張偉奇，周碩，李鐵成*

(錦州醫(yī)科大學(xué)：1附屬第三醫(yī)院麻醉科，2附屬第一醫(yī)院乳腺外科，遼寧 錦州 121000)

近年來，缺血性心臟病死亡率顯著增高[1]。使血流迅速再通是有效改善急性心肌缺血和損傷癥狀的關(guān)鍵。但是，也可能因此造成心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury, MI/RI)，使心臟的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變并導(dǎo)致功能障礙。目前，多種臨床方法已被廣泛使用，但充分有效的預(yù)防或治療仍然缺乏[2]。強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)是MI/RI復(fù)雜的多因素發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵[3]，核因子(nuclear factor, NF)-κB是參與炎癥調(diào)節(jié)最突出的轉(zhuǎn)錄因子之一[4]。內(nèi)源性免疫受體TOLL樣受體-4(toll-like receptor 4，TLR4)通過復(fù)雜的相互作用，誘導(dǎo)IκB表達(dá)調(diào)控NF-κB定位從而阻止P50、P65移位入細(xì)胞核調(diào)控其下游多種炎癥因子反應(yīng)[5,6]。因此，阻止TLR4/NF-κB信號通路的過多表達(dá)對MI/RI有重要意義。

匹立尼酸(pirinixic acid，又名Wy-14643)是人工合成的過氧化物酶體增殖物激活受體-a(peroxisome proliferator-activated receptor a，PPARa)的激動劑，最初作為降脂劑開發(fā)的多功能的脂肪酸模擬物。Wy-14643除了可降血脂和降血糖外，還具有抗血管內(nèi)皮收縮及降壓保護(hù)的作用[7]，可通過抗炎癥、抗氧化來保護(hù)肝腎等損傷。本研究旨在探討匹立尼酸對大鼠MI/RI模型中炎癥反應(yīng)的影響，并就其機(jī)制進(jìn)行初步分析。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

Wy-14643、二甲基亞砜(dimethyl Sulfoxide，DMSO)購于上海源葉生物科技有限公司；氯化硝基四氮唑藍(lán)(nitroblue tetrazolium，NBT)購于南京探求生物技術(shù)有限公司；β-actin抗體購于武漢三鷹生物科技有限公司；TLR4、NF-κB購于深圳市科潤達(dá)生物工程有限公司；肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)試劑盒購于上海酶聯(lián)科技生物有限公司；蘇木精-伊紅染色試劑盒(hematoxylin-eosin，HE)、聚氰基丙烯酸正丁酯蛋白測定試劑盒(bicinchoninic acid，BCA)、核蛋白提取試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；超聲波破碎儀產(chǎn)自美國Sonics公司；生物顯微鏡、切片機(jī)、烤片機(jī)產(chǎn)自德國Leica公司；垂直電泳系統(tǒng)、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)產(chǎn)自美國伯樂公司；高速冷凍離心機(jī)產(chǎn)自德國Sigma公司；小動物呼吸機(jī)、心電監(jiān)護(hù)儀產(chǎn)自成都泰盟公司；其他由錦州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心實驗室提供。

1.2 實驗動物及分組

40只大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，根據(jù)隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)分為5組，每組各8只：(1)假手術(shù)組(Sham組)；(2)缺血再灌注組(MI/RI組)；(3)匹立尼酸低劑量組(low dose, W1組)；(4)匹立尼酸中劑量組(middle dose, W2組)；(5)匹立尼酸高劑量組(high dose,W3組)。藥物組W1、W2、W3分別于術(shù)前2 d、1 d、1 h腹腔注射匹立尼酸1、4、8 mg/kg，匹立尼酸以10% DMSO(1 ml/kg)作為溶劑；Sham組和MI/RI組于上述時間注射等體積等濃度的DMSO溶劑。

1.3 模型制作及處理

參考文獻(xiàn)[8]，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。10%水合氯醛(3 ml/kg)下腹部注射，靜待數(shù)分鐘大鼠仰臥大字位于操作臺，記錄心電圖變化，并插管人工通氣(潮氣量2 ml/100 g，頻率60次/min)。剪開左胸3、4肋間皮膚，小心剪斷第2、3肋骨，暴露術(shù)野，分離心包，識別冠狀動脈，5-0縫合線結(jié)扎MI/RI組、匹立尼酸各劑量組左前降支(Sham組僅做穿線處理)，見心電圖ST-T升高，缺血30 min后松結(jié)，再灌注1 h，升高區(qū)下降50%即造模成功。

