朱潤濤，鐘超，戴卓君

（中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所，廣東 深圳 518055）

1 細(xì)菌生物被膜的軟物質(zhì)特性、動(dòng)態(tài)性以及異質(zhì)性

細(xì)菌生物被膜（bacterial biofilm），是指細(xì)菌黏附于接觸表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等，并將其自身包繞其中而形成的大量細(xì)菌聚集膜樣物［1-2］。細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境所產(chǎn)生的有利于生存的一種生命現(xiàn)象，由微生物及其分泌物積聚而形成，其形成過程主要包括黏附、增殖、聚集、成熟和分離幾個(gè)主要階段。在自然界中，生物被膜可出現(xiàn)在包括自然、人工及宿主體內(nèi)環(huán)境的任何生態(tài)系統(tǒng)。生物被膜的形成對(duì)于微生物在惡劣環(huán)境下存活具有諸多優(yōu)勢(shì)。首先，生物被膜胞外基質(zhì)覆蓋在菌落表面形成保護(hù)屏障，使生物被膜細(xì)胞免受外界環(huán)境（例如抗生素）的攻擊；其次，細(xì)菌可通過生物被膜的群落間隙獲得營養(yǎng)及排除廢物；同時(shí)，生物被膜內(nèi)部可以富集多種酶，實(shí)現(xiàn)對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的代謝以及有害物質(zhì)的降解［2-3］。

自21世紀(jì)初，生物被膜逐步被視為一種潛在的生物材料。這種認(rèn)知部分來源于生物被膜的軟物質(zhì)特性［4-5］。從軟物質(zhì)物理的角度，生物被膜可被視為一種嵌入了膠體顆粒的交聯(lián)高分子凝膠復(fù)合體：交聯(lián)高分子凝膠復(fù)合體主要對(duì)應(yīng)于胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM），而生物被膜中的細(xì)菌則充當(dāng)了具有著球形、棒狀等具有明確形狀特性的剛性顆粒［6-7］。胞外基質(zhì)由細(xì)菌分泌，主要由多糖及蛋白組成。其中，多糖扮演胞外基質(zhì)的主體：當(dāng)大分子量、負(fù)電荷的多糖（105～106g/mol）在足夠高的濃度下時(shí)，分子鏈發(fā)生纏結(jié)；同時(shí)，多糖鏈間也形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，例如局部的結(jié)晶域等；同時(shí)，負(fù)電荷的多糖鏈也可被環(huán)境中的正電荷離子交聯(lián)；蛋白也可作為交聯(lián)劑進(jìn)一步交聯(lián)多糖大分子。這些纏結(jié)、氫鍵及正負(fù)電荷等相互作用構(gòu)成并促成了生物被膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

