鄔 俊，陳 毅，王 貴，李 雙，姜 爽，王曉波

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116044；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第967 醫(yī)院 藥劑科，遼寧 大連 116021）

乳腺癌是全球女性癌癥相關(guān)死亡最常見的主要原因之一。盡管近年來其在診斷和治療策略方面取得了進(jìn)展，但處于緩解期的患者仍可能出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這常導(dǎo)致乳腺癌患者傳統(tǒng)治療的失敗[1]。腫瘤干細(xì)胞，也稱為腫瘤起始細(xì)胞，是腫瘤中未分化細(xì)胞的一個小而重要的亞群，能夠自我更新并分化為導(dǎo)致腫瘤形成和隨后轉(zhuǎn)移的不同細(xì)胞類型，且其具有高侵襲、轉(zhuǎn)移能力以及復(fù)雜的耐藥機(jī)制，這些特殊性使其成為抗腫瘤藥物研發(fā)的重點(diǎn)和難點(diǎn)[2]。早在2003 年，ALHAJJ M 等[3]首次從乳腺腫塊中分離出少量抗原表型為CD44+/CD24-/low 的乳腺癌干細(xì)胞（BCSCs），并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)具有CD44+/CD24-/low 表面標(biāo)記的細(xì)胞對干細(xì)胞樣細(xì)胞存在高度富集。隨著研究的進(jìn)一步深入，越來越多的證據(jù)證實(shí)BCSCs 是導(dǎo)致乳腺癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和對常規(guī)治療產(chǎn)生抵抗的重要驅(qū)動力[4-5]。因此，如何分離并鑒定這一細(xì)胞亞群以及發(fā)現(xiàn)對其具有抑制作用的藥物對乳腺癌治療至關(guān)重要[6-7]。本研究采用無血清培養(yǎng)法培養(yǎng)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞系中的BCSCs，并考察CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例、自我更新、生長增殖、遷移侵襲以及耐藥能力，從而加深對BCSCs 的認(rèn)識，并探索三種傳統(tǒng)抗腫瘤藥物阿霉素、5-氟尿嘧啶及納米雄黃對BCSCs 的作用，以期為今后預(yù)防乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等相關(guān)治療及療效評價提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試藥

BNP-150CDF1 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（蘇州貝茵醫(yī)療器械有限公司）；Olympus IX73 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；TD4K-Z 型低速離心機(jī)（長沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)有限公司）；C6 型流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；Anthos 2010 型全自動酶標(biāo)儀（英國Biochrom Anthos 公司）。

RPMI1640（批號：8120417）、DMEM-F12（批號：81162041）培養(yǎng)基、胎牛血清FBS（批號：1891605）和B27 添加劑（批號：2234247），均購自美國Gibco 公司；胰蛋白酶（批號：907G048）、DAPI 染色劑（批號：20180105）、結(jié)晶紫染液（批號：1019B041）、青霉素和鏈霉素（批號：20200928），均購自北京索萊寶科技有限公司；人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF，批號：03319303362）、人表皮生長因子（EGF，批號：03316783542），購自北京Novoprotein 公司；人工基底膜Matrigel（批號：0013012，美國BD 公司）；CD44-FITC 單克隆抗體（批號：B277911）、CD24-PE 單克隆抗體（批號：B273848）及FITC（批號：B265825）、PE 同行對照（批號：B302650）、CCK-8 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（批號：71011500），購自美國Biolegend公司）；阿霉素（批號：2468183）、5-氟尿嘧啶（批號：WXBC0190V），購自美國Sigma Aldrich 公司；雄黃（原料藥，湖北中藥研究所，純度98%，批號：140408，并按照文獻(xiàn)[8]方法制備納米雄黃）。

1.2 細(xì)胞

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 有血清培養(yǎng)：MCF-7 乳腺癌細(xì)胞按1 × 105/mL 細(xì)胞密度培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)液（SSM）中，培養(yǎng)于37℃、5%CO2、100%濕度的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面80% ～ 90%時，用含0.04% EDTA 和0.25%胰酶的消化液進(jìn)行消化并傳代；無血清培養(yǎng)：取對數(shù)期的MCF-7 細(xì)胞，用含20 ng/mL 的bFGF、20 ng/mL EGF、2% B27、1%青鏈霉素的DMEM-F12 培養(yǎng)液（SFM）重懸，按5 × 104/mL 細(xì)胞密度接種于低吸附6 孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3 d 進(jìn)行半量換液，待細(xì)胞增殖為致密的懸浮微球體時，機(jī)械吹打成單細(xì)胞懸液，每7 d 傳代一次。

