李吉馥 周游 左偉東

(西南大學(xué)蠶桑紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院， 重慶 400715)

2018年，時(shí)任教育部部長(zhǎng)陳寶生在“新時(shí)代全國(guó)高等學(xué)校本科教育工作會(huì)議”上的講話中提出了做好本科教育工作的具體舉措，其中明確提出高等教育內(nèi)涵發(fā)展要更深一些，要及時(shí)調(diào)整專(zhuān)業(yè)人才培養(yǎng)方案，建設(shè)綜合性、問(wèn)題導(dǎo)向、學(xué)科交叉的新型課程群，將學(xué)科研究新進(jìn)展、實(shí)踐發(fā)展新經(jīng)驗(yàn)、社會(huì)需求新變化及時(shí)納入教材，不能再用過(guò)時(shí)的知識(shí)培養(yǎng)明天的畢業(yè)生[1]。作為人才培養(yǎng)重要基地的高校，在培養(yǎng)人才時(shí)更需注重創(chuàng)新能力的提高，使學(xué)生具備較完整的邏輯思維能力，具有更強(qiáng)的依靠自主學(xué)習(xí)解決問(wèn)題的能力。作為高校的教師，則應(yīng)主動(dòng)探索參與式教學(xué)方法，提高課堂互動(dòng)性，改革傳統(tǒng)教學(xué)形態(tài)，積極推廣PBL教學(xué)法、翻轉(zhuǎn)課堂等新型教學(xué)模式，提升學(xué)生的學(xué)習(xí)主動(dòng)性[2]。實(shí)驗(yàn)教學(xué)作為現(xiàn)代大學(xué)發(fā)展水平的標(biāo)志，是一流本科課程建設(shè)的重要內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程應(yīng)力求做到理論與實(shí)踐相結(jié)合，重視培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)踐能力，深度分析大膽質(zhì)疑的創(chuàng)新能力，解決復(fù)雜問(wèn)題的綜合能力和高級(jí)思維[3]。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，高校實(shí)驗(yàn)教學(xué)人員應(yīng)該不斷探索符合時(shí)代背景的實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，積極完善改進(jìn)教學(xué)方式，為當(dāng)代中國(guó)培養(yǎng)更多優(yōu)秀的高素質(zhì)人才。

《生物化學(xué)》是一門(mén)知識(shí)點(diǎn)廣博豐富，深?yuàn)W經(jīng)緯的基礎(chǔ)課程，主要研究蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、脂類(lèi)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能[4]。作為多個(gè)專(zhuān)業(yè)重要的基礎(chǔ)課，《生物化學(xué)》在整個(gè)課程體系中處于重要地位。由于生物化學(xué)學(xué)科的概念抽象難懂，為了使學(xué)生更容易理解學(xué)習(xí)內(nèi)容，感受到學(xué)習(xí)《生物化學(xué)》課程的樂(lè)趣，開(kāi)設(shè)《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》尤為必要。《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》教學(xué)常采用驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)與綜合性實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的授課策略[5]。相對(duì)于簡(jiǎn)單的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，綜合性實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)學(xué)生主動(dòng)思考能力、邏輯推導(dǎo)完整性，以及理解教學(xué)內(nèi)容上具有不可替代的優(yōu)勢(shì)[6]。目前，西南大學(xué)蠶桑紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院的《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》主要參考傳統(tǒng)的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目開(kāi)展教學(xué)，內(nèi)容以驗(yàn)證性和基礎(chǔ)性居多，未涉及蛋白質(zhì)免疫印跡方法的學(xué)習(xí)，亦未結(jié)合本學(xué)院傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)學(xué)科展開(kāi)特色化教學(xué)。從2018級(jí)開(kāi)始，生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)的《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》課程學(xué)時(shí)由先前的40學(xué)時(shí)增加至48學(xué)時(shí)，課時(shí)量有所增加。因此，我們希望設(shè)計(jì)構(gòu)建具有學(xué)科特色的綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，以符合課程改革的發(fā)展方向，能夠引起學(xué)生對(duì)蠶桑專(zhuān)業(yè)的興趣和熱愛(ài)，建立起學(xué)生對(duì)蠶桑專(zhuān)業(yè)的認(rèn)同感，同時(shí)也通過(guò)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的串聯(lián)讓學(xué)生更好地理解基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)原理，培養(yǎng)學(xué)生的綜合能力，即理論聯(lián)系實(shí)際的能力，團(tuán)隊(duì)合作的動(dòng)手能力以及嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的科學(xué)態(tài)度。