大部分生物被膜中的細(xì)菌缺乏鞭毛或菌毛，且在低于細(xì)胞分裂周期的時(shí)間段里保持?jǐn)?shù)量的穩(wěn)定。但是，細(xì)菌直接參與了生物被膜性質(zhì)的調(diào)控。例如，其在特殊環(huán)境下可分泌大量的胞外基質(zhì)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物被膜通透性、力學(xué)性能等的調(diào)控，另一方面，細(xì)菌又可分泌信號(hào)分子、表面活性劑等，使其與其他細(xì)菌進(jìn)行通信等，對(duì)生物被膜的性質(zhì)（例如被膜大小、結(jié)構(gòu)異質(zhì)性等）進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)控。在細(xì)菌與胞外基質(zhì)的綜合作用下，生物被膜表現(xiàn)出兼具固體彈性和流體黏滯性的綜合流變性質(zhì)的軟物質(zhì)特性［4，8］（表1）。也就是說，對(duì)于外界加載或移除的應(yīng)力，其產(chǎn)生的應(yīng)變具有時(shí)間變化過程。其中，有兩個(gè)重要的參數(shù)可以作為黏彈性的重要表征值，一個(gè)是彈性模量，它對(duì)應(yīng)于材料的彈性部分，可以衡量在一定外力下產(chǎn)生的形變；另一個(gè)則是松弛時(shí)間，反映材料黏性及彈性部分的共同特性，衡量特定形變下物體內(nèi)部應(yīng)力松弛的特征時(shí)間。目前使用的大多數(shù)材料都是具有黏彈性的特征，例如橡膠及水凝膠等［24-25］。生物被膜的黏彈性賦予其在材料學(xué)方面潛在應(yīng)用前景，卻又與聚合物材料有著明顯區(qū)別。如前所述，生物被膜的細(xì)菌可分泌包括群體感應(yīng)小分子等在內(nèi)的多種物質(zhì)。在細(xì)菌、高分子、交聯(lián)劑和小分子等多種物質(zhì)的協(xié)同作用下，生物被膜被賦予了獨(dú)特的動(dòng)態(tài)性以及異質(zhì)性［26-27］。例如，生物被膜的邊緣與中心區(qū)域，表面與底層表現(xiàn)出截然不同的生物組成、含水量以及機(jī)械強(qiáng)度。而作為一種活的黏彈性材料，生物被膜的流變性能也受到活體微生物的調(diào)控。例如Shaw等［21］研究了44種不同的生物被膜。盡管不同生物被膜的剪切模量和黏度差別很大，但卻具有相似的彈性松弛時(shí)間（約18 min）。這一松弛時(shí)間被認(rèn)為與生物被膜生長過程中細(xì)菌的倍增時(shí)間相關(guān)。從軟物質(zhì)特性來說，松弛時(shí)間越慢越有利于維持生物被膜整體的穩(wěn)定性，然而從生物生長及進(jìn)化的意義（例如抵御突然的環(huán)境變化）來說，這一時(shí)間又要快于細(xì)胞分裂時(shí)間，而這18 min的彈性松弛時(shí)間恰巧是兩者間的平衡。由此，即使具有良好的軟物質(zhì)特性，但由于生物被膜成分復(fù)雜、各向異質(zhì)以及難于調(diào)控等問題，使其難以成為理想的工程化材料。

表1 不同生物被膜在室溫條件下的彈性模量、黏度Tab.1 Viscoelasticity of different biological and synthetic materials at room temperature

2 curli形成的機(jī)制與調(diào)控

在生物被膜的繁雜組分中，curli是一種具代表性的淀粉樣蛋白纖維［28］。關(guān)于諸多腸桿菌科生物被膜curli形成機(jī)制及調(diào)控研究，從20世紀(jì)末起始至21世紀(jì)初已呈現(xiàn)出清晰的脈絡(luò)。一方面，curli的分泌和組裝是生物被膜表面黏附和細(xì)菌集聚等過程的重要步驟［29］，因此，分析生物被膜curli的分泌與組裝機(jī)制是解碼細(xì)菌被膜致病性的關(guān)鍵；另一方面，curli在結(jié)構(gòu)及生物化學(xué)的層面上被歸類于淀粉樣蛋白纖維。因此，針對(duì)其組裝機(jī)制的研究對(duì)如阿爾茲海默病等神經(jīng)退行性疾病，具有重大的借鑒價(jià)值［30-31］。當(dāng)然，10年后，這些研究成果在與合成生物學(xué)技術(shù)結(jié)合后，也在工程化生物被膜的系列研究中大放異彩。

在curli的生產(chǎn)與組裝中，至少7個(gè)蛋白參與這一過程（圖1），這7個(gè)蛋白分布在2個(gè)反相轉(zhuǎn)錄的操縱子上［35］。在大腸桿菌中，它們分別是csgBAC及csgDEFG［36］。而在沙門氏菌中也發(fā)現(xiàn)了同源的基因（agfBA及agfDEFG，沙門氏菌中的淀粉樣蛋白被稱為Tafi，一些文獻(xiàn)也統(tǒng)一稱其為curli）［26］。csgBAC操縱子表達(dá)形成curli的主要單體CsgA和成核蛋白CsgB［37］，以及可以抑制CsgA在胞內(nèi)提前形成淀粉樣蛋白的CsgC［30］。CsgA及CsgB蛋白具有相似的分子量并存在著30%的序列同源性［30］。在CsgB無表達(dá)時(shí)，被分泌到胞外的CsgA無法進(jìn)行組裝［38］。有趣的是，在大腸桿菌中，CsgA和CsgB不需要由同一個(gè)細(xì)胞表達(dá)，缺乏CsgB表達(dá)細(xì)菌可分泌CsgA（供體），而CsgA可在只表達(dá)CsgB的細(xì)菌（受體）表面組裝curli，供體細(xì)菌與受體細(xì)菌的距離在厘米尺度依然有效［37，39］。

