熊雯宇 何君強(qiáng) 戴婉真 吳毓彥 劉 斌,2

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2. 國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002)

灰樹花(Grifolafrondosa)呈珊瑚狀重疊成簇，富有特殊的濃郁香氣，兼具藥食兩用價(jià)值[1]。研究[2]表明，灰樹花中含有多糖、甾體、多酚、生物堿、三萜、皂苷、有機(jī)酸、維生素、礦物質(zhì)等功效成分，這些成分使得灰樹花具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、抗病毒、降血糖及調(diào)節(jié)腸道菌群等[3]生物功能。目前已有以灰樹花為原料的口服液、養(yǎng)生面、調(diào)味料等功能食品[4-5]。研究擬對(duì)灰樹花主要功效成分分離純化及其生物活性作用的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，總結(jié)灰樹花功效成分在抗腫瘤、抗病毒、降血糖、調(diào)節(jié)腸道菌群等方面的研究，并指出當(dāng)前灰樹花相關(guān)研究中存在的問題和未來研究方向，以期為灰樹花資源加工及深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 灰樹花主要功效成分

1.1 多糖類

灰樹花多糖是一種天然的高分子聚合物，通常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起。研究[6]表明，灰樹花多糖具有潛在的輔助抗腫瘤、抗氧化、降血糖、增強(qiáng)免疫力及保護(hù)肝損傷等作用。熱水提取、堿提取、酶解提取、微波提取、超聲提取等是目前常見的灰樹花粗多糖提取法。提取的粗多糖通常采用乙醇分級(jí)沉淀、透析、超濾膜分級(jí)、硅膠柱層析、凝膠柱層析等方法進(jìn)行分離純化，再進(jìn)一步除去蛋白質(zhì)、色素和其他小分子雜質(zhì)。在不同條件下提取純化的多糖，其結(jié)構(gòu)和功效通常也是不同的(見表1)。Nanba等[16]通過熱水提取、乙醇沉淀、去除酸溶性組分、去蛋白等純化試驗(yàn)，從灰樹花多糖中分離純化出堿溶性的D組分，這是一種具有1→3支鏈的β-1,6-葡聚糖，后續(xù)對(duì)D組分進(jìn)一步純化得到MD組分，其分子結(jié)構(gòu)是含β-1,3和β-1,6糖苷鍵的β-葡聚糖。Kubo等[17]對(duì)熱水提取的灰樹花粗多糖進(jìn)行分級(jí)醇沉，在50%乙醇沉淀中分離得到X組分(m粗多糖∶m蛋白為65∶35)。此外，Ma等[18]用30 kDa 和50 kDa的超濾膜將灰樹花多糖按照分子量大小進(jìn)行分離，得到以葡萄糖苷為主的EXO-GFO多糖組分，經(jīng)凝膠層析柱CL-4B柱和離子柱CL-6B進(jìn)行分離純化得到E組分[19]，其相對(duì)分子質(zhì)量約為2×106，蛋白含量0.6%，是含β-1,3-支鏈的β-1, 6-葡聚糖。Xu等[20]利用Sephadex G-100凝膠柱從灰樹花中分離得到由吡喃糖苷組成的雜多糖，該組分中m半乳糖∶m甘露糖∶m葡萄糖為6.5∶1.0∶2.6。

采用不同的提取和分離純化方法來降低提取溫度和縮短提取時(shí)間及細(xì)化多糖分子量，可以提高多糖的穩(wěn)定性以保持其完整結(jié)構(gòu)和生物活性。對(duì)灰樹花多糖結(jié)構(gòu)的研究大多停留在對(duì)其多糖的分子量、摩爾比、單糖組成、糖殘基組成、連接方式等一級(jí)結(jié)構(gòu)分析。由于多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，完全解析多糖結(jié)構(gòu)難度較大，需要同時(shí)使用多種方法，這也是后續(xù)研究中所需攻克的難題。