1.3.2 熒光顯微鏡檢測MCF-7 親本細(xì)胞及其懸浮球干細(xì)胞CD44 和CD24 表達(dá)情況 取對數(shù)期MCF-7 親本細(xì)胞及第3 代懸浮球干細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，收集1 × 106個細(xì)胞于離心管中，離心，用PBS 沖洗細(xì)胞3 次，最后將細(xì)胞重懸于100 μLPBS中，隨后分別加入5 μL CD24-PE 和CD44-FITC，混勻避光置于4℃冰箱30 min。PBS 沖洗細(xì)胞3 次，按說明書加入細(xì)胞懸液3 倍體積的核染色劑DAPI 染色15 min 進(jìn)行細(xì)胞定位，PBS 沖洗3 次，取10 μL 滴于載玻片上，置于熒光顯微鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測MCF-7 親本細(xì)胞及其懸浮球干細(xì)胞CD44 和CD24 表達(dá)情況 細(xì)胞收集方法同“1.3.2”項(xiàng)，分別收集5 × 106個細(xì)胞于離心管中，PBS 沖洗細(xì)胞3 次，隨后將細(xì)胞重懸于500 μLPBS，混勻，將兩種細(xì)胞懸液按以下方式各分為5 組，加入相對應(yīng)抗體各5 μL：空白對照組（只含細(xì)胞）、IgG2b-FITC + IgG2a-PE 同型對照組、CD44-FITC單染組、CD24-PE 單染組、CD44-FITC + CD24-PE雙染組。避光置于4 ℃冰箱30 min。PBS 沖洗細(xì)胞3次，重懸于100 μLPBS 中，1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測懸浮球干細(xì)胞培養(yǎng)中CD44+/CD24-亞群比例變化情況 分別取培養(yǎng)至第7、14、21、28、35、42 天處于對數(shù)期的懸浮球干細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，分別收集1 × 106個細(xì)胞于離心管中，PBS 沖洗3 次，將細(xì)胞重懸于100 μL PBS 中，分別加入5 μL CD24-PE 和CD44-FITC，混勻并避光置于4℃冰箱30 min。PBS 沖洗細(xì)胞3 次，重懸于100 μLPBS 中，1h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 SSM 條件下檢測懸浮球干細(xì)胞分化情況取第5 代對數(shù)期懸浮球干細(xì)胞于離心管中，收集懸浮球，將其重懸于SSM 中培養(yǎng)。每2 d 換一次液，在倒置顯微鏡下對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，每3 d 傳代1 次，培養(yǎng)至第3、6 天后收集1 × 106個細(xì)胞進(jìn)行CD44-FITC 和CD24-PE 雙染，步驟同“1.3.4”項(xiàng)，1 h 內(nèi)上機(jī)檢測CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例，并取分化3 d后的貼壁細(xì)胞重懸于SFM 中，按5 × 104/mL 細(xì)胞密度接種于低吸附6 孔板中，觀察細(xì)胞形態(tài)，每7 d 傳代1 次，并于3、35、42 d 后檢測CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖情況 取對數(shù)期MCF-7 親本細(xì)胞和第5 代懸浮球干細(xì)胞，按2 × 103個/孔接種至96 孔板中，親本細(xì)胞用SSM 培養(yǎng)，懸浮球干細(xì)胞分別用SSM 和SFM 培養(yǎng)，并以單一培養(yǎng)基組作為空白組，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。于培養(yǎng)第1、3、5、7、9 天，添加CCK-8 試劑，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h，用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞450 nm 溶液吸光度（A），并以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，各組吸光度平均數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移情況 取對數(shù)期MCF-7 親本細(xì)胞及第5 代懸浮球干細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，重懸于SSM 中，以1 × 105個/孔接種至24孔板中，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞鋪滿孔底后，用10 μL 的槍頭垂直于橫線進(jìn)行劃痕，PBS 沖洗2 次，加入無血清RPMI1640 培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于培養(yǎng)第0、24、48 天于倒置顯微鏡下觀察傷口愈合情況，對各組進(jìn)行拍照記錄并分析，劃痕愈合率（%）= 1 ～ 24 h 或48 h劃痕寬度/0 h 劃痕寬度×100%，計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率。