馬騰飛，戰(zhàn)雅微，劉 悅，李志強(qiáng)

(國(guó)際竹藤中心；國(guó)家林業(yè)和草原局/北京市共建竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102)

隨著塑料的使用范圍越來越廣，產(chǎn)生的塑料廢棄物也越來越多，其中包裝材料、農(nóng)用材料、醫(yī)用材料等占據(jù)絕大部分[1-2]。以乳酸為單體、經(jīng)化學(xué)方法合成的聚乳酸是一種新型生物降解材料。乳酸是一種極具潛力和用途廣泛的生物質(zhì)衍生化學(xué)平臺(tái)化合物。目前我國(guó)乳酸工業(yè)化生產(chǎn)主要采用玉米為原料，經(jīng)粉碎、液化、水解、發(fā)酵生產(chǎn)乳酸[3]。雖然以玉米淀粉制備乳酸的技術(shù)已較為成熟，但是受國(guó)際環(huán)境變化及2020年新冠肺炎疫情影響，工業(yè)化生產(chǎn)乳酸勢(shì)必要面臨與人爭(zhēng)糧的嚴(yán)重問題。以玉米秸稈、大豆秸稈、玉米芯、米糠和蔗渣等農(nóng)林廢棄物可制備乳酸，轉(zhuǎn)化率一般在20%～80%，暫未見竹材制備乳酸相關(guān)報(bào)道[4-6]。近年來我國(guó)竹材加工利用產(chǎn)業(yè)正蓬勃發(fā)展，竹林面積達(dá)641.16 hm2，可為竹產(chǎn)業(yè)提供充足的原料[7]。而主要竹產(chǎn)品的竹材原料利用率分別為：竹家具30%、竹席45%～50%、竹地板20%～25%，在對(duì)竹材采伐及加工利用過程中會(huì)產(chǎn)生大量廢竹[8]。因此，以竹材特別是竹材采伐和加工剩余物為原料制備液體燃料和化學(xué)品，是當(dāng)前竹資源綠色可持續(xù)利用途徑之一[9]。本研究以竹材為原料，通過甲醛/二氧六環(huán)溶液預(yù)處理來破壞竹材的抗降解屏障，提高纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的得率，再利用水解液中的單糖發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，以期為竹材及其加工剩余物制備聚乳酸可降解材料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

慈竹(BambusaemeiensisL.C.China & H.L.Fang)，兩年生，采于廣西壯族自治區(qū)崇左市江州區(qū)馱盧鎮(zhèn)。將竹材劈成竹條并烘干后，經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎，取粒徑0.25～0.38 mm的慈竹粉末備用。

1，4-二氧雜環(huán)己烷(二氧六環(huán))、鹽酸、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、CaCO3、蛋白胨、甲醛和乳酸等，均為市售分析純。纖維素酶(C1794-5KU)，Sigma公司；β-葡萄糖苷酶，諾維信(中國(guó))投資有限公司；乳酸菌酸奶發(fā)酵劑(4 g/L，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳雙歧桿菌、植物乳桿菌和干酪乳桿菌)，北京川秀科技有限公司。

KYC-100C恒溫?fù)u床；Metrohm 850離子色譜儀，瑞士萬通(中國(guó))有限公司；100 mL水熱合成反應(yīng)釜；YZJXFQ-6均相反應(yīng)器；Quanta 200HV高分辨場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電鏡(SEM)，PHILIPS公司；X PERTPRO X射線衍射(XRD)儀，Panalytical公司；SBA-40E型葡萄糖-乳酸生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所。

1.2 甲醛/二氧六環(huán)預(yù)處理竹材

稱取1.25 g竹粉，置于100 mL水熱合成反應(yīng)釜中，依次加入45 mL二氧六環(huán)、2.1 mL鹽酸(或1.1 mL硫酸)和3～5 mL的甲醛試劑。將水熱合成反應(yīng)釜置于均相反應(yīng)器中，在溫度80 ℃，旋轉(zhuǎn)速率為20 r/min的條件下，預(yù)處理8 h。不加入甲醛的樣品在相同的條件下反應(yīng)，作為對(duì)照樣。

