞BL21(DE3)中，挑取單克隆菌株于含有30 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，置于搖床37℃ 220 r/min震蕩培養(yǎng)3～4 h。當(dāng)大腸桿菌Escherichiacoli細胞數(shù)達到對數(shù)生長期(OD值0.6～0.8)時，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，使其終濃度為1 mmol/L，加入質(zhì)量濃度10%的葡萄糖溶液使其終濃度為1%。于37℃ 200 r/min搖床中誘導(dǎo)8 h。超聲波破碎菌體，分別收集上清和沉淀，經(jīng)20% SDS-PAGE電泳檢測，發(fā)現(xiàn)目的蛋白以包涵體的形式存在于沉淀中。采用氧化還原法(Prestwich, 1993)進行包涵體的復(fù)性和重折疊，然后用通過親和層析、超濾以及透析等步驟進行純化(Guetal., 2013)，獲得目的HvarOBP2重組蛋白。

1.6 熒光競爭結(jié)合實驗

以40種植物揮發(fā)物組分和24種蚜蟲相關(guān)揮發(fā)物組分作為候選配體 (表1)，在F-380型熒光分光光度計上檢測HvarOBP2重組蛋白與熒光探針及配體的結(jié)合能力。熒光探針N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine, 1-NPN)溶于HPLC級的甲醇中，所用容器為石英熒光比色皿。儀器激發(fā)波長設(shè)置337 nm，掃描發(fā)射波長范圍380～500 nm。在10 mmol/L的PBS緩沖液中加入HvarOBP2重組蛋白，使其終濃度為2 μmol/L，隨后加入熒光探針1-NPN，使終濃度由2 μmol/L遞增至20 μmol/L，記錄熒光值最大讀數(shù)，3次重復(fù)，計算HvarOBP2重組蛋白與1-NPN的解離常數(shù)(Ki)。

在熒光石英比色皿中加入PBS緩沖液，分別加入HvarOBP2重組蛋白與熒光探針1-NPN，使其終濃度均為2 μmol/L，等待約30 s，待熒光強度穩(wěn)定后，記錄最大熒光強度，然后將溶于甲醇的氣味配體逐次加入到比色皿中，濃度由2 μmol/L遞增至 32 μmol/L，記錄熒光強度變化情況，3次重復(fù)。利用Scatchard方程計算HvarOBP2重組蛋白與氣味配體的Ki。計算公式為：Ki=[IC50]/(1+[1-NPN]/K1-NPN)，其中[1-NPN]為未結(jié)合的1-NPN濃度，K1-NPN代表HvarOBP2與探針的Ki(Guetal., 2011)。

1.7 HvarOBP2三維結(jié)構(gòu)模擬及分子對接

將HvarOBP2氨基酸序列以FASTA格式輸入到三維模型預(yù)測工具trRosetta (https:∥yanglab.nankai.edu.cn/trRosetta/)，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)中篩選適當(dāng)?shù)哪０?。然后用軟件AutoDock Vina 1.1.2解析HvarOBP2與配體(β-紫羅蘭酮、鄰苯二甲酸二丁酯、油酸和橙花叔醇)的結(jié)合方式，最后使用PyMOL1.9.0 (http:∥ www.pymol.org/)進行分子對接模擬。

2 結(jié)果

2.1 HvarOBP2基因的克隆及序列特征

擴增獲得多異瓢蟲HvarOBP2(GenBank登錄號: OK340816)的開放閱讀框，長約447 bp，與預(yù)期結(jié)果一致，編碼148個氨基酸殘基，N端有17個氨基酸組成的信號肽，預(yù)測成熟蛋白分子量為14.56 kD，等電點為5.48，具有6個保守的半胱氨酸位點(圖1)，符合公式C1-X20-66-C2-X3-C3-X21-43-C4-X8-14-C5-X8-C6，屬于classical OBPs亞家族。

圖1 多異瓢蟲HvarOBP2與其他鞘翅目昆蟲OBPs序列多重比對

2.2 HvarOBP2的重組表達

SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明，HvarOBP2重組蛋白主要以包涵體形式表達，純化后的蛋白分子量約14.5 kD，與預(yù)測結(jié)果一致(圖2)。

圖2 HvarOBP2重組蛋白SDS-PAGE分析

2.3 HvarOBP2氣味配體結(jié)合特征

重組蛋白HvarOBP2與熒光探針1-NPN的結(jié)合曲線及Scatchard方程(圖3: A)顯示兩者具有結(jié)合能力且具有飽和效應(yīng)，(Ki值)為 5.23±0.54 μmol/L。HvarOBP2與植物揮發(fā)物組分油酸(Ki=1.68±0.04 μmol/L)、鄰苯二甲酸二丁酯(Ki=8.77±0.19 μmol/L)、橙花叔醇(Ki=15.93±0.33 μmol/L)和β-紫羅蘭酮(Ki=10.79±0.24 μmol/L)的結(jié)合能力較強，與其他候選的蚜蟲相關(guān)揮發(fā)物組分及植物揮發(fā)物組分的IC50值均大于50 μmol/L(圖3: B; 表1)，判定為不結(jié)合。

圖3 HvarOBP2重組蛋白與1-NPN(A)和候選配體(B)的結(jié)合曲線

表1 不同配體對重組蛋白HvarOBP2重組蛋白的IC50值和解離常數(shù)(Ki值)