1.4 檢測方法

1.4.1 酶聯(lián)免疫吸附法測定CK-MB、LDH、TNF-α及IL-6 造模成功后，于頸總動脈處取血，室溫存放60 min，離心(3 000轉(zhuǎn)/min,10 min)，上清液-80 ℃儲存，待備好所有大鼠血清，將樣本融化加入樣本孔混勻，封板，于37 ℃恒溫箱1 h，反復(fù)清洗濾紙吸干重復(fù)5次，加底物，避光反應(yīng)15 min，最后加終止液測吸光度。

1.4.2 NBT染色 取血后，每組隨機(jī)選4個心臟，僅保留左心室，-20 ℃速凍1 h等厚切4片，0.2%NBT溶液37 ℃水浴染色。梗死的心肌不染色，呈淡紅色；著色后呈暗紫色為正常組織。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)。心肌梗死面積(%)=梗死部分面積/總心肌面積×100%。

1.4.3 HE染色 每組剩下的4個心臟，一半-80 ℃保存用于Western blot測定，另一半放入4%多聚甲醛，制作切片，脫蠟,乙醇多次脫水，沖洗3 min，HE染色，上行梯度酒精各5 min，透明處理，封閉切片，光學(xué)顯微鏡拍照觀察。

1.4.4 Western blot檢測蛋白質(zhì)表達(dá) 從備于-80 ℃的心肌組織中融化提取核孔蛋白，檢測蛋白質(zhì)濃度并置成樣本。上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，洗膜，密封，加一、二抗體孵育后再洗膜。行條帶的灰度值分析，計算心肌組織TLR4、NF-κBp65蛋白的相對表達(dá)數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組血清LDH、CK-MB含量的比較

與Sham組比較，MI/RI組、匹立尼酸藥物組CK/MB、LDH表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；與MI/RI組比較，匹立尼酸藥物組CK/MB、LDH含量顯著下降(P<0.01)；與W1組比較，W3組CK/MB、LDH含量明顯減少(P<0.01)；與W2組比較，W3組CK/MB明顯降低(P<0.05；表1)。

表1 各組CK/MB、LDH表達(dá)量比較

2.2 各組血清TNF-α和IL-6含量的比較

與Sham組比較，MI/RI組、匹立尼酸各藥物組TNF-α、IL-6表達(dá)水平顯著上升(P<0.01)；與MI/RI組比較，匹立尼酸各藥物組TNF-α、IL-6含量明顯下降(P<0.01，P<0.05)；與W1組比較，W2、W3組TNF-α含量顯著減少(P<0.01)，W3組IL-6含量顯著降低(P<0.01)；與W2組比較，W3組TNF-α、IL-6含量明顯降低(P<0.01，P<0.05；表2)。

表2 各組TNF-α和IL-6表達(dá)量比較

2.3 各組心肌梗死面積的比較

從著色程度判斷，Sham組未發(fā)生梗死。與Sham組對比，MI/RI組大鼠心肌梗死面積明顯擴(kuò)大(35.88%和0.00%，P<0.01)；與MI/RI組比較，W1、W2、W3組梗死面積劑量相關(guān)性明顯降低(28.00%、16.93%、8.38%和35.88%，P<0.01或P<0.05；圖1)。

圖1 各組心肌梗死面積的比較

2.4 各組心肌組織TLR4和NF-κBp65蛋白的表達(dá)比較

相較于Sham組，MI/RI組TLR4和NF-κBp65表達(dá)大幅度上調(diào)(P<0.01)，匹立尼酸各劑量組的蛋白表達(dá)變化明顯(P<0.01，P<0.05)；相較于MI/RI組，匹立尼酸各組TLR4和NF-κBp65表達(dá)量呈劑量相關(guān)的下降趨勢(P<0.01)；匹立尼酸W1組與W3組TLR4和NF-κBp65表達(dá)有顯著差異(P<0.01)；相較于匹立尼酸W2組，W3組TLR4和NF-κBp65表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01；圖2)。

圖2 各組心肌組織TLR4和NF-κBp65蛋白的表達(dá)比較

2.5 各組心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變

光學(xué)顯微鏡下，Sham組心肌纖維緊密排列，結(jié)構(gòu)正常；MI/RI組，細(xì)胞腫脹，核邊緣化，間質(zhì)水腫肌纖維斷裂，核周見炎癥性空泡；W1組，細(xì)胞內(nèi)腫脹界限不清，伴少量出血；W2組可見細(xì)胞間質(zhì)水腫，散在炎性空泡；W3組細(xì)胞間質(zhì)輕度水腫，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整(圖3)。