1 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)計(jì)的內(nèi)容

蛋白質(zhì)的檢測(cè)和鑒定作為一項(xiàng)經(jīng)典的《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》教學(xué)項(xiàng)目，在有生物背景的學(xué)科專(zhuān)業(yè)中廣泛開(kāi)展。蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)作為在生物學(xué)蛋白質(zhì)表達(dá)、分析研究中應(yīng)用最多的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在專(zhuān)業(yè)學(xué)習(xí)中不可或缺，對(duì)學(xué)生以后從事生物學(xué)研究和相關(guān)工作十分重要?，F(xiàn)有的該類(lèi)實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目設(shè)計(jì)時(shí)間往往較早，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法較為陳舊，沒(méi)有根據(jù)學(xué)科特色進(jìn)行相應(yīng)優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)方法也沒(méi)有更新，這對(duì)于激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，了解本學(xué)科知識(shí)十分不利。因此，本教學(xué)團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了具有蠶桑特色，基于蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)的綜合性實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目——家蠶幼蟲(chóng)與蛹的微管蛋白鑒定。實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的設(shè)計(jì)銜接了課程內(nèi)蛋白質(zhì)的定量實(shí)驗(yàn)，選擇家蠶5齡第3天的幼蟲(chóng)和化蛹48 h的蠶蛹為實(shí)驗(yàn)材料，運(yùn)用3～4次課程串聯(lián)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，包括蛋白質(zhì)的定量實(shí)驗(yàn)(BCA法)、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)印及免疫檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)操作的步驟設(shè)計(jì)為：提取供試家蠶幼蟲(chóng)和蛹的總蛋白質(zhì)，利用BCA法進(jìn)行定量，隨后利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分別對(duì)家蠶幼蟲(chóng)總蛋白質(zhì)和蠶蛹總蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，將凝膠分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜后，采用免疫印跡方法(Western blot)將微管蛋白抗體與分離后的總蛋白質(zhì)進(jìn)行孵育，從而檢測(cè)并比較家蠶幼蟲(chóng)和蛹的微管蛋白質(zhì)含量(圖1)。

圖1 實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容的設(shè)計(jì)示意圖

另外，本科教學(xué)與科學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)操作有所不同，本科教學(xué)由于人數(shù)較多，需綜合考慮教室容量、實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備臺(tái)件數(shù)等的情況下進(jìn)行設(shè)置，在實(shí)驗(yàn)操作中還應(yīng)考慮如何高效又安全地完成實(shí)驗(yàn)教學(xué)。為此，本課題組設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目針對(duì)30人左右的本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)班進(jìn)行優(yōu)化，靈活選用操作流程和方法，使實(shí)驗(yàn)方法同時(shí)具有特異性好和靈敏度高的雙重特點(diǎn)，能夠幫助學(xué)生完整地理解實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理及思路，有利于啟發(fā)學(xué)生的科研思維和增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)操作能力。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

家蠶品系大造的5齡第3天幼蟲(chóng)、化蛹48 h的蠶蛹，由本學(xué)院研究室提供。

2.2 主要試劑

RIPA裂解液、BCA蛋白測(cè)定試劑盒、考馬斯亮藍(lán)快速染色液，一抗(Tubulin抗體：小鼠單抗)、二抗[辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)]，DAB顯影液等均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

2.3 實(shí)驗(yàn)操作步驟

2.3.1 總蛋白質(zhì)的制備及定量

存在問(wèn)題及改進(jìn)措施如下所述。常規(guī)實(shí)驗(yàn)中常采用液氮對(duì)組織樣品進(jìn)行研磨后再提取蛋白質(zhì)，但在本科教學(xué)中，學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)操作不熟悉，且在常壓下液氮溫度為-196 ℃，容易被凍傷，故對(duì)實(shí)驗(yàn)操作要求較高。針對(duì)未接觸過(guò)任何專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)課學(xué)習(xí)的學(xué)生，此方法存在安全隱患。因此，我們選擇在該步驟使用玻璃研磨棒在離心管內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行研磨，既能保持課堂秩序，又不存在安全隱患。

