楊小州，周少麗，何新華，劉 源，余海霞，陸婷婷，王 卓，羅 聰

芒果基因的功能研究

楊小州*，周少麗*，何新華**，劉 源，余海霞，陸婷婷，王 卓，羅 聰**

亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室/植物科學國家級實驗教學示范中心/廣西大學農學院，廣西南寧 530004

NAC轉錄因子在植物非生物逆境脅迫應答中發(fā)揮重要作用，研究芒果基因的功能為芒果的抗逆性育種提供基因資源。干旱、鹽和低溫等非生物脅迫嚴重影響芒果的生長發(fā)育。前期研究中，課題組從芒果逆境脅迫轉錄組中獲得了一個基因，表達模式分析發(fā)現(xiàn)其與芒果的逆境脅迫應答有關。本研究對芒果基因的功能進行了驗證。將芒果基因構建到pBI121-MiNAC1超量表達載體中，并利用農桿菌介導的花序浸染法轉化野生型擬南芥，對獲得的T3代純合株系進行表型觀察分析和逆境脅迫處理。結果顯示，轉芒果基因與野生型擬南芥的表型類似，轉基因不影響擬南芥的蓮座葉數(shù)量、抽薹時間、開花時間以及開花時的植株高度。逆境脅迫處理：分別用0、200、300、400 mmol/L甘露醇進行干旱脅迫；用0、100、150、200 mmol/L NaCl進行鹽脅迫；4℃低溫脅迫處理轉基因與對照擬南芥植株。結果顯示：隨著甘露醇處理濃度的增加，轉基因株系與對照組擬南芥的根系生長發(fā)育均受到抑制，但轉基因株系受到抑制的影響顯著小于對照組擬南芥，比如在300 mmol/L甘露醇處理時，轉基因株系的根長顯著增長，OE9的根長是WT的1.51倍，側根數(shù)量顯著增加，OE7的側根數(shù)是WT的5倍，另外根冠比分析顯示，轉基因植株的根冠比顯著高于對照植株，OE2的根冠比是WT的1.53倍。鹽脅迫和低溫脅迫也取得了類似的結果。以上結果表明轉芒果基因可以通過增加轉基因植株的根長和側根數(shù)量提高其對干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫的抗性。本研究初步揭示了基因的功能，為深入研究基因參與調控芒果逆境脅迫調控網(wǎng)絡奠定基礎。

芒果；轉錄因子；；非生物脅迫；功能分析

NAC（NAM、ATAF1/2、CUC1/2）是植物特有的一類轉錄因子家族，廣泛存在于陸生植物中[1]。NAC轉錄因子的C末端為高度變異的轉錄調控區(qū)，N端為高度保守的5個亞結構域[2]。NAC轉錄因子結構的多樣性使得NAC轉錄因子功能多樣化[3]，植物NAC轉錄因子參與植物根、莖、葉等組織的生長發(fā)育以及調控次生代謝產物的合成，而且逆境脅迫方面功能顯著，尤其是非生物逆境脅迫。植物NAC轉錄因子在調控植物側根的生長發(fā)育上發(fā)揮著重要作用，掌葉大黃基因在一年生植株的根中表達量最高[4]?；ㄉ诓煌鞴僦械谋磉_量分析顯示在側根中最高[5]，過量表達基因使擬南芥?zhèn)雀鶖?shù)增多[6]。同時玉米在胚芽鞘中大量表達，促進莖尖分生組織的形成[7]，說明植物NAC轉錄因子在植物莖的生長發(fā)育中起一定作用。植物NAC轉錄因子還對調控葉片衰老發(fā)揮著重要作用，擬南芥過表達基因可提高脫落酸合成基因的表達，積累脫落酸促進擬南芥葉片衰老[8]。過量表達甜瓜基因的擬南芥植株葉片衰老也明顯加速[9]。煙草基因的過表達導致擬南芥葉片提前衰老[10]。植物NAC轉錄因子在調控次生代謝產物合成中也發(fā)揮著重要作用。番木瓜的果實成熟過程中，番木瓜轉錄因子能夠促進類胡蘿卜素的生物合成[11]。在菠蘿的成熟過程中基因對果實的形成和發(fā)育有促進作用而且參與到逆境脅迫響應[12]。植物NAC轉錄因子在非生物逆境方面功能明顯，一直是現(xiàn)在研究的熱點。在高鹽處理下，火龍果的上調表達[13]，水稻通過促進根系發(fā)育提高過表達轉基因棉花的耐旱耐鹽性[14]；油茶基因的表達模式與其抗旱性有關[15]。在模擬干旱和高鹽脅迫處理下，梭梭表達量均顯著上調[16]。大麥基因的過表達使其在干旱脅迫下氣孔阻力增加，通過保證充足的光合作用提高抗旱性[17]。在低溫環(huán)境下甘薯NAC轉錄因子有25個NAC基因差異表達[18]，蘋果基因負調控蘋果的抗冷能力[19]。