預(yù)處理結(jié)束后，反應(yīng)釜自然冷卻至室溫，打開密閉反應(yīng)釜，使用真空泵、砂芯過濾裝置和45 μm孔徑有機(jī)系微孔過濾膜進(jìn)行固液分離。向過濾后所得廢液中加入去離子水以析出木質(zhì)素沉淀，所得的濾液存于4 ℃ 冰箱中用于濾液化學(xué)成分分析。固體樣品先用25 mL二氧六環(huán)洗滌至淡黃色，以沖洗去除殘留的甲醛和鹽酸，再用去離子水對(duì)其洗滌直至洗滌水為無色，除去殘留的二氧六環(huán)。預(yù)處理得到的固體樣品取部分在103 ℃烘箱中烘干測(cè)量含水率，其余部分保存于4 ℃冰箱中用于化學(xué)成分分析和酶水解。每個(gè)預(yù)處理?xiàng)l件均進(jìn)行3次試驗(yàn)，結(jié)果記為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。

1.3 預(yù)處理后樣品酶水解

以預(yù)處理后得到的固體樣品用于酶水解實(shí)驗(yàn)，在50 mL三角瓶中進(jìn)行，底物添加量為20 g/L，添加到20 mL pH值為4.8的乙酸/乙酸鈉緩沖溶液中，酶用量為纖維素酶10 FPU/g(以底物質(zhì)量計(jì)，下同)、β-葡萄糖苷酶30 IU/g(以底物質(zhì)量計(jì)，下同)。酶解溫度為50 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min，酶解時(shí)間為24 h，未經(jīng)預(yù)處理的竹粉原料作為空白對(duì)照。為了提高酶水解后葡萄糖的得率，對(duì)竹材預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化，將1.2節(jié)的2.1 mL鹽酸換成1.1 mL硫酸，酶解條件同時(shí)優(yōu)化為纖維素酶用量20 FPU/g、β-葡萄糖苷酶30 IU/g，酶解時(shí)間48 h。

1.4 酶水解液發(fā)酵產(chǎn)乳酸

將酶水解液置于高壓滅菌鍋中滅菌1 h，取出待其自然冷卻后，再加入1 mL營(yíng)養(yǎng)鹽、0.3 g/L KH2PO4、5 g/L(NH4)2SO4、0.75 g/L MgSO4·7H2O、0.2 g/L ZnSO4·7H2O、10 g/L CaCO3、3.5 g/L蛋白胨。以NaHCO3調(diào)節(jié)酶解液至pH值為6.8，按酶水解液中葡萄糖質(zhì)量的3%接種量接入乳酸菌，在42 ℃、200 r/min 的條件下恒溫振蕩發(fā)酵24 h。

1.5 分析方法

1.5.1化學(xué)組分分析 原料慈竹和預(yù)處理固體樣品的纖維素、半纖維素含量按照美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL)推薦的方法測(cè)定[10]。

1.5.2SEM分析 預(yù)處理后固體樣品的表面形貌，采用Quanta 200HV高分辨場(chǎng)發(fā)射環(huán)境SEM進(jìn)行觀察，放大倍數(shù)為500倍。

1.5.3XRD分析 預(yù)處理后固體樣品結(jié)晶度使用XRD儀分析，Cu靶Kα輻射(40 kV，40 mA)，譜圖范圍(2θ)為5～45 °，掃描速率為5(°)/min。每個(gè)樣品的相對(duì)結(jié)晶度(ICr)按Segal提出的經(jīng)驗(yàn)公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：I002—晶格衍射極大強(qiáng)度；I15.8°—無定形區(qū)背景散射強(qiáng)度。

1.5.4乳酸質(zhì)量濃度測(cè)定 乳酸采用SBA-40E型葡萄糖-乳酸生物傳感分析儀測(cè)定，該儀器以固定化酶為關(guān)鍵元件，配備兩支生物探測(cè)電極，可以在20 s內(nèi)得到葡萄糖及乳酸的定量分析結(jié)果，乳酸的最大檢出限為0.5 g/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理對(duì)竹材化學(xué)組成的影響

預(yù)處理是竹材生物轉(zhuǎn)化制取液體燃料及化學(xué)品過程中一個(gè)關(guān)鍵且高成本的步驟。表1列出了甲醛/二氧六環(huán)溶液中甲醛用量對(duì)預(yù)處理后固體樣品化學(xué)組成的影響。由表1可知，固體樣品得率在51.7%～55.3%之間。酸性二氧六環(huán)預(yù)處理可以脫除半纖維素和部分木質(zhì)素，從而提高了固體樣品中纖維素的含量。而添加不同體積的甲醛對(duì)預(yù)處理后固體樣品收率影響不大，原因是在預(yù)處理過程中甲醛不參與脫除半纖維素和木質(zhì)素，其主要與降解木質(zhì)素發(fā)生接枝反應(yīng)，減少木質(zhì)素降解物再次發(fā)生團(tuán)聚而影響后續(xù)酶水解效率。添加甲醛可以保留木質(zhì)素的反應(yīng)活性[9]，為后續(xù)研發(fā)木質(zhì)素衍生產(chǎn)品打基礎(chǔ)。當(dāng)甲醛添加量增加時(shí)，固體樣品中纖維素的含量會(huì)降低。從固體樣品中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三者之和來看，隨著甲醛量的加大，總含量就越小。原因可能是甲醛用量的增大導(dǎo)致二氧六環(huán)預(yù)處理效果降低，從而使底物中的木質(zhì)素與甲醛的接枝反應(yīng)產(chǎn)物含量增加。