1.2 甾體類

甾體是天然產(chǎn)物中十分常見的化學(xué)成分，多以游離狀態(tài)存在，還可以高級(jí)脂肪酸或者糖苷的形式存在。此外，甾體因具有抗氧化、抗炎等生物活性而被用于生產(chǎn)甾體藥物和維生素D3[21]。Zhang等[22]將灰樹花發(fā)酵菌絲體用正己烷提取后，通過甲醇重結(jié)晶的方式得到麥角甾醇，再通過薄層色譜和以三氯甲烷—甲醇體系作為流動(dòng)相的硅膠柱進(jìn)行分離純化，得到麥角甾醇-4,6,8(14),22-四烯-3-酮，并且通過GC-MS分析正己烷—乙醚體系柱層析得到的組分是由1-油酰-2-亞油酰-3-棕櫚酸甘油酯組成。龐菲[23]按照極性分段并逐級(jí)縮小有活性的物質(zhì)的范圍，通過硅膠柱層析和微量重結(jié)晶的方法從灰樹花醇提物萃取后的乙酸乙酯層中分離純化出3種物質(zhì)，并用核磁共振技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)，分別為麥角甾醇，5α,8β-過氧麥角甾-6,22E-二烯-3β-醇，3β,5α,6β-三羥基麥角甾醇。Chen等[24]將灰樹花乙醇提取物通過大孔吸附樹脂柱洗脫，再用甲醇—水體系的硅膠柱分離，通過半制備液相色譜分離純化并鑒定得到9種麥角甾醇及其衍生物。

綜上，灰樹花甾體化合物的分離純化常采用有機(jī)溶劑萃取法、薄層色譜法、柱層析及重結(jié)晶法。隨著科技的進(jìn)步，制備型高效液相色譜的應(yīng)用使化合物的純度獲得了很大的提升，分離純化效率也能得到極大的提高。但是，近年來關(guān)于灰樹花甾體化合物的研究多集中于分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定方面，而對(duì)于生物活性的研究較少，進(jìn)一步明確灰樹花甾體的生理作用是今后研究的重點(diǎn)。

1.3 多酚類

研究[24]表明，多酚類化合物不僅有抗氧化、抗腫瘤、防治冠心病、預(yù)防骨質(zhì)疏松作用還有抗菌、抗炎及抑制結(jié)腸癌等作用。目前國內(nèi)外對(duì)多酚類物質(zhì)的研究報(bào)道大多集中在果蔬、茶葉及其他食藥用菌中。陳向東等[25]和柴麗[26]均證明灰樹花菌絲體水體上清液的粗提物中主要組成成分為多酚類物質(zhì)，對(duì)其抗氧化、抗菌等活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明粗提物無明顯抑菌效果。呂旭聰?shù)萚27]通過LC-MS從灰樹花40%乙醇提取物中鑒定出2-羥基丁二酸、香豆酸、3-羥基白藜蘆醇、白藜蘆醇、二羥基苯乙酸、咖啡酸和4-羥基苯甲酸共7個(gè)多酚類成分。李燕[28]從灰樹花乙酸乙酯提取物中鑒定出野靛黃素和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷，分別屬于異黃酮類和花氰苷類。

表2總結(jié)了灰樹花中多酚類化合物的種類、提取方法、分離純化方法及其生物活性。目前大多數(shù)研究還停留在粗多酚的提取工藝優(yōu)化層面，但粗提物含有較多雜質(zhì)，影響后續(xù)生物活性效果的研究。探索從天然產(chǎn)物中提取純度高、活性強(qiáng)的天然多酚類化合物，并進(jìn)一步研究其與人類健康的關(guān)系將成為新的研究熱點(diǎn)，為開發(fā)天然藥物奠定基礎(chǔ)。