圖3 各組心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變

3 討 論

心源性休克是急性心肌梗死患者致死的主要原因，通過經(jīng)皮冠狀動脈介入或冠狀動脈旁路移植等方法可進(jìn)行緊急血運(yùn)重建，保證心臟各功能正常運(yùn)行[9,10]。然而，降低心肌梗死死亡率的同時也引發(fā)了由中性粒細(xì)胞驅(qū)動的炎癥過程。TNF-α和各類型白細(xì)胞介素家族等細(xì)胞因子是炎癥反應(yīng)的標(biāo)志性物質(zhì)。IL-6決定多種炎癥相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)，介導(dǎo)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥等相對復(fù)雜的疾病中的作用已被證實[11]，心肌亦是如此[12]。多種炎癥性心臟病的病理變化過程中，TNF-α和IL-6等細(xì)胞因子于通透性改變的細(xì)胞膜迅速入血，大量循環(huán)炎癥細(xì)胞相互作用浸潤受損的心肌，導(dǎo)致缺血再灌注損傷[13,14]。本實驗結(jié)果與此前研究結(jié)論相符合，觀察到模型組TNF-α和IL-6含量比假手術(shù)組顯著增高，說明心肌損傷與炎癥反應(yīng)相關(guān)，各劑量藥物預(yù)處理組TNF-α和IL-6含量較模型組均降低，其中以高劑量組下降最為明顯。同時，大量存于心肌細(xì)胞中的CK-MB活性及質(zhì)量的聯(lián)合檢測,早在發(fā)病2 h內(nèi)就提示急性心肌梗死的發(fā)生，是心肌酶譜中最先上升且幅度最大的心肌酶。但其單一指標(biāo)對心肌梗死患者的檢測缺乏特異性[15]。LDH則是心肌主要的功能酶，心肌損傷時入血的CK-MB和LDH可早期反映心肌損傷程度，二者綜合分析診斷可顯著提高急性心肌梗死的早期診斷率。本實驗結(jié)果中，模型組CK-MB和LDH含量仍為最高，且在藥物預(yù)處理后的心肌組織中檢測到的CK-MB和LDH含量呈藥物依賴作用的降低，說明Wy-14643可減少再灌注后的心肌損傷。同時,任何原因引起過長時間的心肌缺血最終都會發(fā)展為心肌梗死，心肌梗死面積的大小與缺血時間及嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，判斷梗死面積并分級有助于采取階段性臨床措施以改善心功能。梗死面積作為患者死亡率的預(yù)測因素，以上方法均可有效、準(zhǔn)確、及時地判斷病情，為挽救心肌爭取寶貴時間。本實驗根據(jù)心肌梗死區(qū)面積的大小來判斷心肌缺血再灌注后心肌損傷的嚴(yán)重程度，并且通過觀察心肌組織病理學(xué)變化證實梗死面積最大的模型組心肌組織病理損傷也最嚴(yán)重，并據(jù)W1、W2、W3組結(jié)果推斷出Wy-14643對心肌缺血再灌注損傷可起到保護(hù)作用。

NF-κB發(fā)現(xiàn)于B淋巴細(xì)胞并幾乎存在所有動物細(xì)胞中，具有兩種通路[16]，集體的應(yīng)激反應(yīng)、凋亡、免疫及炎癥觸發(fā)均離不開NF-κB的密切調(diào)控[17]。本研究進(jìn)一步從NF-κB信號通路入手，研究Wy-14643是否和MI/RI有關(guān)聯(lián)。有研究表明，通過抑制NF-κB信號通路的激活可防御脂多糖誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放[18]，還可減輕炎癥導(dǎo)致的疼痛感覺[19]。本實驗選用的匹立尼酸作為PPARa激動劑，可通過上調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)PPARa表達(dá)，抑制NF-κB的活化，保護(hù)冷保存損傷的肝臟組織。本實驗得出，與假手術(shù)組相比，MI/RI組TLR4、NF-κBp65表達(dá)水平均上調(diào)，表明在MI/RI時可能引發(fā)了由NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；相比于MI/RI組，各藥物組TLR4、NF-κBp65表達(dá)減少，且隨劑量增加這種變化逐漸顯著，可能與Wy-14643預(yù)處理抑制TLR4/NF-κB信號通路誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。綜合結(jié)果顯示，Wy-14643對心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

綜上，匹立尼酸在癌癥和神經(jīng)變性的治療很有成效[20]。本實驗以動物水平為例初步證明，匹立尼酸可抑制NF-κB信號通路，降低炎癥反應(yīng)，對心肌有保護(hù)作用。下一步將從體外細(xì)胞水平深入研究，將為匹立尼酸在心血管領(lǐng)域的應(yīng)用提供進(jìn)一步臨床意義。