表1 甲醛用量對(duì)竹材固體樣品化學(xué)組成的影響1)

在對(duì)所有預(yù)處理廢液進(jìn)行糖分分析后，發(fā)現(xiàn)廢液中的木糖含量可以忽略不計(jì)，說明在預(yù)處理過程中，半纖維素幾乎全部被降解了。這可能是由于二氧六環(huán)和HCl將半纖維素降解，與預(yù)處理溶劑中是否添加甲醛關(guān)系不大。

2.2 固體樣品分析

2.2.1SEM分析 圖1為竹材及其預(yù)處理固體樣品的SEM照片。由圖1(a)可知，未處理的竹粉表面尚有一層蠟質(zhì)。蠟質(zhì)層會(huì)阻礙纖維素對(duì)酶的吸附能力，從而降低酶水解效率[11]。而使用二氧六環(huán)作為有機(jī)溶劑的預(yù)處理可將竹材中大部分蠟質(zhì)溶解脫除，使酶與纖維素的可及度大幅增加，從而提高了酶水解葡萄糖得率。由圖1(b)可以發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理底物不再成纖維束狀且結(jié)構(gòu)疏松，表明木質(zhì)素脫除提高了孔隙率，增大反應(yīng)可及性和底物比表面積。然而，伴隨甲醛添加量的逐步增大，預(yù)處理底物表面的纖維更加致密，反應(yīng)可及性和比表面積減小，以至于酶不能輕易到達(dá)竹材內(nèi)部進(jìn)行酶水解反應(yīng)；其表面纖維卷曲程度也逐漸變小，說明甲醛的添加對(duì)木質(zhì)素和纖維素宏觀結(jié)構(gòu)均起到了保護(hù)作用。

a.未處理竹材untreated bamboo；b.0 mL；c.3 mL；d.4 mL；e.4.5 mL；f.5 mL

2.2.2XRD分析 圖2為未處理竹材及添加不同體積甲醛預(yù)處理樣品的XRD圖。譜圖中各峰高均由同方向排列的晶面分布數(shù)量決定，樣品晶粒為同方向排列的峰高要大于樣品晶粒無規(guī)律排列的峰高；半峰寬由晶粒大小決定，峰寬值越小，晶粒越大。由圖可見，竹纖維的XRD衍射峰位出現(xiàn)在2θ為15.8°、22°、34°，為天然纖維素的特征峰[12]。樣品峰高隨著甲醛添加量的減少而增高，也證實(shí)了預(yù)處理底物纖維素含量是在增加的；峰寬變化不大，可忽略不計(jì)，表明預(yù)處理對(duì)結(jié)晶區(qū)晶粒尺寸影響較小。

a.未處理竹材untreated bamboo；b.0 mL；c.3 mL；d.4 mL；e.4.5 mL；f.5 mL

未處理竹材的結(jié)晶度為49.0%，而甲醛添加量為0、3.0、4.0、4.5、5.0 mL時(shí)，底物纖維素的結(jié)晶度分別為55.5%、56.7%、55.4%、53.5%和50.5%?？梢钥闯?，在甲醛添加量為5.0 mL時(shí)，底物中纖維素含量為未處理竹材的1.9倍，但結(jié)晶度卻只是稍大于未處理竹材。原因可能是在脫除木質(zhì)素的同時(shí)，甲醛對(duì)底物纖維素?zé)o定形區(qū)乃至結(jié)晶區(qū)也起到了破壞降解作用。隨著甲醛添加量的減少，底物的結(jié)晶度隨之增大，這可以說明底物纖維素含量提高的同時(shí)，預(yù)處理對(duì)底物纖維素?zé)o定形區(qū)的降解作用也在加劇。

2.3 預(yù)處理對(duì)酶水解的影響

以預(yù)處理后固體樣品為底物，在纖維素酶用量10 FPU/g、酶水解時(shí)間24 h時(shí)的酶水解結(jié)果如表2所示(總糖得率即水解后六碳糖和五碳糖的得率之和)。由表2可得，不添加甲醛的預(yù)處理還原糖得率高達(dá)94.0%，葡萄率得率33.2%，均高于添加甲醛的預(yù)處理底物的酶解效果。這表明不添加甲醛的預(yù)處理過程中大部分木質(zhì)素及半纖維素被脫除，從而提高了底物纖維素含量，有助于酶水解反應(yīng)的進(jìn)行。