芒果（L.）屬于漆樹科芒果屬喬木，芒果營養(yǎng)豐富深受消費者的青睞，素有“熱帶水果之王”美稱[20]。非生物脅迫影響芒果的生長發(fā)育、產量以及果實品質。前期研究中，本課題組從‘四季蜜芒’中分離獲得了1個基因，表達模式分析顯示其在低溫、干旱和鹽脅迫誘導其表達，推測其可能在芒果逆境脅迫應答中發(fā)揮作用[21]。本研究構建了基因的過量表達載體，并轉化到模式植物哥倫比亞野生型擬南芥中，采用干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫以驗證過量表達基因的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

逆境脅迫材料種植于廣西大學農學院標本園，擬南芥為哥倫比亞型擬南芥（wild type, WT）保存于本實驗室。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥轉化、篩選和鑒定 將前期課題組已經構建好的過量表達載體pBI121-MiNAC1，通過花期侵染法轉化野生型擬南芥[22]。收取種子后，播種在1/2 MS（50 mg/L Kan）培養(yǎng)基上，篩選出陽性植株。待長至4片真葉時，移栽到基質中在長日照條件下進行培育。提取陽性苗DNA進行PCR檢測，檢測引物為載體公用引物35SFu和基因特異引物MiNAC1d，對于檢測為陽性的植株進行繼續(xù)培育，直到獲得T3代純合植株。

轉基因植株半定量檢測：利用HiPure HP Plant RNA Mini Kit試劑盒提取T3代擬南芥葉片的總RNA，逆轉錄為cDNA，稀釋cDNA濃度為100 ng/μL。以擬南芥為內參基因，芒果以qNAC1u（上游引物）和qNAC1d（下游引物）為特異引物，參考WANG等[23]的方法進行半定量檢測，檢測芒果基因在轉基因擬南芥中的表達水平。引物序列見表1。

表1 本研究所用引物序列

1.2.2 過量表達擬南芥株系的表型分析 在長日照條件下以WT為對照，觀察轉入芒果基因對擬南芥生長發(fā)育的影響。

1.2.3 過量表達擬南芥株系的逆境處理 逆境脅迫處理，將播種6 d的幼苗（WT、OE2、OE7、OE9）分別移栽到經過不同逆境脅迫處理的1/2 MS培養(yǎng)基上。干旱脅迫：0、200、300、400 mmol/L的甘露醇處理；鹽脅迫：0、100、150、200 mmol/L的NaCl處理。干旱脅迫和鹽脅迫苗在22℃培養(yǎng)箱中垂直培養(yǎng)。低溫脅迫：將苗置于22℃（常溫）和4℃（低溫）條件下進行處理。參考張辰明等[24]的方法，每個處理重復3次，處理10 d后對擬南芥主根長、側根數(shù)（長于5 mm的根）及根冠比進行測量并拍照記錄。根冠比=根鮮重÷鮮葉重。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行整理、統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 擬南芥轉化與檢測

通過PCR檢測陽性植株是否轉入目標基因，結果見圖1A，轉基因陽性植株均可以擴增出目標大小的條帶，說明轉化成功。提取轉基因和對照擬南芥的葉片總RNA，逆轉錄為cDNA檢測基因的表達量，結果見圖1B，結果表明基因在轉基因株系OE2、OE7和OE9植株中可以正常表達，而在WT和轉空載體植株中不表達。

A：轉MiNAC1擬南芥陽性植株PCR檢測；B：對照和轉MiNAC1擬南芥的半定量檢測；C：過量表達MiNAC1擬南芥的表型分析。

2.2 過量表達的MiNAC1對擬南芥生長發(fā)育的影響

對T3代純合株系的蓮座葉、抽薹時間和開花時間以及開花時的植株高度與對照植株進行比較觀察，發(fā)現(xiàn)轉芒果基因對擬南芥的葉片形態(tài)、開花時間等表型沒有明顯的影響（圖1C）。