1.4 多肽類

多肽通常由蛋白經(jīng)過酶解得到，是一種重要的營養(yǎng)素，對(duì)食品的物理特性具有重要意義。功能多肽是具有特定氨基酸序列、單一結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理明確的小分子化合物，在美白、抗氧化、抗菌、抗皺抗衰老、促進(jìn)毛發(fā)生長等方面有較高的生物活性。據(jù)報(bào)道現(xiàn)已開發(fā)出具有抗凍[29]、抗氧化[30]、降血壓[31]等活性的多肽(見表3)，因此，活性多肽在保健品方面有良好的應(yīng)用前景。許銳[32]將分子量200～3 000 Da超濾膜截留的灰樹花復(fù)合酶解物進(jìn)行凝膠色譜分離，后經(jīng)過反相液相制備色譜分離純化呈味肽，采用UPLC-Q-TOF/MS測定出呈味肽的氨基酸序列為RSGV和YHGPF，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種肽的濃度與鮮味和濃厚感均有正相關(guān)性。陳貴堂等[33]通過堿溶酸沉法提取灰樹花蛋白，以堿性蛋白酶可控酶解制備灰樹花抗氧化肽，證實(shí)了美拉德反應(yīng)是提高灰樹花多肽DPPH自由基清除率的有效方法。

表3 活性多肽的提取方法及應(yīng)用前景Table 3 Extraction methods and application prospects of active polypeptides

對(duì)灰樹花多肽的研究大多集中在制備方法和生物功能方面，對(duì)多肽的結(jié)構(gòu)研究相對(duì)較少。隨著科技的發(fā)展和分析檢測技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)灰樹花多肽結(jié)構(gòu)與活性的研究將不斷深入，為人類健康作出更多的貢獻(xiàn)。

1.5 其他類

近年來，灰樹花的基礎(chǔ)營養(yǎng)成分已經(jīng)被廣泛研究。但對(duì)灰樹花生物活性的研究以多糖為主，對(duì)其他小分子化合物分離鑒定及生物活性的研究報(bào)道較少。龐菲[23]的試驗(yàn)結(jié)果表明灰樹花化學(xué)成分可能含有香豆素、有機(jī)酸、生物堿、甾體、黃酮、三萜、皂苷類化合物。馬迪等[34]通過硅膠柱層析和重結(jié)晶等方式從灰樹花醇提物中分離純化得到12種物質(zhì)，除已知的麥角甾醇、葡萄糖以外，還得到腦苷脂、1-十七醇、正二十八烷、煙酸、琥珀酸、甘露醇、煙酰胺、尿嘧啶、腺苷以及尿苷等多種化學(xué)成分。Chen等[24]通過大孔吸附樹脂、制備型液相從灰樹花95%乙醇提取物中分離出20種化合物，包括8種吡咯生物堿、2種酰胺、1種維生素化合物和9種麥角甾醇衍生物。此外，在灰樹花活性物質(zhì)的研究中，對(duì)其結(jié)構(gòu)與生物活性的構(gòu)效關(guān)系、有效劑量等尚不明確。近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)天然產(chǎn)物及其生物活性的研究熱情將會(huì)加速對(duì)灰樹花功效成分的研究。

2 灰樹花功效成分的生物活性作用

2.1 抗腫瘤

灰樹花功效成分的抗腫瘤活性作用已經(jīng)得到了廣泛的研究并取得一定的成效[35-36]。其抗腫瘤機(jī)理為灰樹花功效成分可通過清除自由基，激活免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等方式來抑制腫瘤細(xì)胞生長?；覙浠ǘ嗵强鼓[瘤效果已經(jīng)被多項(xiàng)研究證實(shí)，Roldan-Deamicis等[37]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)腹腔注射5.0 mg/kg灰樹花多糖D組分的BALBc小鼠乳腺癌預(yù)防率達(dá)到64%以上，這是因?yàn)镈組分可通過下調(diào)SPARC基因的mRNA表達(dá)水平來預(yù)防乳腺癌，因此灰樹花多糖D組分可一定程度上抑制乳腺腫瘤細(xì)胞的生長。Alonso等[38]也證明了灰樹花多糖的D組分能夠直接作用于乳腺腫瘤細(xì)胞，減少乳腺腫瘤細(xì)胞的遷移并抑制其生長?；覙浠ǘ嗵荊P11在體外對(duì)HepG-2細(xì)胞間接地起到抗細(xì)胞毒素作用，在體內(nèi)可能通過TLR-4信號(hào)通路刺激NO、TNF-α和IL-1β的上調(diào)來改善免疫系統(tǒng)功能，從而發(fā)揮其抗腫瘤活性[39]。龐菲[23]對(duì)麥角甾醇及其衍生物抗腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用進(jìn)行了研究，證實(shí)其對(duì)MCF-7細(xì)胞有抑制作用。綜上，灰樹花多糖、甾體等功效成分可以通過增強(qiáng)免疫系統(tǒng)、抗細(xì)胞毒性以及抑制心血管增生等途徑從而直接或間接地抑制腫瘤生長。