實(shí)驗(yàn)操作步驟如下。分別稱(chēng)量蠶蛹及幼蟲(chóng)整頭樣品200 mg，置于無(wú)菌離心管中，用玻璃研磨棒研磨至粉末；加入2 mL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，渦旋振蕩后于冰上裂解15 min，最后高速離心取出上清，所得樣品則即為家蠶幼蟲(chóng)和蛹的總蛋白質(zhì)提取物，利用BCA法對(duì)其進(jìn)行定量；隨后向60 μg蛋白質(zhì)樣品中加入適量 SDS上樣緩沖溶液，于沸水浴中加熱后離心，樣品可保存于-20 ℃冰箱備用。

2.3.2 總蛋白質(zhì)樣品的SDS-PAGE分析

存在問(wèn)題及改進(jìn)措施如下所述。實(shí)驗(yàn)室原有設(shè)備為1個(gè)制膠器對(duì)應(yīng)2塊凝膠(圖2左)，課題組考慮到在實(shí)際教學(xué)過(guò)程中，2個(gè)學(xué)習(xí)小組共同使用一個(gè)制膠架在操作時(shí)會(huì)有沖突，并且4人共同操作一套設(shè)備較為擁擠，易導(dǎo)致學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)操作失去興趣，影響實(shí)驗(yàn)教學(xué)。因此，經(jīng)過(guò)仔細(xì)的市場(chǎng)調(diào)研，我們找到一種獨(dú)立的制膠器，即一塊玻璃板對(duì)應(yīng)一個(gè)制膠器(圖2右)，使用這種獨(dú)立制膠器能實(shí)現(xiàn)學(xué)生分組獨(dú)立操作，減少相互影響，顯著提高教學(xué)質(zhì)量。

圖2 實(shí)驗(yàn)教學(xué)制膠器更新前后對(duì)比

此外，課題組在SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)部分設(shè)計(jì)了凝膠顯色實(shí)驗(yàn)，方便學(xué)生觀察到總蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分離后的變化，因而可以更直觀地理解聚丙烯酰胺凝膠對(duì)蛋白質(zhì)的分離作用。在此環(huán)節(jié)中，常規(guī)做法是采購(gòu)相關(guān)的試劑，由教師自行配制考馬斯亮藍(lán)染色液及洗脫液。但以上2種溶液的組分中含有大量冰醋酸及乙醇，揮發(fā)性強(qiáng)且氣味很重，往往導(dǎo)致學(xué)生操作時(shí)產(chǎn)生畏懼心理，且該種試劑常規(guī)染色在室溫下需要1 h或更長(zhǎng)時(shí)間，脫色則需要4～24 h，實(shí)驗(yàn)整體時(shí)間太長(zhǎng)難以適應(yīng)本科教學(xué)。課題組經(jīng)過(guò)市場(chǎng)調(diào)研，發(fā)現(xiàn)一款無(wú)味的考馬斯亮藍(lán)快速染色液(碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào): P0017)，洗脫時(shí)僅需使用蒸餾水即可直觀地觀察，且染色時(shí)間僅需30 min，洗脫時(shí)間僅需15～30 min，非常適合本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目教學(xué)使用。

實(shí)驗(yàn)步驟：(1)清洗制膠玻璃板和灌膠架后，使用雙蒸水潤(rùn)洗并烘干，玻璃板干燥后，固定在制膠架上并查漏；(2)參照M.R.格林等[7]的方法，配制聚丙烯酰胺體積分?jǐn)?shù)為12%的分離膠；(3)將玻璃板按照規(guī)范裝入電泳槽中，倒入電極緩沖液至電泳槽內(nèi)腔至沒(méi)過(guò)上樣孔，確保電泳液未漏出后拔出梳子，將蛋白質(zhì)樣品按照設(shè)計(jì)順序加入到膠孔內(nèi)，在實(shí)驗(yàn)記錄本上做好記錄；(4)連接電泳儀，電泳儀設(shè)置恒定電壓為80 V，開(kāi)始電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，設(shè)置電壓為120 V，繼續(xù)電泳60 min，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)底部后關(guān)閉電泳儀；(5)從電泳槽中取出凝膠，丟棄濃縮膠，將分離膠用快速考馬斯亮藍(lán)染色液染色30 min之后棄染色液，并加入蒸餾水進(jìn)行洗脫，直至膠背景清晰，脫色后的膠可以繼續(xù)保存在蒸餾水中。