2.3 過量表達的MiNAC1對擬南芥干旱脅迫的影響

本研究采用不同濃度甘露醇處理過量表達的株系（OE2、OE7、OE9）并測其根長、側根數(shù)與根冠比。在0 mmol/L甘露醇的培養(yǎng)下過量表達的株系與WT之間的根長沒有明顯差異。隨著甘露醇濃度的增大，WT與過量表達的株系的生長發(fā)育均受到抑制，葉片發(fā)黃變小，葉柄狹長，根長漸短，側根增多。但過表達株系受到的抑制相對于WT較?。▓D2A～圖2D）。在200、300、400 mmol/L濃度的甘露醇處理時，過量表達株系的根長比WT顯著增長（圖2E），側根數(shù)顯著增多（圖2F），根冠比顯著增大（圖2G）。結果表明，轉芒果基因可以顯著提高轉基因擬南芥對干旱的抗性。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

2.4 過量表達的MiNAC1對擬南芥鹽脅迫的影響

本研究采用不同濃度NaCl處理WT與過量表達的株系（OE2、OE7和OE9）并測其根長、側根數(shù)與根冠比。在0 mmol/L NaCl的處理下過量表達的株系與WT之間的根長，側根數(shù)與根冠比沒有明顯差異，隨著NaCl濃度的增大，WT與過量表達的株系的生長發(fā)育均受到抑制，表現(xiàn)出葉片發(fā)黃變白，根長漸短，側根增多的現(xiàn)象。但過量表達的的生長發(fā)育受到的抑制不明顯（圖3A～圖3D）。在100、150、200 mmol/L濃度的NaCl的處理下，過量表達的的根長比WT的顯著增長（圖3E），側根數(shù)顯著增多（圖3F），根冠比顯著增大（圖3G）。結果表明，轉芒果株系可以顯著提高擬南芥對鹽脅迫的抗性。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

2.5 過量表達的MiNAC1對擬南芥低溫脅迫的影響

本研究采用常溫22℃和低溫4℃處理WT與過量表達的株系（OE2、OE7、OE9）并測其根長、側根數(shù)與根冠比。在常溫22℃培養(yǎng)中，過量表達的株系和WT的生長發(fā)育均受到影響，在低溫4℃處理下，過量表達的株系和WT表現(xiàn)出葉片小而厚，葉莖發(fā)紅，植株生長弱小的現(xiàn)象，但是過量表達的株系受低溫抑制的不明顯（圖4A、圖4B、圖4C）。在4℃的培養(yǎng)下，過量表達的株系的根長較WT的顯著增長（圖4C），側根數(shù)顯著增加（圖4F），根冠比顯著增加（圖4G）。結果表明，轉芒果株系可以顯著提高轉基因擬南芥對低溫的抗性。

3 討論

植物的生長發(fā)育受到非生物脅迫的影響，嚴重降低農作物的產量和品質。干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫是造成農作物損失最嚴重的非生物脅迫[25-26]。植物遭到脅迫后打破正常的生理代謝狀態(tài)，以適應脅迫下的環(huán)境[27]，比如沙芥幼苗根系的主根長、主根體積和根冠比隨著干旱脅迫天數(shù)的延長不斷增加[28]。轉細葉百合基因的煙草幼苗在鹽脅迫下其根長、鮮重和長勢顯著好于對照[29]。NAC轉錄因子對植物的生長發(fā)育和逆境脅迫應答等方面發(fā)揮著重要的調控作用[30]。植物NAC轉錄因子是一個大的基因家族，在應對逆境脅迫的功能方面一直被廣泛關注。在前期研究中，課題組從芒果中分離克隆了一個基因，表達模式分析顯示，低溫、鹽脅迫和干旱脅迫均影響其表達，說明基因與芒果的逆境脅迫應答有關[21]。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