2.2 增強(qiáng)免疫

Borchers等[40]發(fā)現(xiàn)灰樹花核酸提取液使小鼠胸腺重量從50.00 mg升高至72.15 mg，腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞率增加了2%左右，外周血T淋巴細(xì)胞數(shù)也提升了10%。因此，灰樹花中的核酸有促進(jìn)機(jī)體新陳代謝，提高免疫力的作用。李小定等[41]發(fā)現(xiàn)灰樹花多糖能顯著增加荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)、脾細(xì)胞抗體形成能力及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力等參數(shù)，并且灰樹花多糖含量越高，其增強(qiáng)免疫能力越顯著。同樣，Li等[42]研究表明灰樹花多糖GFP-22可改善或逆轉(zhuǎn)CTX誘導(dǎo)的免疫抑制，使機(jī)體脾細(xì)胞、胸腺指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子明顯增加。大量研究[6]發(fā)現(xiàn)，灰樹花多糖能極大地激活細(xì)胞免疫功能，通過介導(dǎo) MAPK/NF-κB通路，刺激巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。綜上，灰樹花核酸和多糖類化合物可通過調(diào)節(jié)免疫因子和免疫細(xì)胞來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

2.3 降血糖

灰樹花降血糖作用主要體現(xiàn)在抑制糖脂代謝引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善細(xì)胞受損狀態(tài)，緩解炎性反應(yīng)[43]等方面。灰樹花多糖能直接與胰島素受體結(jié)合，增加胰島素的敏感性及糖尿病小鼠的糖耐受性?；覙浠ń?jīng)提取、分離純化后得到兩個(gè)具有降血糖活性的多糖組分GFP-N和GFP-W，二者可通過IRS/PI3K通路改善細(xì)胞胰島素水平，促進(jìn)葡萄糖吸收，還可介導(dǎo)腸道菌群達(dá)到改善小鼠2型糖尿病的目的[44]。雷紅等[45]證實(shí)灰樹花多糖可以延緩葡萄糖在糖尿病機(jī)體腸道內(nèi)的吸收，抑制α-葡萄糖苷酶活性，從而降低血糖水平，同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體的糖耐受性。Pan等[46]發(fā)現(xiàn)灌喂GF95(灰樹花95%乙醇提取物)后的糖尿病大鼠AMPK-α和CYP7A1的mRNA表達(dá)增加，而SREBP-1c、FAS、IL1β和ACC的mRNA表達(dá)降低，證實(shí)了GF95對(duì)降低血脂、肝臟指數(shù)和總膽汁酸均有積極作用，因此，可以通過激活A(yù)MPK相關(guān)信號(hào)通路來改善飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖和胰島素抵抗。綜上，灰樹花中的功效成分主要通過調(diào)節(jié)相關(guān)因子水平、相關(guān)酶水平來抑制機(jī)體體重的減少、恢復(fù)其血糖血脂、逆轉(zhuǎn)其肝組織損傷、提高胰島素水平、提高短鏈脂肪酸豐度及改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié)機(jī)體糖脂代謝紊亂。

2.4 抗病毒

現(xiàn)今化學(xué)抗病毒藥物的毒副作用大且病毒對(duì)現(xiàn)有藥物的抗藥性強(qiáng)，所以需要開發(fā)安全性高的天然藥物。項(xiàng)哨等[47]研究表明灰樹花多糖具有顯著抗病毒作用，推測其可能是通過提高機(jī)體免疫力達(dá)到抗病毒目的。據(jù)報(bào)道[48]，灰樹花的MD組分通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞或輔助T細(xì)胞等免疫感受性細(xì)胞的活性，直接殺死HIV病毒或抑制其增殖。高路營[49]和Zhao等[50]通過體外細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)灰樹花多糖能夠有效地抑制EV71病毒的RNA和結(jié)構(gòu)蛋白VP1的合成，從而抑制病毒的復(fù)制。綜上，灰樹花多糖能夠有效干擾病毒復(fù)制，通過提高機(jī)體免疫力而減輕病毒引起的炎癥和抑制病毒的傳播。往后可以對(duì)灰樹花其他功效成分抗病毒作用展開更深入的研究。

