陳倩玲，何亞鵬，張引弟，趙 航，王雪怡，張小雪

（甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070）

核糖體是催化蛋白質合成的細胞器，由1 個小的40S 亞基和1 個大的60S 亞基組成。這些亞基由4 種RNA 和大約80 種結構不同的蛋白質組成，核糖體蛋白（ribosomal protein，RP）即所有核糖體蛋白質組成部分的統(tǒng)稱。RPS20基因是一類參與蛋白質生物合成及對細胞增殖、分裂、分化、凋亡具有調控作用的基因［1］，RPS20基因編碼的核糖體蛋白是40S 亞基的組成部分，該蛋白屬于核糖體蛋白的S10P 家族，它位于細胞質中。RPS20基因作為核糖體蛋白編碼基因的典型，有多個加工過的假基因分散在基因組中［2］。有研究表明，RPS20基因RNA 干擾序列成功構建包裝干擾慢病毒轉染后能有效抑制小鼠結腸腺癌細胞（CT26）的生長［3-4］。RPS20基因在豬繁殖與呼吸綜合征病毒復制中有一定作用［5］。此外，在篩選與豬腦心肌炎病毒（EMCV）VP1 蛋白相互作用的宿主蛋白時發(fā)現(xiàn)，VP1 和RPS20 蛋白之間存在特異性相互作用［6］。對大鼠RPS20基因的體外功能研究結果初步表明，核糖體蛋白基因在脾虛證發(fā)生發(fā)展過程中可能具有重要作用［7］，對慢性淺表性胃炎脾氣虛證等患者進行基因表達譜的分析結果表明，脾氣虛證具有蛋白質合成相關基因下調的趨勢，其中以核糖體蛋白基因下調比較顯著，選擇重復性表達下調的RPS20 對其進行生物功能鑒定，RPS20 基因RNA 干擾后使得大鼠小腸上皮細胞（IEC-6）的形態(tài)結構變化，細胞的增殖、分化能力，DNA 修復功能受到抑制，證明RPS20 基因對大鼠小腸上皮細胞的消化吸收和粘膜損傷修復功能起重要作用［7-11］，與脾氣虛證患者消化吸收功能下降、黏膜損傷修復能力下降等表現(xiàn)相符合。有關RPS20 基因及其編碼產(chǎn)物的研究主要是在人類和小鼠上，而在綿羊上的研究比較少。我們通過檢索NCBI 數(shù)據(jù)庫中綿羊的RPS20 基因序列，利用生物信息學的方法研究了綿羊RPS20 基因及其編碼產(chǎn)物的序列、基本理化性質、蛋白質結構和生物學功能等，以期為進一步探究該基因的結構和生物學功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 序列來源

序列均來源于NCBI 網(wǎng)站GenBank 數(shù)據(jù)庫，包括綿羊（XM_004011685.4，XP_004011734.1）、人（NM_001023.4，NP_001014.1）、兔子（NM_00125 3734.1，NP_001240663.1）、雞（XM_040664730.2，XP_040520664.1）、牛（NM_001034438.1，NP_0010 29610.1）、豬（NM_001129954.1，NP_001123426.1）、馬（XM_005613124.3，XP_005613181.1）、鵪鶉（XM_015855656.1，XP_015711142.1）、黑猩猩（XM_016959501.1，XP_016814990.1）、獅子（XM_042924174.1，XP_042780108.1）、野生雙峰駝（XM_032470290.1，XP_032326181.1）11 個物種的mRNA 序列和氨基酸序列，括號內為GenBank 的登錄號。

1.2 方法

綿羊RPS20 基因開放閱讀框（Open reading frame，ORF）分析采用NCBI 的ORF Finder 程序，基本理化性質分析采用Bioedit 分析軟件。綿羊RPS20 蛋白亞細胞定位采用PSORTⅡ軟件，蛋白潛在信號肽剪切位點預測采用SignalP 3.0 軟件，蛋白跨膜螺旋區(qū)域預測采用TMHMM 程序，蛋白保守結構域分析采用Smart 軟件，蛋白親疏水性分析采用Prot Scale 軟件。蛋白二級結構預測采用Jpred 軟件，蛋白三級結構預測采用Swiss-model軟件。多序列比對及同源性分析采用DNAMAN 軟件。