圖1 curli形成的分子機(jī)制［Sec通路可將尚未折疊的CsgA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)，同樣也可轉(zhuǎn)運(yùn)CsgB-C和CsgE-F跨越細(xì)菌內(nèi)膜（a）［31］。當(dāng)CsgA被封閉在CsgG-CsgE腔中時(shí)，由于墑增效應(yīng)使得CsgA由密閉籠子擴(kuò)散至外膜（b）［32］。CsgB可引發(fā)外膜表面CsgA單體成核和聚合形成curli系統(tǒng)（c）［33］。組成curli系統(tǒng)的成熟CsgA單體是典型的β折疊結(jié)構(gòu)（d）［34］］Fig.1 The molecular mechanism for curli formation[An unfolded CsgA monomer enters the periplasm via the Sec translocon,and CsgB-C and CsgE-F are transported cross the inner membrane(a);A subunit CsgA encapsulated by a chamber of the CsgG:CsgE complex is secreted over outer membrane,which is driven by entropy increase(b);CsgB nucleated polymerization of a soluble subunit CsgA can assemble into a curli system(c);As the major subunit of the curli fiber,the mature CsgA protein is with a β-sheet-turn-β-sheet conformation(d)]

csgDEFG操縱子上的4個(gè)基因，同樣在curli形成機(jī)制中起到關(guān)鍵作用［40］。CsgD參與CsgA及CsgB的 表達(dá) 調(diào) 控［41-42］；CsgE［32］、CsgF［43］以 及CsgG［43-46］是分泌通道復(fù)合物的組成成分，負(fù)責(zé)特異性識(shí)別和分泌CsgA與CsgB。其中CsgG是一種外膜磷脂蛋白，其作用是保證CsgA和CsgB的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及協(xié)助其跨膜分泌［47］，純化的CsgG可自組裝成與其他通道蛋白類似的外膜環(huán)狀的寡聚體［44］。CsgE與CsgF都是 細(xì)胞 周質(zhì) 蛋白，且 與CsgG蛋白形成復(fù)合體［44］。2020年，科研人員通過冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)的方法解析了復(fù)合物CsgFG以及底物結(jié)合的通道復(fù)合物CsgFGCsgAN22的高分辨率結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)分析顯示CsgF與CsgG形成9∶9結(jié)合的雙孔道復(fù)合物，CsgF的N端插入CsgG的β桶內(nèi)部，并與CsgG相互作用。體外蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了兩者相互作用，CsgF的C端與CsgB相互作用。進(jìn)一步的體外蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示CsgB結(jié)合CsgA，CsgF不結(jié)合CsgA。綜合電鏡結(jié)構(gòu)和體外蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，課題組提出了CsgG-CsgF（N端）-CsgF（C端）-CsgB-CsgA的組裝方式，闡明curli纖維與細(xì)菌表面的結(jié)合機(jī)制［48］。這一系列對(duì)curli形成分子機(jī)制的解析工作，不僅對(duì)調(diào)控微生物黏附、研究淀粉樣蛋白聚集起到積極作用，更對(duì)未來的合成生物學(xué)工程化curli系統(tǒng)，提供生物模塊以及系統(tǒng)調(diào)試提供了知識(shí)儲(chǔ)備。