2.3.3 微管蛋白的Western blot檢測(cè)

存在問(wèn)題及改進(jìn)措施如下所述。常用的Western blot顯色方法主要有底物化學(xué)發(fā)光ECL法以及DAB呈色法，化學(xué)發(fā)光底物法需要使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)?？茖W(xué)實(shí)驗(yàn)中通常使用底物化學(xué)發(fā)光ECL法，但化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)造價(jià)往往較高，購(gòu)置臺(tái)件數(shù)相當(dāng)有限，不能同時(shí)滿足若干學(xué)習(xí)小組同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，將大大延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)課上操作和等待時(shí)間，顯然不利于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)。因此，課題組選用DAB呈色法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，這樣學(xué)生能夠同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并且可憑肉眼實(shí)時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，便于及時(shí)記錄與分析比較，在教學(xué)中更為有效。

詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)操作步驟如下。(1)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜前，將配好的轉(zhuǎn)膜液4 ℃預(yù)冷，用預(yù)冷好的轉(zhuǎn)膜液浸泡轉(zhuǎn)膜夾和濾紙，隨后將裁剪好的PVDF膜放入甲醇中激活20 s，激活后及時(shí)浸泡于轉(zhuǎn)膜液中；將未染色的凝膠、濾紙、激活后的PVDF膜、海綿，按照海綿、濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙和海綿的順序制作成三明治結(jié)構(gòu)，注意PVDF 膜和凝膠間不能存在氣泡；制作好后放入轉(zhuǎn)膜槽并加入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液，將轉(zhuǎn)膜槽置于4 ℃環(huán)境下，轉(zhuǎn)膜儀設(shè)置為恒定電流260 mA，轉(zhuǎn)膜90 min，如果目的蛋白質(zhì)分子量較大，可適當(dāng)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間，如果目的蛋白質(zhì)的分子量較小，則應(yīng)適當(dāng)減少轉(zhuǎn)膜時(shí)間。(2)轉(zhuǎn)膜完成后關(guān)閉轉(zhuǎn)膜儀，將PVDF 膜放入洗膜盒中，用洗滌液洗5 min，隨后倒掉洗滌液加入快速封閉液，置于搖床室溫孵育10 min。(3)封閉后回收封閉液，置于4 ℃冰箱中保存。向洗膜盒中加入漂洗液置于搖床上漂洗PVDF膜3次，每次10 min，后加入tubulin一抗的稀釋液(1∶10 000)，置于搖床上4 ℃孵育過(guò)夜；第2天，回收一抗稀釋液置于4 ℃保存，加入漂洗液置于搖床上漂洗PVDF膜3次，每次10 min；加入羊抗鼠二抗稀釋液液(1∶10 000)，置于搖床上孵育2 h，回收二抗稀釋液置于4 ℃保存，向洗膜盒中加入漂洗液置于搖床上漂洗3次，每次10 min。(4)洗滌完畢后，除去洗滌液，向PVDF膜加入適量DAB染色工作液(DAB顯色液A與DAB顯色液B的體積比為1∶1)，確保能充分覆蓋樣品。(5)室溫避光孵育3～5 min，觀察顯色至預(yù)期深淺。(6)去除DAB染色工作液，用蒸餾水洗滌1～2次終止顯色反應(yīng)，拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及教學(xué)實(shí)踐

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

總蛋白質(zhì)制備得到了2管蛋白質(zhì)提取液，其中家蠶幼蟲(chóng)的蛋白質(zhì)提取液呈現(xiàn)淺褐色，家蠶蛹蛋白質(zhì)提取液呈現(xiàn)深褐色(圖3-A)。利用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量(圖3-B)，家蠶幼蟲(chóng)、蛹蛋白質(zhì)樣品的D(562 nm)值依次為1.087、0.978，通過(guò)計(jì)算可知家蠶幼蟲(chóng)、蛹的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別為0.95 μg/μL、0.83 μg/μL。