2 結果與分析

2.1 綿羊RPS20 基因開放閱讀框分析

開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）是mRNA 上的一段堿基序列，起始于起始密碼子，結束于終止密碼子，1 個ORF 對應1 個蛋白質［12］，通過ORF 分析可以證明新的DNA 序列是否能夠為特定的蛋白質編碼基因。根據(jù)圖1 可知，該序列最大的開放閱讀框長度為360 bp（起始密碼子位于121 bp 處，終止密碼子位于480 bp 處），編碼了119 個氨基酸殘基。

圖1 綿羊RPS20 基因序列的ORF 分析

2.2 綿羊RPS20 蛋白理化性質分析

蛋白質的基本性質包括相對分子質量、等電點pI、氨基酸組成、基因編碼產(chǎn)物的不穩(wěn)定指數(shù)和半衰期等［13］。利用Prot Param 在線工具和Bioedit 軟件對綿羊RPS20 基因編碼產(chǎn)物的理化性質進行分析，表明其編碼產(chǎn)物的分子式為C587H995N173O171S5，共含有1 931 個原子。該編碼產(chǎn)物有119 個氨基酸殘基數(shù)，分子質量為13.372 71 KDa，理論等電點pI 為9.95，可知綿羊RPS20 蛋白呈堿性。由圖2 可以看出綿羊RPS20 基因編碼的蛋白氨基酸組成。綿羊RPS20 基因編碼的蛋白中所含氨基酸種類豐富，其中含量最多的是Lys（賴氨酸），所占比例為10.92%；Ile（異亮氨酸）、Thr（蘇氨酸）含量較高，均為10.08%。綿羊RPS20基因編碼產(chǎn)物中不含Tyr（酪氨酸），負電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為14，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為23。所編碼產(chǎn)物在哺乳動物體外的半衰期為30 h、不穩(wěn)定指數(shù)為32.28。根據(jù)不穩(wěn)定指數(shù)指標（＞40為不穩(wěn)定；＜40 為穩(wěn)定），由于32.28＜40.00 可以確定該蛋白屬于穩(wěn)定蛋白。

圖2 綿羊RPS20 基因編碼的蛋白氨基酸組成

2.3 綿羊RPS20 蛋白亞細胞定位

從綿羊RPS20 基因蛋白亞細胞定位結果可知，綿羊RPS20 蛋白分布在細胞質的可能性最大，為65.2%；分布在線粒體的可能性次之，為17.4%；分布在細胞核的可能性居第3 位，為13.0%；分布在過氧化物酶體的可能性最小，僅為4.3%。由此可以推斷，綿羊RPS20 基因編碼的產(chǎn)物主要是在細胞質中發(fā)揮生物學作用。

2.4 不同物種RPS20 蛋白的同源性分析

采用DNAMAN 軟件將綿羊RPS20 蛋白序列與其他一些已發(fā)表的動物如人、綿羊、兔子、雞、牛、鵪鶉、黑猩猩、獅子、馬、豬和野生雙峰駝11種動物的氨基酸序列進行多序列比對的結果（圖3、圖4）表明，RPS20 氨基酸序列同源性均為100%。由于RPS20基因的氨基酸序列較短，綿羊與人、牛、黑猩猩、野生雙峰駝等哺乳動物的相似性較高。

圖3 11 個物種的RPS20 基因編碼產(chǎn)物序列的同源性分析

圖4 11 個物種的RPS20 基因編碼產(chǎn)物序列的同源樹

2.5 綿羊RPS20 蛋白潛在信號肽剪切位點預測

信號肽序列本質上是蛋白質序列中起始于N端的1 段特定氨基酸序列，在引導和轉運跨膜蛋白和分泌蛋白方面發(fā)揮著重要作用。核糖體是蛋白質合成的場所，信號肽在此合成過程中發(fā)揮重要作用［14-18］。從對綿羊RPS20 蛋白潛在信號肽剪切位點的預測可知，此基因編碼的產(chǎn)物是否在引導和轉運跨膜蛋白和分泌蛋白方面發(fā)揮一定作用。從圖5 可以看出，綿羊RPS20 基因編碼產(chǎn)物的C值為0.084、Y 值為0.064、S 值為0.128。由此可知，RPS20 基因的編碼產(chǎn)物無跨膜區(qū)，也不存在信號肽序列，即該蛋白不是分泌性蛋白，也不是跨膜蛋白，主要位于細胞質內。