3 curli為代表的工程化生物被膜：合成生物學(xué)技術(shù)參與的活體材料

2000年，Gardner等［49］構(gòu)建的基因撥動(dòng)開關(guān)，以及同期在Nature發(fā)表的Elowitz和Leibler［50］設(shè)計(jì)的振蕩器：利用3個(gè)基因模塊彼此間的抑制和解抑制作用，實(shí)現(xiàn)規(guī)律振蕩信號(hào)輸出的工作正式宣告合成生物學(xué)這一學(xué)科的誕生。通過在細(xì)胞中植入合成基因線路并給予外界信號(hào)輸入，工程細(xì)胞可以識(shí)別、處理和整合輸入的信號(hào)，并給予信號(hào)輸出從而實(shí)現(xiàn)特定的生物功能［51-53］。之后的15年里，合成生物學(xué)快速發(fā)展，積累了包括細(xì)胞編輯和底盤細(xì)胞改造等方法與手段，產(chǎn)生了大量的元器件、基因線路以及特定性能的工程細(xì)胞［54-59］。時(shí)間撥到2014年，Lu實(shí)驗(yàn)室［60］通過敲除大腸桿菌自身的csgA基因，引入可控誘導(dǎo)表達(dá)的csgA線路，首次實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌表面蛋白纖維curli的可控組裝。該工作進(jìn)一步編輯csgA基因，將其融合親和多肽（His-tag）。組裝后的curli外展示出親和多肽，使纖維與納米金顆粒特異性結(jié)合，賦予了工程化大腸桿菌導(dǎo)電性。值得一提的是，作者構(gòu)建了aTc-CsgA-His和AHL-CsgA的正交誘導(dǎo)體系工程菌群，并利用前文提到curli的特性——即供體細(xì)菌可以分泌CsgA，而這些CsgA在表達(dá)CsgB的受體細(xì)菌（非同一菌株）表面組裝curli。在菌群共培養(yǎng)的過程中，通過改變兩種菌初始濃度的比例以及誘導(dǎo)物的濃度，使得CsgA-His或者CsgA單體在具有CsgB的表面組裝嵌段共聚物，巧妙地把curli生物學(xué)特性與合成生物學(xué)工具結(jié)合，展現(xiàn)了活體功能材料可編程的特性。

這篇文章的發(fā)表正式拉開了合成生物學(xué)活體功能材料領(lǐng)域的序幕，并迅速涌現(xiàn)了一大批圍繞著工程化curli體系組裝活體材料或生物材料的佳作。這些工作可以分為以下3個(gè)方面：①與CsgA融合各種蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)對(duì)curli的功能修飾；②利用大腸桿菌生產(chǎn)curli并剝離curli作為生物材料；③構(gòu)建操縱系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)curli組裝的多層級(jí)調(diào)控。下文將具體介紹這幾個(gè)方面的代表性工作。

3.1 curli的功能修飾

通過將蛋白功能域與CsgA融合表達(dá)，讓功能域隨CsgA組裝與分泌，完成對(duì)curli功能化，是實(shí)現(xiàn)curli系統(tǒng)修飾的主流方法（表2）。2014年，Lu課題組［35］進(jìn)一步將貽貝足蛋白（mussel foot proteins，Mfps）與CsgA進(jìn)行融合，組裝兼具水下黏合性的高強(qiáng)度活體功能材料。同年，Joshi課題組［68］將含有6～59個(gè)氨基酸的多個(gè)功能域分別與CsgA構(gòu)成融合蛋白，對(duì)curli系統(tǒng)的外展示能力進(jìn)行測(cè)試［圖2（a）］。這些功能域包括親和標(biāo)簽（His、FLAG）、蛋白展示標(biāo)簽（SpyTag）、底物親和標(biāo)簽［MBD（結(jié)合不銹鋼表面）、GBP（結(jié)合石墨烯表面）等］。結(jié)果顯示：curli系統(tǒng)可成功展示含有59個(gè)氨基酸的蛋白功能域，并產(chǎn)生與功能域相關(guān)的特定功能，如針對(duì)金屬表面的貼合curli材料。2018年，Joshi課題組［69］將CsgA融合鑭系元素結(jié)合標(biāo)簽（LBT），構(gòu)建出curli-LBT回收過濾裝置，實(shí)現(xiàn)對(duì)鑭系元素特異性吸附，完成稀土元素高效回收。將活體材料引入到稀有金屬生產(chǎn)回收領(lǐng)域，發(fā)展出具備高速、高特異性和可擴(kuò)展的回收貴金屬方法。同年底，該課題組［77］通過將可治療炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease）的三葉肽（trefoil factors，TFFs）與csgA基因融合表達(dá)，使大腸桿菌益生菌Nissle 1917表面融合表達(dá)TFFs的curli［圖2（b）］。試驗(yàn)結(jié)果表明，將工程益生菌灌胃給老鼠后，工程益生菌形成的治療性材料會(huì)貼附在腸道的黏膜上，有效抑制由葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導(dǎo)的腸炎［77］。在這一系列工作中，通過替換蛋白功能域，將具有親和特性、黏合特性以及治療特性的短肽與CsgA單體進(jìn)行融合表達(dá)，便可組裝具有特定功能的curli材料，充分體現(xiàn)活體材料的可編程性。