續(xù)表1 Table 1 continued

2.4 HvarOBP2三維結(jié)構(gòu)預(yù)測及分子對接

從蛋白三維模型預(yù)測工具trRosetta推薦的模板中選擇家蠶信息素結(jié)合蛋白(PDB ID：1DQE)為HvarOBP2最合適的模板，TM-score為0.831，并使用蛋白結(jié)構(gòu)驗證服務(wù)器SAVES v6.0(https:∥saves.mbi.ucla.edu/)評價HvarOBP2模型的質(zhì)量，結(jié)果表明有85.81%的氨基酸殘基3D-1D得分大于等于0.2，表明該模型可被使用。預(yù)測的HvarOBP2模型由7個α-螺旋組成，分別位于Phe2-Ala17(α1), Glu20-Val41(α2), Glu45-Gly53(α3), His60-Leu73(α4), Lys84-Ala96(α5), Pro99-Ala117(α6), Lys122-Met140(α7)殘基之間。

選擇β-紫羅蘭酮、鄰苯二甲酸二丁酯、油酸以及橙花叔醇與預(yù)測的蛋白模板進行分子對接模擬(圖4)，結(jié)果顯示這些化合物能夠結(jié)合在HvarOBP2的疏水空腔內(nèi)并靠近大量疏水殘基。預(yù)測HvarOBP2重組蛋白與β-紫羅蘭酮、鄰苯二甲酸二丁酯、油酸、橙花叔醇的結(jié)合能分別為-8.1, -7.6, -7.2和-7.6 kcal/mol。HvarOBP2與不同配體對接過程中的關(guān)鍵結(jié)合氨基酸殘基均為疏水性殘基(表2)，其中Phe12和Phe118是與多個配體結(jié)合的氨基酸殘基，表明這兩個殘基在HvarOBP2和配體的結(jié)合過程中發(fā)揮重要作用。

圖4 利用PyMOL1.9.0進行的重組蛋白HvarOBP2與配體的分子對接模擬

表2 重組蛋白HvarOBP2對配體的關(guān)鍵氨基酸殘基的預(yù)測

3 討論

昆蟲氣味結(jié)合蛋白在與氣味分子的結(jié)合及傳遞過程中發(fā)揮重要作用，調(diào)控了昆蟲對化學(xué)信號的響應(yīng)，因此，功能性O(shè)BPs可作為篩選昆蟲引誘劑或驅(qū)避劑的作用靶標(biāo)(張雪等, 2021)。本研究發(fā)現(xiàn)多異瓢蟲HvarOBP2重組蛋白與β-紫羅蘭酮、鄰苯二甲酸二丁酯、油酸和橙花叔醇均具有較強的結(jié)合能力(圖3: A; 表1)。

β-紫羅蘭酮是植物體內(nèi)類胡蘿卜素底物氧化裂解產(chǎn)生的一種揮發(fā)性物質(zhì)，天然存在于番茄、棉花、甘藍、油菜等植物中(Gruberetal., 2009)。已有大量研究報道昆蟲氣味結(jié)合蛋白OBPs與β-紫羅蘭酮具有較強的結(jié)合能力。例如，苜蓿盲蝽Adelphocorislineolatus的OBP5與β-紫羅蘭酮有很強的結(jié)合 (朱曉強等, 2015)；甜菜夜蛾Spodopteraexigua的OBP1和OBP7與β-紫羅蘭酮也有不同程度的結(jié)合能力(Liuetal., 2017)。淡足側(cè)溝繭蜂Microplitispallidips的OBP8能夠與β-紫羅蘭酮強烈結(jié)合，隨后的Y型嗅覺儀及田間試驗證明β-紫羅蘭酮能夠吸引淡足側(cè)溝繭蜂(Zhangetal., 2022)。本研究發(fā)現(xiàn)多異瓢蟲HvarOBP2重組蛋白與β-紫羅蘭酮有較強的結(jié)合能力，Ki值為10.79±0.24 μmol/L(表1)，這一結(jié)果與秀麗金龜甲Hylamorphaelegans和中華蜜蜂Apisceranacerana的OBPs與β-紫羅蘭酮有較高結(jié)合力的結(jié)論 (Venthuretal., 2016; 吳帆等, 2016)是相似的。β-紫羅蘭酮在植物與昆蟲化學(xué)通訊的相互作用過程中發(fā)揮了重要作用。

鄰苯二甲酸二丁酯是桃Prunuspersica、梨Pyrusspp.及黑楊Populusnigra等植物葉片中的揮發(fā)性物質(zhì)(凌娜等, 2014; 李中珊, 2019)，先前的研究發(fā)現(xiàn)小地老虎Agrotisipsilon的AipCSP8及AipGOBP1和AipGOBP2均能夠與鄰苯二甲酸二丁酯有不同程度的結(jié)合能力(Huangetal., 2018; 蘇旭等, 2019)。本研究也發(fā)現(xiàn)HvarOBP2重組蛋白與鄰苯二甲酸二丁酯的結(jié)合能力較強，Ki值為 8.77±0.19 μmol/L(表1)。橙花叔醇與油酸分別屬于植物花香化合物與植物揮發(fā)物，其對HvarOBP2重組蛋白均有較強的結(jié)合能力，Ki值分別為15.93±0.33和1.68±0.04 μmol/L(表1)。

綜上，多異瓢蟲能夠通過HvarOBP2感受植物揮發(fā)物組分β-紫羅蘭酮、鄰苯二甲酸二丁酯、橙花叔醇與油酸等來定位寄主植物和蚜蟲棲息地。后續(xù)的研究中我們將進一步利用RNAi或基因編輯手段明確HvarOBP體內(nèi)調(diào)控功能，獲得與HvarOBP強結(jié)合的β-紫羅蘭酮、鄰苯二甲酸二丁酯、油酸、橙花叔醇等植物揮發(fā)物組分可以用來設(shè)計引誘組合增強多異瓢蟲獵物搜尋和定位的能力。