劃痕愈合率越高代表細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.8 Transwell 檢測細(xì)胞的侵襲情況 將Matrigel膠按照1 ∶8 的比例與預(yù)冷的DMEM/F12 混勻后，向Transwell 小室中每孔加入50 μL 基質(zhì)膠，搖晃使其均勻鋪滿小室底膜，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h。取對數(shù)期MCF-7 親本細(xì)胞及第5 代懸浮球干細(xì)胞，分別制備成單細(xì)胞懸液，PBS 沖洗細(xì)胞1 次，將其重懸于無血清RPMI 1640 培養(yǎng)基中。取1 × 105個細(xì)胞均勻接種至小室內(nèi)，小室外加入700 μL SSM，并設(shè)置一組不加細(xì)胞的小室為空白孔，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h 后取出小室，PBS 漂洗2 次，將小室放入3.7%甲醛中固定5 min，100%的甲醇中固定20 min，PBS 漂洗2 次，隨后將小室放入0.1%結(jié)晶紫乙醇溶液中染色15 min，PBS 漂洗2 次，用棉棒輕輕擦去微孔膜上層細(xì)胞，晾干，倒置顯微鏡下觀察小室膜下層細(xì)胞并拍照。隨后將各組小室放入加有400 μL 33%的乙酸的24 孔板中，使細(xì)胞上的結(jié)晶紫全部溶解于乙酸中，最后將溶解了結(jié)晶紫的乙酸溶液移入96 孔板中，用酶標(biāo)儀檢測其在570 nm 下的吸光度。溶液的吸光度越大反應(yīng)穿過膜的數(shù)量越多，細(xì)胞的侵襲能力越強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.9 CCK-8 法檢測三種抗腫瘤藥物對細(xì)胞生長增殖能力影響 取對數(shù)期MCF-7 親本細(xì)胞和第5 代懸浮球干細(xì)胞，親本細(xì)胞用SSM 培養(yǎng)，懸浮球干細(xì)胞分別用SSM 和SFM 培養(yǎng)，按5 × 103個/孔接種至96 孔板中，每孔加入細(xì)胞液體積90 μL，12 h 后分別加入濃度為25、50、100、200、400 μg/mL 的抗腫瘤藥物阿霉素和5-氟尿嘧啶及納米雄黃混懸液10 μL，同時設(shè)置空白對照組，每組設(shè)3 個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后加入10 μL CCK-8，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后用酶標(biāo)儀檢測其在450 nm 處的吸光度（A），由增殖抑制率（%）= 1 -A實(shí)驗(yàn)組/A空白組× 100%，計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。并以藥物濃度為橫坐標(biāo)，抑制率平均值為縱坐標(biāo)繪制曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.10 流式細(xì)胞儀檢測三種抗腫瘤藥對乳腺癌干細(xì)胞CD44+/CD24-亞群比例的影響 取對數(shù)期第5 代懸浮球干細(xì)胞，并制成單細(xì)胞懸液，以每孔5 × 105的細(xì)胞密度鋪于低吸附6 孔板，12 h 后加藥處理，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、阿霉素（2.5、10 μg/mL）組、5-氟尿嘧啶（2.5、10 μg/mL）組、納米雄黃（2.5、10 μg/mL）組，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，收集處理后懸浮球干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)步驟同“1.3.4”，1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 MCF-7 親本細(xì)胞及其懸浮球干細(xì)胞形態(tài)觀察