不同物種的基因均可以使其轉基因植株提高對逆境脅迫的抗性，比如將水稻O基因轉入棉花，過量表達的棉花在干旱和高鹽脅迫下蒸騰速率下降，根系發(fā)育增強，提高了過量表達棉花的耐旱和耐鹽性[14]。在干旱和鹽脅迫培養(yǎng)下，過量表達的水仙基因可以提高煙草對干旱和鹽脅迫的抗性[31]。番茄的表達模式分析顯示其不但受干旱脅迫、鹽脅迫和細菌病原體的誘導，與煙草空載相比在干旱和鹽脅迫下過表達株系還表現(xiàn)出更多側根數(shù)量和更長的根長[32]。說明植物在遭受逆境脅迫時通過增加主根的長度和須根的數(shù)量來應對逆境脅迫[33]，本研究中，將芒果基因轉入模式植物擬南芥中，在干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫下，轉基因擬南芥和對照擬南芥的根系生長均受到抑制，但轉基因擬南芥植株受到的抑制效應顯著小于WT植株，而側根數(shù)和根冠比也都大于WT，說明轉芒果基因可以提高轉基因擬南芥植株對干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫的抗性。

本研究中過表達擬南芥的主根增長，側根數(shù)目顯著增加，提高了株系的生物產量，且根冠比增大。說明芒果基因可以參與干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫的應答，具有提高芒果抗逆性的運用潛能。

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Functional Analysis of aGene in Mango

YANG Xiaozhou*, ZHOU Shaoli*, HE Xinhua**, LIU Yuan, YU Haixia, LU Tingting, WANG Zhuo,LUO Cong**

State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources / National Demonstration Center for Experimental Plant Science Education / College of Agriculture, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530004, China

NAC transcription factors play important roles in the response to abiotic stress in plants. Studying the function of the mangogene may provide genetic resources for mango stress tolerance breeding. Abiotic stresses such as drought, salt and low temperature affect the growth and development of mango. In a previous study, agene was obtained from the transcriptome of mango stress samples, and the expression pattern analysis showed that it was related to the stress response of mango. In this study, the function of the mangogene was verified. The pBI121-MiNAC1 overexpression vector was constructed and transferred into the model plant. The T3 homozygous lines were used for phenotypic observation and stress treatment. The results showed that the phenotypes of the transgenic mangogene and WT wild-typewere similar with each other. The transgenic mangogene did not affect the number of rosette leaves, bolting time, flowering time and plant height at flowering. Transgenic and WTwere treated with Mannitol (0, 200, 300, 400 mmol/L), salt (0, 100, 150, 200 mmol/L) and low temperature stress at 4℃, respectively. Stress treatment was performed by comparing the changes in root length, lateral root number and root crown ratio with the transgenic and control plants. Under drought stress treatment, the root length of WT and transgenic plants was obviously inhibited with the concentration increase of mannitol treatment, but the degree of inhibition was significantly lower in transgenic lines than that of WT plants. The lateral root number increased, but the transgenic plants were significantly higher than that of WT plants. In addition, the root crown ratio of transgenic plants was also significantly higher than that of control plants. For example, under 300 mmol/L mannitol treatments, the root length increased significantly, with OE9 was 1.51 times longer than that of WT. The number of lateral roots increased significantly, with OE7 having 5 times more lateral roots than that of WT. The root crown ratio was significantly higher in transgenic plants than that in control plants, and that in OE2 was 1.53-fold higher than that of WT. Similar results were obtained under salt stress and low temperature stress. These results indicated that transgenic mangogene could improve the resistance of transgenic plants to drought stress, salt stress and low temperature stress by increasing root length and lateral root number. This study initially revealed the function ofgene, and laid a foundation for further study ofgene involved in regulating the regulatory network of mango stress.

mango; transcription factor;; abiotic stress; functional analysis

S667.7

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.08.001

2022-01-25；

2022-03-04

國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系廣西芒果創(chuàng)新團隊栽培與病蟲害防治崗位項目（No. nycytxgxcxtd-2021-06-2）；廣西自然科學基金項目（No. 2014GXNSFBA118102）；科技先鋒隊‘強農富農’‘六個一’專項行動（No. 202204）。

楊小州（1991—），男，碩士研究生，研究方向：果樹分子生物學；*同等貢獻作者：周少麗（1997—），女，本科生，研究方向：果樹分子生物學。**通信作者（Corresponding author）：何新華（HE Xinhua），E-mail：honest66222@163.com；羅 聰（LUO Cong），E-mall：22003luocong@163.com。