接著利用SDS-PAGE電泳對(duì)總蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，可以看出家蠶幼蟲(chóng)、蛹總蛋白質(zhì)提取物中均含有大量分子量大小不同的蛋白質(zhì)，位于55～72 kD的蛋白質(zhì)電泳帶有數(shù)條(圖3-C)，在圖譜中顏色最深的條帶為位于26～34 kD的30 K蛋白。30 K小分子脂蛋白是家蠶5齡幼蟲(chóng)血液中含量最多的一類(lèi)蛋白質(zhì)，由脂肪體合成后釋放，是卵黃蛋白的主要成分之一，其可以分出15個(gè)以上種類(lèi)的蛋白質(zhì)。此時(shí)我們只分離得到相同分子量大小的蛋白質(zhì)，還未能鑒定出微管蛋白。利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，可以看到預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品被成功轉(zhuǎn)移到膜上(圖3-D)。最后通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)及顯色反應(yīng)，可以清晰地看到55 kD左右處有明顯的條帶(圖3-E)，此結(jié)果即可判定為家蠶5齡幼蟲(chóng)和蛹中均存在的微管蛋白，且含量基本一致。以上結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)成功，本課題組設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目切實(shí)可行，可以應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

A. 幼蟲(chóng)與蛹總蛋白質(zhì)提取液 B. BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線 C. 總蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析 D. 總蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜結(jié)果 E. 微管蛋白的免疫印跡分析 C～E. M—蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品， 1—蛹總蛋白質(zhì)(60 μg)， 2—幼蟲(chóng)總蛋白質(zhì)(60 μg)

3.2 教學(xué)實(shí)踐

3.2.1 教學(xué)對(duì)象

參與本次實(shí)驗(yàn)教學(xué)的對(duì)象為西南大學(xué)蠶桑紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院2020級(jí)生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)“明珠”創(chuàng)新班、1班、2班的76名學(xué)生。

3.2.2 實(shí)驗(yàn)課程開(kāi)展方式

授課模式依照先講原理再操作，最后做總結(jié)的時(shí)間進(jìn)度，針對(duì)實(shí)驗(yàn)課程原理及實(shí)驗(yàn)操作環(huán)節(jié)單獨(dú)設(shè)置預(yù)習(xí)試題，內(nèi)容涵蓋實(shí)驗(yàn)原理的理解、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備和試劑配置、儀器設(shè)備操作、實(shí)驗(yàn)流程、操作注意事項(xiàng)等，要求學(xué)生課前查閱資料，分組討論，獨(dú)立完成試題并撰寫(xiě)預(yù)習(xí)報(bào)告，使學(xué)生充分理解實(shí)驗(yàn)原理，了解常見(jiàn)儀器設(shè)備的功能及使用要點(diǎn)。再結(jié)合課堂實(shí)驗(yàn)操作，積極觀察每組成員實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性、流暢性等實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量關(guān)鍵因素，最后依據(jù)各小組實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作及內(nèi)容的回顧總結(jié)，進(jìn)一步激發(fā)學(xué)生的求知欲，主動(dòng)學(xué)習(xí)生物化學(xué)專(zhuān)業(yè)知識(shí)和蠶桑專(zhuān)業(yè)知識(shí)。

本實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目的預(yù)習(xí)試題如下。(1)什么是看家基因？真核生物中有哪些看家基因？(2)聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離原理及凝膠各個(gè)組分的作用是什么？(3)聚丙烯酰胺凝膠的膠濃度如何選擇？(4)實(shí)驗(yàn)時(shí)你發(fā)現(xiàn)你的凝膠沒(méi)有凝固，請(qǐng)簡(jiǎn)述可能的原因，你可以做什么來(lái)促使其凝固？(5)操作時(shí)，如果你將電泳槽外室中的緩沖液填充到大板的高度以上會(huì)發(fā)生什么，如果內(nèi)室中的緩沖液下降到小板的高度以下又會(huì)發(fā)生什么？(6)電泳時(shí)為了節(jié)省時(shí)間，能否將電壓提高到400 V來(lái)加快電泳的速度，電壓設(shè)置范圍是多少？(7)轉(zhuǎn)膜時(shí)膜和膠應(yīng)該如何放置，如果放反了會(huì)怎么樣？