SSM 條件下，MCF-7 親本細(xì)胞呈類似多邊形進(jìn)行單層貼壁生長；在SFM 條件下，少數(shù)細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中，24 h 后形成由幾個細(xì)胞聚集而成懸浮球，細(xì)胞間連接松散；3 ～ 7 d 后，懸浮球體積逐漸增大，數(shù)目增多，球內(nèi)細(xì)胞結(jié)合緊密，折光性強(qiáng)。7 d 后將懸浮球機(jī)械吹打制成單細(xì)胞懸液并進(jìn)行傳代，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可繼續(xù)呈懸浮球狀生長。該結(jié)果表明在SFM 條件下，部分MCF-7 細(xì)胞能存活并增殖形成具有自我更新能力的懸浮細(xì)胞球，見圖1。

圖1 有血清和無血清培養(yǎng)條件下MCF-7 乳腺癌細(xì)胞形態(tài)觀察顯微圖Fig. 1 Micrograph of cell morphology of MCF-7 breast cancer cell in serum and serum-free culture

2.2 熒光顯微鏡下觀察CD44 和CD24 表達(dá)情況

在倒置熒光顯微鏡下，CD44-FITC 表達(dá)呈綠色，對比MCF-7 親本細(xì)胞和懸浮球干細(xì)胞在CD44 上的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩者都呈高度表達(dá)；CD24-PE 表達(dá)呈紅色，對比兩者在CD24 上的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)親本細(xì)胞高度表達(dá)CD24，而懸浮球干細(xì)胞低表達(dá)CD24，見圖2。

圖2 熒光顯微鏡下MCF-7 親本細(xì)胞及其懸浮球干細(xì)胞CD44、CD24表達(dá)情況Fig. 2 The expression of CD44 and CD24 in MCF-7 parental cells and their suspension stem cells observed under fluorescence microscope

2.3 流式細(xì)胞儀檢測CD44 和CD24 的表達(dá)情況

單染組流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，MCF-7 親本細(xì)胞和懸浮球干細(xì)胞都高表達(dá)CD44，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；而其在CD24 表達(dá)上有差異（P＜0.05），親本細(xì)胞高表達(dá)CD24，而懸浮球干細(xì)胞對CD24 呈低表達(dá)狀態(tài)，這與免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；雙染組流式結(jié)果進(jìn)一步表明，親本細(xì)胞中主要是CD44+/CD24+細(xì)胞亞群，而懸浮球干細(xì)胞主要是CD44+/CD24-細(xì)胞亞群，即SFM 條件下可以有效富集BCSCs，見圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測MCF-7 親本細(xì)胞及其懸浮球干細(xì)胞CD44 和CD24表達(dá)情況Fig. 3 The expression of CD44 and CD24 in MCF-7 parental cells and their suspension stem cells detected by flow cytometry

2.4 懸浮球干細(xì)胞培養(yǎng)中CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例變化情況

與培養(yǎng)第1 代懸浮球干細(xì)胞相比，隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例增加，且當(dāng)培養(yǎng)至第5 代時該比例達(dá)到最高，表明第5 代懸浮球能高效富集BCSCs，所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用第5 代懸浮球干細(xì)胞作為BCSCs 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，見圖4。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測懸浮球干細(xì)胞培養(yǎng)中 CD44+/CD24-細(xì)胞亞群的變化情況Fig. 4 Changes of CD44+/CD24- cell subsets in suspension stem cell culture detected by flow cytometry

2.5 SSM 條件下懸浮球干細(xì)胞分化情況

將所形成的懸浮球重懸于SSM 中，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：6 h 后少數(shù)單個的懸浮球干細(xì)胞開始貼壁；24 h 后可見貼壁細(xì)胞增多，其形態(tài)類似多邊形，其中體積大的懸浮球邊緣細(xì)胞開始貼壁；36 h 后大部分細(xì)胞從懸浮球團(tuán)中遷移出來，與已貼壁的細(xì)胞進(jìn)行融合；72 h 后大部分細(xì)胞球形態(tài)消失，細(xì)胞呈貼壁生長，其細(xì)胞形態(tài)與MCF-7 親本細(xì)胞無明顯差異，表明懸浮球干細(xì)胞具有一定的分化能力，見圖5。

圖5 顯微鏡下觀察SSM 條件下MCF-7 懸浮球干細(xì)胞的分化能力Fig. 5 Differentiation ability of MCF-7 suspension cells in SSM under microscope

收集分化3、6 d 后貼壁細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果表明與分化前的懸浮球干細(xì)胞相比，分化后CD44+/CD24-亞群細(xì)胞比例明顯下降，培養(yǎng)第6 天后，該CD44+/CD24-亞群細(xì)胞比例與親本細(xì)胞比較，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），將分化后3 d 后的貼壁細(xì)胞重懸于SFM 條件下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)3 d 后該比例有所上升，繼續(xù)培養(yǎng)至第5 代，該比例達(dá)到最高，該結(jié)果進(jìn)一步表明懸浮球干細(xì)胞具有一定的自我更新能力，見圖6。

圖6 MCF-7 懸浮球干細(xì)胞誘導(dǎo)分化、SFM 條件下重懸后，細(xì)胞形態(tài)及CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例變化Fig.6 Changes of cell morphology and the proportion of CD44+/CD24-cell subsets after MCF-7 suspension cells were induced to differentiate and resuspended under SFM conditions