表2 CsgA融合結(jié)構(gòu)域單元實(shí)現(xiàn)curli功能修飾Tab.2 Domains-fused CsgA functionalizes curli

然而，受制于curli系統(tǒng)分泌的局限性，大尺寸標(biāo)簽蛋白或功能域會(huì)影響蛋白單體的分泌與組裝。對(duì)此，研究人員進(jìn)行多種嘗試，通過curli系統(tǒng)展示蛋白短肽，再利用非共價(jià)或共價(jià)作用將外源大蛋白與curli進(jìn)行連接，最終豐富了curli功能，并突破curli系統(tǒng)的分泌尺寸限制。例如，鐘超課題組［80］將SpyTag融合到curli系統(tǒng)，同時(shí)將海藻糖合成酶編輯到胞內(nèi)。首先將外源表達(dá)SpyCatcher-β-淀粉酶，利用SpyTag-SpyCatcher共價(jià)作用的特性，將β-淀粉酶修飾到curli表面，并進(jìn)一步將大腸桿菌無法利用的淀粉降解成可利用的麥芽糖，最后利用胞內(nèi)表達(dá)的海藻糖合成酶實(shí)現(xiàn)海藻糖合成［圖2（c）］。該工作巧妙地通過SpyTag-SpyCatcher系統(tǒng)將大分子量蛋白裝飾在curli系統(tǒng)，并通過胞外胞內(nèi)的協(xié)同作用，使大腸桿菌利用淀粉實(shí)現(xiàn)了生物制造。

圖2 與CsgA融合表達(dá)實(shí)現(xiàn)功能化curli系統(tǒng)（a）將可誘導(dǎo)CsgA-功能肽的蛋白基因線路導(dǎo)入csgA基因缺失型的宿主，可在細(xì)菌外膜自組裝形成展示多種功能肽段的工程化curli［68］；（b）通過將trefoil factors（TFFs）與CsgA進(jìn)行融合，可以組裝表面展示TFFs的curli，這種改造后的益生菌可直接用來治療腸炎［77］；（c）表面展示SpyTag的curli系統(tǒng)與標(biāo)記SpyCatcher的淀粉水解酶結(jié)合，將胞外淀粉降解成麥芽糖，運(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)后由胞內(nèi)的海藻糖合酶催化，實(shí)現(xiàn)淀粉的高效生物轉(zhuǎn)化及海藻糖的合成［80］Fig.2 Functionalization of curli via fusion with CsgA(a)Gene circuit containing inducible expression of CsgA(with subunits engineered to display various peptide tags)was transformed into a host strain with the endogenous csgA gene deleted;(b)Fusing CsgA with trefoil factors(TFFs)led to the formation of curli nanofibers displaying TTFs.The resultant material was proven to promote intestinal barrier function and epithelial restitution;(c)SpyTag displaying curli was fused with SpyCatcher decorated β-amylase.β-amylase converted the starch into maltose.The maltose was then transported intracellularly and further catalyzed into trehalose through the intracellularly expressed trehalase

3.2 利用大腸桿菌生產(chǎn)curli并剝離curli作為生物材料

以大腸桿菌作為細(xì)胞工廠，將curli或CsgA蛋白直接剝離或純化作為材料前體，是另一種生產(chǎn)工程化生物被膜材料的思路。2017年Joshi課題組［81］使用真空過濾的方法，首次實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)curli。由于curli具備對(duì)熱、洗滌劑、溶劑和變性劑的耐受性，因此在整個(gè)加工過程中，curli依舊維持良好的功能。作者以大腸桿菌為底盤細(xì)胞，創(chuàng)新地利用真空過濾的方法，最終達(dá)到curli材料宏觀化和規(guī)?；a(chǎn)的目的［圖3（a）］。在2021年，該課題組［82］同樣利用該體系組裝Aqualgel材料，使其可以進(jìn)行二維以及三維塑型，不僅能夠耐受酸堿和有機(jī)溶劑的侵蝕，而且具有良好的生物降解性。與此同時(shí)，還兼具生物活性材料的水下自愈合能力［圖3（c）］。

