王維 韓光宇 宋國(guó)權(quán) 李海林

結(jié)腸癌是全世界主要的消化道惡性腫瘤之一，部分患者在發(fā)現(xiàn)癥狀時(shí)往往伴有腹腔轉(zhuǎn)移[1]。異基因造血干細(xì)胞移植是作為針對(duì)免疫應(yīng)答的靶向治療[2]，即移植物抗腫瘤（GVT）效應(yīng)對(duì)結(jié)腸癌的治療效果[3]。通過(guò)異基因造血干細(xì)胞移植模型，由脾淋巴細(xì)胞輸注聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療提高同種異體移植物的耐受能力[4]。在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)PS 外翻是腫瘤細(xì)胞常見的現(xiàn)象，存在于原發(fā)的惡性病變[5]以及轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞[6]；同時(shí)環(huán)磷酰胺也可降低T 淋巴細(xì)胞數(shù)量[7]。因此通過(guò)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠CT-26結(jié)腸癌模型中外周血T 淋巴細(xì)胞及腹水中癌細(xì)胞PS 外翻表達(dá)情況評(píng)估小鼠GVT 效應(yīng)，判斷治療結(jié)腸癌的效果。

1 材料與方法

1.1 材料 鼠源CT-26 結(jié)腸癌細(xì)胞購(gòu)買于ATCC 細(xì)胞庫(kù)CRL-2638。

1.2 主要儀器與試劑 流式細(xì)胞儀（BD），胎牛血清（FBS）（Hyclone），淋巴細(xì)胞分離液（碧云天公司），環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞制藥廠），PE-抗-CD4（Biolegend），F(xiàn)ITC-抗CD3 抗 體（Biolegend），PS外翻試劑盒（BD）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2 d 進(jìn)行換液。

1.3.2 結(jié)腸癌模型建立 通過(guò)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼠源CT-26 結(jié)腸癌細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，于各組小鼠皮下接種1×106個(gè)CT-26 小鼠細(xì)胞。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 A 組接種瘤細(xì)胞不予任何特殊處理；B 組接種于第7 天輸注數(shù)量0.5×107/只脾淋巴細(xì)胞、第14 天輸注數(shù)量0.5×107/只脾淋巴細(xì)胞、第21 天輸注數(shù)量1.0×107/只脾淋巴細(xì)胞；C 組接種第3 天腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg（20 mg/mL），于第7 天輸注數(shù)量0.5×107/只脾淋巴細(xì)胞、第14天輸注數(shù)量0.5×107/只脾淋巴細(xì)胞、第21 天輸注數(shù)量1.0×107/只脾淋巴細(xì)胞。

1.3.4 流式細(xì)胞檢測(cè)外周血T 淋巴 BALB/C 眼底靜脈采血。各管分別為：（1）IgG1/IgG2 10 μL；（2）CD3 10 μL。在室溫暗室下加入紅細(xì)胞裂解液1 mL，室溫下避光放置10 min，1 000 r/min 離心5 min，底物用PBS 洗滌2 mL，1 000 r/min 離心5 min，棄上清加入1 mL PBS，上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)腹水PS 外翻 用1mL注射器抽小鼠腹水，1 500 r/min 離心5 min收集。100μL 的Binding Buffer懸浮細(xì)胞。1μL Annexin V-EGFP 混勻后，同時(shí)加入1μL Propidium Iodide混勻。每只流式管加入500μL Binding Buffer，上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 兩組間計(jì)量資料的比較分析根據(jù)資料是否符合正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；多組間計(jì)量資料的比較分析根據(jù)資料的方差是否齊同采用方差分析或Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)或Fisher 精確概率檢驗(yàn)進(jìn)行比較。兩組生存時(shí)間的比較采用Log-rank 檢驗(yàn)（又稱Mantel-Cox 檢驗(yàn)）。采用 SPSS 22.0 和 GraphPad Prism 9.3 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。P<0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血T 淋巴細(xì)胞亞群比例 流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血CD3+T 細(xì)胞的百分比，其中CD3+T 細(xì)胞中A 組為（57.3±3.71）%，B 組為（66.5±3.85）%，C 組為（67.9±4.34）%，C 組較A 組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.51，P<0.05），B 組較A 組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.26，P<0.05），B 組與C 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.51，P>0.05），見圖1。

圖1 T淋巴細(xì)胞亞群比例

2.2 PS 外翻情況 A 組PS 外翻表達(dá)陽(yáng)性率為（79.1±2.1）%，B 組與C 組均無(wú)腹水。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第14 天檢測(cè)PS 外翻情況，A 組為（84.7±4.53）%，B 組 為（83.3±2.15）%，C 組 為（80.6±2.23）%，三組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.36，P=0.17）。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第21 天檢測(cè)PS 外翻情況，A 組為（85.4±1.1）%，B 組 為（58.3±3.31）%，C 組為（51.8±1.72）%，A 組與B 組、A 組 與C 組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.12，P<0.05；t=3.74，P<0.05）。見圖2。

圖2 PS外翻表達(dá)情況

3 討論

關(guān)于預(yù)測(cè)腫瘤的標(biāo)記物一直是目前研究的重點(diǎn)方向，腫瘤細(xì)胞在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)PS 外翻情況，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)PS 可以作為腫瘤的標(biāo)記物[8-9]。由于PS 可以作為腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記物，因此可以考慮作為新的治療標(biāo)記物[6]。關(guān)于PS 外翻在惡性腫瘤中的相關(guān)表達(dá)于1991 年已經(jīng)進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道[10-11]。腫瘤細(xì)胞膜表達(dá)PS 現(xiàn)象[12-13]，不僅可以作為凋亡的信號(hào)[14]，而且可以作為標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)[15-16]。通過(guò)實(shí)驗(yàn)分組發(fā)現(xiàn)B 組、C 組PS 外翻表達(dá)情況均較A 組下降明顯，因此可以作為臨床診斷指標(biāo)。T細(xì)胞變化是決定著異基因免疫治療的成敗[17-19]，因此通過(guò)檢測(cè)T 細(xì)胞分群可以明確治療效果[20]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)B、C 組在淋巴細(xì)胞輸注后，CD3+T 細(xì)胞表達(dá)均較A 組顯著上升（P<0.05）。本實(shí)驗(yàn)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)腸癌小鼠CT-26 外周血T 淋巴細(xì)胞分群及腹水PS 外翻情況可以反映誘導(dǎo)小鼠GVT 效應(yīng)，評(píng)估結(jié)腸癌的療效。