4 討論

4.1 教學(xué)效果評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)報(bào)告能夠全面反映學(xué)生掌握實(shí)驗(yàn)技能的情況。實(shí)驗(yàn)報(bào)告的規(guī)范性、完整性以及學(xué)生的實(shí)驗(yàn)收獲能夠展示實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目教學(xué)的效果。通過(guò)預(yù)習(xí)報(bào)告可以看出大部分學(xué)生能夠清晰理解本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的原理，并表示對(duì)課堂操作充滿期待。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)總結(jié)報(bào)告發(fā)現(xiàn)，各班通過(guò)本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目教學(xué)觀察到轉(zhuǎn)膜成功的學(xué)生為100%，顯色平均成功率92%，實(shí)驗(yàn)成功率高，相較于其他常規(guī)實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目，可以看出學(xué)生在報(bào)告中對(duì)實(shí)驗(yàn)思考討論部分的內(nèi)容明顯增加。另有學(xué)生咨詢(xún)更多實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)細(xì)節(jié)以便將該實(shí)驗(yàn)方法運(yùn)用至自己的科研創(chuàng)新項(xiàng)目中，大部分學(xué)生表示學(xué)習(xí)了該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目所涉及的實(shí)驗(yàn)方法后，能進(jìn)一步體會(huì)到科學(xué)研究的奇妙以及嚴(yán)謹(jǐn)性，也能更好地理解學(xué)習(xí)專(zhuān)業(yè)相關(guān)科研論文，總之對(duì)本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的反響較好。

教學(xué)實(shí)踐證明運(yùn)用優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)教學(xué)方法，學(xué)生能夠以較高質(zhì)量完成實(shí)驗(yàn)，得到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從而建立起實(shí)驗(yàn)的自信心。

4.2 實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中的注意事項(xiàng)

該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的操作過(guò)程較為繁瑣，因此本課題組對(duì)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目在教學(xué)過(guò)程中需反復(fù)強(qiáng)調(diào)的注意事項(xiàng)進(jìn)行了總結(jié)。(1)實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，應(yīng)全程佩戴好口罩和手套，做好防護(hù)。(2)制備凝膠前，制膠器檢漏一定要靜置足夠時(shí)間，確認(rèn)不會(huì)漏液再準(zhǔn)備制膠，在制備凝膠時(shí)一定要將各組分充分混勻。(3)凝膠過(guò)程中需把制膠器放在安全的地方，避免碰觸。(4)拔梳子時(shí)注意緩慢均勻用力，以免上樣孔扭曲。(5)制備樣品時(shí)，上樣緩沖液的移取一定要慢，因?yàn)槠漭^粘稠，不易吸取。(6)蛋白質(zhì)裂解后，一定要保持樣品在冰上，以免降解。(7)使用電泳儀一定要注意安全，操作前一定要關(guān)閉電源，避免觸電。(8)轉(zhuǎn)膜操作避免氣泡存在，膠與PVDF膜應(yīng)保持緊密接觸。

5 結(jié)語(yǔ)

西南大學(xué)蠶桑紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院在家蠶遺傳與種質(zhì)資源研究等方面成果豐碩，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)的融入蠶桑特色的綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目符合時(shí)代需求，選取家蠶的幼蟲(chóng)和蛹作為實(shí)驗(yàn)材料，將生命科學(xué)研究常用實(shí)驗(yàn)方法中的蛋白質(zhì)免疫印跡引入實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)中，能更好地幫助學(xué)生建立學(xué)科自信心，在學(xué)習(xí)經(jīng)典理論知識(shí)的同時(shí)，又能強(qiáng)化認(rèn)知，符合現(xiàn)代教育發(fā)展趨勢(shì)。在該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的教學(xué)實(shí)踐中，預(yù)習(xí)報(bào)告及試題的設(shè)置激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)主動(dòng)性，培養(yǎng)了學(xué)生的獨(dú)立思考能力，實(shí)驗(yàn)課程過(guò)程性考核有效評(píng)價(jià)了學(xué)生的動(dòng)手能力，多樣化的課后思考題增強(qiáng)了學(xué)生的創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)能力。綜上所述，本課題組開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)的具有蠶桑特色的綜合性實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其應(yīng)用于本科教學(xué)的可行性，隨后聯(lián)合教學(xué)方法改革，最終在本科教學(xué)實(shí)踐中獲得了較好的教學(xué)效果，提升了教學(xué)質(zhì)量。今后，將通過(guò)開(kāi)發(fā)更多適用于本科教學(xué)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，改革教學(xué)方法，為蠶桑專(zhuān)業(yè)同類(lèi)院校的生化實(shí)驗(yàn)課提供符合新時(shí)代人才培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目模板，為全國(guó)各學(xué)科的專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)課改革提供參考。