2019年，鐘超課題組［83］利用剝離curli以及體內(nèi)誘導(dǎo)胞內(nèi)表達(dá)CsgA的兩種方式，通過后處理分離出活性CsgA單體，完成在體外的材料組裝。課題組利用CsgA單體作為生物墨水，并使用體外溶劑進(jìn)行后處理，最終打印出穩(wěn)定蛛絲狀的結(jié)構(gòu)［圖3（b）］。CsgA-功能域構(gòu)成的纖維結(jié)構(gòu)可操控性強(qiáng)于胞外curli系統(tǒng)。例如將蛋白多肽修飾的CsgA進(jìn)行定制化的空間排布，并與量子點(diǎn)或熒光蛋白偶聯(lián)即可形成熒光點(diǎn)陣［83］，這種陣列的制造技術(shù)在生物芯片、高通量生物傳感器等領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力［84］。2020年，鐘超課題組［64］進(jìn)一步利用CsgA蛋白作為涂層材料，并探索其在導(dǎo)電器件和酶固定等方面的應(yīng)用。

圖3 利用大腸桿菌生產(chǎn)curli并剝離curli作為生物材料（a）利用大腸桿菌生產(chǎn)curli，隨后通過過濾的方法實(shí)現(xiàn)體外剝離，再通過溶解以及重復(fù)的形式可以進(jìn)行材料的進(jìn)一步加工處理［81］；（b）將大腸桿菌體表面的curli以及體內(nèi)表達(dá)的CsgA蛋白單體混合物，通過溶解與固化可將其塑型為多種圖案［83］；（c）通過剝離curli并進(jìn)一步加工成為水塑材料，其不但可以耐受多種有機(jī)溶劑及強(qiáng)酸強(qiáng)堿，還可以接合成多種三維形狀［82］Fig.3 Purified curli as the materials precursors(a)Curli fiber produced by E.coli were purified using a fast and easily accessible vacuum filtration procedure.The fibers were then disassembled,reassembled into thin films,and recycled for further materials processing[81];(b)Generation of diverse patterns with a generic amyloid monomer inks(consisting of genetically engineered biofilm proteins dissolved in hexafluoroisopropanol),along with methanol-assisted curing[83];(c)Aqua plastic was produced by casting and drying purified curli under ambient conditions[82].The resultant aqua plastic could withstand strong acid/base and organic solvents.In addition,aqua plastic could be healed and welded to form three-dimensional architectures using water

3.3 構(gòu)建操縱系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)curli組裝的多層級(jí)調(diào)控

以csgA作為報(bào)告基因，將其偶聯(lián)到其他基因線路，如圖案構(gòu)成、光操縱系統(tǒng)里，催生了更多有趣的工作。2017年游凌沖實(shí)驗(yàn)室［85］通過基因線路編輯細(xì)菌自組裝形成核殼結(jié)構(gòu)，并在基因線路下游引入csgA-His基因［63］，使得大腸桿菌菌落形成半球狀結(jié)構(gòu)時(shí)，蛋白纖維curli大量分布在半球的殼表面。通過Anti-His抗體與標(biāo)記納米金的二抗結(jié)合，形成有機(jī)-無機(jī)雜化核殼結(jié)構(gòu)。這種核殼結(jié)構(gòu)可以靈敏地感應(yīng)微小壓力，使三維自組裝材料實(shí)現(xiàn)壓力傳感器的功能。此工作巧妙地利用基因線路編輯細(xì)菌，使其自發(fā)地形成（selforganization）功能器件基礎(chǔ)的三維結(jié)構(gòu)，在利用基因線路編輯細(xì)菌，實(shí)現(xiàn)自組裝形成活體功能材料方面的突破。

2017年Voigt實(shí)驗(yàn)室［86］設(shè)計(jì)了由18個(gè)基因組成的基因回路：其中3個(gè)是編碼光敏蛋白的基因，可分別感應(yīng)紅（波長705 nm）、綠（波長535 nm）、藍(lán)（波長470 nm）3種波長的光（RGB系統(tǒng)）。不同波長光可以啟動(dòng)細(xì)菌合成不同色素。在此基礎(chǔ)上，2019年，該課題組［61］將光響應(yīng)的下游基因替換成3種不同修飾的csgA，從而利用不同波長光，誘導(dǎo)多功能特性的curli表達(dá)。通過調(diào)節(jié)不同波長的光組合，實(shí)現(xiàn)多功能curli的逐層可控組裝。該工作成功利用光控手段實(shí)現(xiàn)活體功能材料構(gòu)建，充分體現(xiàn)活體功能材料針對(duì)多環(huán)境因素的響應(yīng)能力。