2.5 調(diào)節(jié)腸道菌群

許多學(xué)者[44,46,51]認(rèn)為灰樹花功效成分通過調(diào)控腸道菌群中菌種結(jié)構(gòu)組成與微生物代謝產(chǎn)物，從而維持腸道微生態(tài)平衡。有研究[52]表明，多糖、黃酮、脂肪酸等功效成分進(jìn)入機(jī)體后，黃酮、脂肪酸等小分子活性物質(zhì)可直接被腸道吸收，而多糖等大分子物質(zhì)進(jìn)入腸道后與腸道菌群相互作用，代謝成小分子物質(zhì)再經(jīng)腸肝軸循環(huán)被吸收后發(fā)揮活性作用。Pan等[46]發(fā)現(xiàn)機(jī)體攝入GF95后脂質(zhì)代謝異常大鼠腸道中的有益菌數(shù)量增加，而這些有益菌可以將腸道中的碳水化合物轉(zhuǎn)為重要的微生物代謝物丁酸和異丁酸。Guo等[53]發(fā)現(xiàn)灰樹花多糖通過改變腸道菌群和調(diào)節(jié)肝臟糖脂代謝相關(guān)基因降低糖尿病小鼠的血糖和血脂，從而成為潛在預(yù)防高血糖高血脂的功能性食品成分。Chen等[44]研究表明灰樹花多糖可作為改善糖尿病的增強(qiáng)劑和調(diào)節(jié)糖尿病機(jī)體腸道菌群的功能食品。

綜上，灰樹花功效成分有調(diào)節(jié)腸道菌群進(jìn)而改善代謝型疾病的作用。但灰樹花功效成分介導(dǎo)腸道菌群發(fā)揮作用機(jī)制尚不明確，后續(xù)需進(jìn)行更加系統(tǒng)而深入的研究。

2.6 其他作用

除了上述作用外，灰樹花還具有多種生物活性作用。Klaus等[54]發(fā)現(xiàn)灰樹花多糖和熱堿提取物具有較高的抗菌、抗氧化和體外抗腫瘤潛力。Zhang等[55]發(fā)現(xiàn)灰樹花可通過提高衰老小鼠體內(nèi)SOD和T-AOC活性，降低MDA含量，使大腦損傷和惡化明顯減輕，表明灰樹花具有良好的抗氧化和抗衰老活性。Meng等[51]發(fā)現(xiàn)灰樹花多糖可以抑制丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的活性，提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的水平，從而使機(jī)體肝損傷狀態(tài)有所改善。此外，灰樹花還具有抗輻射作用，汪維云[56]研究表明灰樹花多糖可以保護(hù)受輻射小鼠的造血組織，提高骨髓的DNA含量。Xu等[20]研究表明灰樹花多糖通過降低半胱天冬酶mRNA的表達(dá)，促進(jìn)皮膚抗老化作用。目前，大多數(shù)灰樹花生物活性的確切分子作用機(jī)制尚未明確，后續(xù)需進(jìn)行深入研究?；覙浠üπС煞值纳锘钚宰饔脵C(jī)制如圖1所示。

圖1 灰樹花功效成分的生物活性作用機(jī)制Figure 1 Bioactivity mechanism of functional components in Grifola frondosa

3 展望

目前，灰樹花提取物純度低，功效成分和生物活性作用之間的構(gòu)效關(guān)系尚不明確，使灰樹花生物活性的應(yīng)用開發(fā)受到嚴(yán)重制約。因此，后續(xù)可深入研究灰樹花單體化合物的高純度提取和分離，加強(qiáng)灰樹花功效成分結(jié)構(gòu)及藥理活性、功效成分形成及代謝機(jī)理、毒素成分結(jié)構(gòu)及中毒機(jī)理等方面的研究。