2.6 MCF-7 懸浮球干細(xì)胞的增殖能力

比較三組細(xì)胞的生長曲線，可以看出培養(yǎng)第1 天時細(xì)胞含量比較相似，但隨著培養(yǎng)時間的增加，MCF-7 懸浮球分化細(xì)胞增殖速度比懸浮球干細(xì)胞快，懸浮球干細(xì)胞增殖速度比親本細(xì)胞快，即MCF-7 懸浮球干細(xì)胞在SFM 及SSM 條件下，較親本細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力，自培養(yǎng)第2 天后結(jié)果有差異（P＜0.05），見圖7。

圖7 MCF-7 懸浮球干細(xì)胞、懸浮球分化細(xì)胞及其親本細(xì)胞生長增殖能力比較Fig. 7 Comparison of cell growth and proliferation ability of MCF-7 breast cancer mammosphere cells, differentiated cells and their parental cells

2.7 MCF-7 懸浮球干細(xì)胞的遷移能力

與親本細(xì)胞組相比，相同條件下MCF-7 懸浮干細(xì)胞組的劃痕愈合率更大，表明懸浮球干細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力（P＜0.05），見圖8。

圖8 MCF-7 懸浮球干細(xì)胞和親本細(xì)胞遷移能力比較（x ± s，n = 3）Fig. 8 Comparison of migration ability between MCF-7 suspension stem cells and parent cells（x ± s，n = 3）

2.8 MCF-7 懸浮球干細(xì)胞侵襲能力

與MCF-7 親本細(xì)胞組相比，相同條件下懸浮球干細(xì)胞組吸光度值更大（P＜0.05），即穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)更多，懸浮球干細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力，見圖9。

圖9 MCF-7 懸浮球干細(xì)胞和親本細(xì)胞侵襲能力比較（x ± s，n = 3）Fig. 9 Comparison of invasive ability between MCF-7 suspension stem cells and parental cells（x ± s，n = 3）

2.9 三種傳統(tǒng)抗腫瘤藥對MCF-7 乳腺癌親本細(xì)胞、分化細(xì)胞、懸浮球干細(xì)胞的抑制作用

將傳統(tǒng)抗腫瘤藥阿霉素、5-氟尿嘧啶以及納米雄黃（2.5、5、10、20、40 μg/mL）同時作用于MCF-7親本細(xì)胞、懸浮球分化細(xì)胞及懸浮球干細(xì)胞24 h 后，結(jié)果隨著藥物濃度的增加，其對細(xì)胞的抑制率也增加，計(jì)算三種藥物對于三種細(xì)胞的IC50值，對比不同藥物對相同細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)其對細(xì)胞的抑制作用順序?yàn)榘⒚顾兀炯{米雄黃＞5-氟尿嘧啶，見圖10；對比相同藥物對不同細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)同一藥物對懸浮球干細(xì)胞IC50＞懸浮球分化細(xì)胞IC50＞親本細(xì)胞IC50，見圖11，即在SSM 及SFM 條件下，相比于親本細(xì)胞，懸浮球干細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐藥性（P＜0.05）。根據(jù)三種藥物對懸浮球干細(xì)胞的IC50，選取2.5、10 μg/mL 作為給藥濃度，研究三種藥物對乳腺癌干細(xì)胞CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例的影響。

圖10 三種抗腫瘤藥物對MCF-7 親本細(xì)胞、懸浮球分化細(xì)胞以及懸浮球干細(xì)胞的抑制作用比較（x ± s，n = 3）Fig. 10 Comparison of inhibitory effects of three antitumor drugs on MCF-7 parent cells, suspension ball differentiated cells and suspension stem cells（x ± s，n = 3）

圖11 三種抗腫瘤藥物對MCF-7 親本細(xì)胞、懸浮球分化細(xì)胞以及懸浮球干細(xì)胞的IC50 值比較Fig. 11 Comparison of the value of IC50 of three antitumor drugs on MCF-7 parent cells、suspension ball differentiated cells and suspension stem cells

2.10 三種抗腫瘤藥對乳腺癌干細(xì)胞CD44+/CD24-亞群比例的影響

與空白組相比，不同濃度的阿霉素、5-氟尿嘧啶、納米雄黃處理48 h 后，隨著藥物濃度的增加，懸浮球干細(xì)胞CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例明顯降低，低濃度時，阿霉素組的作用更突出（P＜0.05）；高濃度時，納米雄黃組的作用更突出（P＜0.05），表明高濃度組的納米雄黃可有效抑制乳腺癌干細(xì)胞，見圖12。