4 總結(jié)與展望

在細(xì)菌與胞外基質(zhì)的綜合作用下，生物被膜表現(xiàn)出具有黏彈性的軟物質(zhì)特性，具備了類似于水凝膠的材料特性，也成為其可被加工成為材料的基礎(chǔ)。然而，生物被膜的組分復(fù)雜性以及各向異質(zhì)性，又與傳統(tǒng)材料具有顯著區(qū)別。在缺乏生物學(xué)改造的工具時(shí)，天然的生物被膜難以被打磨、調(diào)整以及根據(jù)應(yīng)用進(jìn)行定制化設(shè)計(jì)。當(dāng)以傳統(tǒng)的生物被膜作為材料這條道路似乎困難重重的時(shí)候，工程化生物被膜的思路一舉破解了其中諸多困擾。而這一步的核心是從生物被膜的諸多組分中剝離出curli這一核心成分，進(jìn)行工程細(xì)菌的編輯和改造。這一選擇與一直以來積累的有關(guān)curli調(diào)控的生物學(xué)機(jī)制研究密不可分。curli作為模塊化工具被成功驗(yàn)證，成為工程生物被膜的有效載體，并與合成生物學(xué)的功能模塊、調(diào)控元件、基因線路工具，包括功能肽、光控啟動(dòng)子庫、圖案編輯線路構(gòu)建等融合，這些組合賦予curli系統(tǒng)多樣化的功能。將工程生物被膜引入黏合材料、生物醫(yī)藥以及電子器件領(lǐng)域，帶動(dòng)活體功能材料領(lǐng)域的快速發(fā)生與發(fā)展，并相繼涌現(xiàn)出各式各樣的活體功能材料佳作。活體功能材料領(lǐng)域也進(jìn)一步拓展到工程化纖維素、工程生物與其他材料（高分子或彈性體）的復(fù)合物乃至人工光合體系［87-89］。生物的可編程性賦予了活體材料多樣化功能，生物分裂生長的特性也賦予材料自我生長及自修復(fù)的能力，而這些優(yōu)良特性卻為傳統(tǒng)材料所不具備［90-92］。在一系列場(chǎng)景：包括生物制劑的靈活制備、材料的自修復(fù)、活體構(gòu)筑材料的組裝，活體功能材料均可發(fā)揮其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［93-94］。

而另一方面，隨著活體功能材料這一領(lǐng)域的快速發(fā)展，也面臨越來越多的挑戰(zhàn)。例如，以生物為主體的材料在力學(xué)性能方面具有劣勢(shì)，活細(xì)胞在貧瘠或干燥環(huán)境中難以存活及生長。針對(duì)這些問題，學(xué)界做出了相應(yīng)的探索。例如通過合成高分子與活體生物進(jìn)行耦合提高活體材料的機(jī)械性能和穩(wěn)定性：用高分子網(wǎng)絡(luò)與工程生物進(jìn)行耦合［95］，或通過形成特定結(jié)構(gòu)（例如互穿聚合物等）提高材料的動(dòng)態(tài)模量以及抗擾動(dòng)能力［96］；針對(duì)養(yǎng)分匱乏環(huán)境中的活體材料會(huì)失去其功能，未來可通過引入光能自養(yǎng)生物構(gòu)建功能菌群實(shí)現(xiàn)自養(yǎng)的活體材料組裝；另一方面，通過誘導(dǎo)生物在體內(nèi)表達(dá)保濕劑（如海藻糖），可幫助微生物在極度干燥的環(huán)境下生存［97］。

回顧這一系列工作，整個(gè)活體功能材料領(lǐng)域的關(guān)鍵步驟是從天然生物被膜中由繁至簡，提取出curli這一核心體系；而在后續(xù)發(fā)展中，由簡至繁，根據(jù)場(chǎng)景及需求融合生物模塊、基因線路以及在多種底盤細(xì)胞上組裝活體材料。而這一科研思路也在其他類型的工程生物被膜（枯草芽孢桿菌的TasA系統(tǒng)）以及生物被膜中多糖類組分的編輯發(fā)展中得到類似印證。我們期待過去7年里有關(guān)工程化生物被膜的研究歷程可以帶來更多啟示，在未來的研究中開發(fā)出活體材料組裝的新方法、新系統(tǒng)以及新范式。