圖5 綿羊RPS20 基因蛋白潛在信號肽剪切位點分析

2.6 綿羊RPS20 蛋白跨膜螺旋結構預測

采用TMHMM 在線軟件對于綿羊RPS20 蛋白跨膜螺旋結構進行分析預測，結果表明綿羊RPS20 基因編碼的蛋白質是非跨膜蛋白，即無跨膜結構（圖6）。

圖6 綿羊RPS20 基因蛋白跨膜螺旋結構分析

2.7 綿羊RPS20 蛋白保守結構域分析

結構域是蛋白質中具有獨立三級結構的部分，具有特定功能，因此也是蛋白質功能單元。保守結構域具有重要的功能，不能被改變，是基因的核心。由綿羊RPS20 蛋白潛在信號肽剪切位點預測可知，綿羊RPS20 基因編碼的蛋白是非跨膜蛋白。進而通過Smart 軟件分析，如圖7 所示，綿羊RPS20 蛋白家族包括原核生物中的小核糖體亞基S10 和真核生物中的小核糖體亞基S20，由于序列較短，沒有跨膜結構，也沒有復雜的跨膜區(qū)域。

圖7 綿羊RPS20 蛋白保守結構域分析

2.8 綿羊RPS20 蛋白親疏水性分析

利用Prot Scale 軟件對綿羊RPS20 蛋白親疏水性分析，結果（圖8）顯示，該基因編碼蛋白疏水性的最大值為1.200，位于第113 位；最小值為-2.067，位于第75 位。該基因編碼的綿羊RPS20 蛋白屬于親水蛋白。

圖8 綿羊RPS20 基因編碼蛋白質的疏水性/親水性預測分析

2.9 綿羊RPS20 蛋白二級結構預測

蛋白質的高級結構，特別是二、三級結構決定其生物學功能，其二級結構（secondary structure）指的是在它的多肽鏈中具有規(guī)則重復的構象［19］，二級結構是指蛋白質第1 個水平的折疊，即部分蛋白質鏈折疊形成一些通用結構，這些通用結構在所有蛋白質中都能找到［13］。通過Jpred 軟件分析可知（圖9），綿羊RPS20 蛋白二級結構主要由無規(guī)卷曲結構、α 螺旋和β 折疊三部分構成，三者所占比例分別為44.54%、22.69%和32.77%。

圖9 綿羊RPS20 基因編碼蛋白質二級結構預測

2.10 綿羊RPS20 蛋白三級結構預測與分析

三級結構（tertiary structure）是指蛋白質的多肽鏈在二級結構甚至結構域基礎上的進一步盤繞、折疊，依靠次級鍵的維系固定形成的特定空間結構［15，20］。通過Swiss-model 在線工具得到的空間構象（圖10）可以看出，綿羊RPS20基因編碼蛋白的三級結構主要由無規(guī)卷曲、α 螺旋和β 折疊盤曲折疊纏繞形成，與二級結構的預測結果相符。

圖10 綿羊RPS20 基因編碼蛋白的三級結構的分析結果

3 小結

綿羊RPS20基因的最長ORF 長度是360 bp，編碼的氨基酸殘基數(shù)為119。必需氨基酸種類豐富，賴氨酸所占比例最多16.67%；相對分子質量為13.372 71 KDa，理論等電點（pI）為9.95。RPS20基因編碼的產(chǎn)物是穩(wěn)定性強、富含親水氨基酸的非分泌蛋白，也是非跨膜蛋白，無跨膜區(qū)且不存在信號肽序列。亞細胞定位的結果顯示，綿羊RPS20 蛋白在細胞質中發(fā)揮生物學作用的可能性最大，為65.2%；其次是在線粒體中，為17.4%。綿羊RPS20 蛋白在多種物種中氨基酸序列高度相似。綿羊RPS20基因編碼產(chǎn)物的二級結構由無規(guī)卷曲、α 螺旋和β 折疊三部分組成，三級結構亦由此三部分盤曲折疊纏繞形成。