圖12 三種抗腫瘤藥物對懸浮球干細(xì)胞CD44+/CD24-亞群比例的影響Fig. 12 Effect of three antitumor drugs on the proportion of CD44+/CD24-cell subsets of suspension stem cells

3 討論

目前，CSCs 主要通過細(xì)胞表面標(biāo)志物的高表達(dá)或其功能方面的性質(zhì)進(jìn)行識別和分離，最常用的分離方法是基于特定的細(xì)胞表面生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組合。其它常用的方法包括利用CSCs 高表達(dá)ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、高表達(dá)ALDH1 以及其強(qiáng)大的自我更新和增殖等內(nèi)在特性的側(cè)群細(xì)胞分離法、ALDEFLUOR 測定法以及無血清懸浮球培養(yǎng)法。這些方法已廣泛應(yīng)用于從癌細(xì)胞系和不同腫瘤組織（包括乳腺癌）中分離 CSCs，且研究證明從上述四種方法中分離的 BCSCs 在體內(nèi)具有形成異質(zhì)腫瘤的能力[9]。

本研究采用的無血清培養(yǎng)法能有效富集MCF-7細(xì)胞系中的BCSCs，且隨著培養(yǎng)時間的增加，CD44+/CD24-比例呈上升趨勢；研究發(fā)現(xiàn)在SSM、SFM 條件下BCSCs 較親本細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力，其中分化細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)于懸浮球干細(xì)胞，這可能是由于血清對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用；同時研究還發(fā)現(xiàn)在SSM 以及SFM 條件下BCSCs 較親本細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐藥性，且BCSCs 耐藥性強(qiáng)于分化細(xì)胞，這可能是由于誘導(dǎo)分化顯著降低CD44+/CD24-BCSCs 比例所致。目前臨床上治療乳腺癌常采用化療藥物如阿霉素、5-氟尿嘧啶、紫杉醇等，但其毒副作用較大，常聯(lián)合中藥進(jìn)行治療以增效減毒。

近年來隨著對中藥抗腫瘤作用的研究，發(fā)現(xiàn)丹參酮、柴胡皂苷D、散沫花素等中藥成分能有效抑制乳腺癌細(xì)胞的生長增殖[10-11]，納米雄黃作為一種傳統(tǒng)中藥，研究發(fā)現(xiàn)能有效抑制肺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞，并對白血病干細(xì)胞、肺癌干細(xì)胞表現(xiàn)出良好的抑制作用[12-13]，本研究發(fā)現(xiàn)其能有效降低乳腺癌干細(xì)胞比例，提示納米雄黃可能是抑制乳腺癌有效藥物之一，這為臨床研制有效的抗乳腺癌的藥物帶來了更多的可能性。本研究對BCSCs 的鑒定僅基于BCSCs 最典型的表面標(biāo)志物CD44 和CD24，近年來還發(fā)現(xiàn)了ALDH1、ABCG2、CD133、CD49f 等標(biāo)志物[14-15]。本研究對納米雄黃對乳腺癌MCF-7 細(xì)胞及其BCSCs 的作用進(jìn)行了初步的研究，其對BCSCs 侵襲轉(zhuǎn)移、懸浮球形成以及分化能力的影響以及其對BCSCs 分子水平的作用需要進(jìn)一步探討，為未來研制納米雄黃抗乳腺癌藥物提供更多理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)無血清懸浮培養(yǎng)法可有效富集CD44+/CD24-BCSCs，該方法成本較低、 操作簡單、能快速、有效地獲得BCSCs，且對BCSCs 性質(zhì)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)其具有強(qiáng)大的自我更新、生長增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力以及耐藥性，這可能是導(dǎo)致乳腺癌容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的原因之一，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)納米雄黃可有效抑制乳腺癌MCF-7 細(xì)胞生長增殖能力及降低CD44+/CD24-BCSCs 比例。對BCSCs 分離方法的探索、性質(zhì)的認(rèn)識以及發(fā)現(xiàn)有效抑制BCSCs 的中藥成分有助于針對BCSCs 靶向治療的發(fā)展，為臨床治療乳腺癌提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。