表2 預(yù)處理底物的酶水解性能

甲醛的加入會(huì)增大底物中木質(zhì)素的含量，導(dǎo)致預(yù)處理底物難以被酶水解。在酸性少水的環(huán)境中，甲醛與木質(zhì)素側(cè)鏈發(fā)生縮醛反應(yīng)，阻止了芐基陽(yáng)離子的形成；其次，被質(zhì)子化的甲醛進(jìn)攻芳香環(huán)甲氧基的對(duì)位或鄰位，通過親電芳香取代形成羥甲基結(jié)構(gòu)，從而使這些反應(yīng)性位置被穩(wěn)定下來[13]。以二氧六環(huán)為溶劑，甲醛為主要化學(xué)添加劑的化學(xué)預(yù)處理過程中，甲醛可以對(duì)木質(zhì)素起到保護(hù)作用，但也間接的保護(hù)了纖維素，導(dǎo)致預(yù)處理底物的酶水解效率低下。但甲醛保留了木質(zhì)素的活性，對(duì)后續(xù)研發(fā)高附加值木質(zhì)素衍生產(chǎn)品有重要意義。竹材綜纖維素可水解生成單糖進(jìn)而發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，加上活性木質(zhì)素用于研發(fā)高附加值衍生產(chǎn)品，從而可實(shí)現(xiàn)竹材的全組分利用[14-15]。

2.4 底物酶水解液發(fā)酵產(chǎn)乳酸

采用優(yōu)化后的預(yù)處理的酸和甲醛添加量(表3)，在其他預(yù)處理?xiàng)l件不變的情況下得到預(yù)處理的固體樣品；再將底物用于酶水解，酶水解過程的酶用量為纖維素酶20 FPU/g和β-葡萄糖苷酶30 IU/g，酶水解時(shí)間48 h；酶水解液用于發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，結(jié)果如表3所示。

表3 竹材酶水解液發(fā)酵產(chǎn)乳酸的預(yù)處理?xiàng)l件及結(jié)果

從表3中可以看到，纖維素酶增加為20 FPU/g(以底物質(zhì)量計(jì))后，不添加甲醛的底物酶水解葡萄糖得率有了顯著的提高，最高可達(dá)92.8%，但樣品2和4的乳酸得率卻不高。相比較樣品2和4，樣品1和3因?yàn)樘砑蛹兹┑木壒?，酶水解產(chǎn)葡萄糖得率不高，但乳酸得率卻較高，原因可能是其葡萄糖濃度較低對(duì)乳酸菌的反饋抑制作用較弱或是由于酶水解液中葡萄糖濃度低以及葡萄糖-乳酸生物傳感分析儀的檢測(cè)精度較低的原因。

與添加鹽酸的預(yù)處理相比，添加硫酸的預(yù)處理底物的乳酸得率較高，樣品4比樣品2的乳酸得率高12.2個(gè)百分點(diǎn)，主要是因?yàn)橄×蛩崽幚砟芙档偷孜锢w維素的平均聚合度，形成多孔或溶脹型的結(jié)構(gòu)，增大反應(yīng)能力，有益于乳酸菌的發(fā)酵[16]。發(fā)酵結(jié)束后，還測(cè)定了發(fā)酵液中殘留的糖含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)殘留的糖可以忽略不計(jì)，表明糖類已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化消耗掉了。但縱觀4個(gè)樣品的乳酸得率均偏低，究其原因可能是水解發(fā)酵液中葡萄糖含量不高，在發(fā)酵過程中很大一部分可能作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被乳酸菌消耗了，也可能與乳酸菌活力及營(yíng)養(yǎng)鹽配置有關(guān)。同時(shí)，對(duì)比樣品1和樣品2，及樣品3和樣品4可得出，添加甲醛的預(yù)處理樣品酶水解性能普遍降低，但酶水解液發(fā)酵后乳酸的得率增高。進(jìn)一步表明，甲醛的添加對(duì)纖維素酶酶解有抑制作用，而對(duì)乳酸菌發(fā)酵有促進(jìn)作用。未來可從微生物學(xué)角度來開展進(jìn)一步研究，從而探索出竹材制備乳酸的最佳工藝路線。

3 結(jié) 論

3.1酸性甲醛/1,4-二氧六環(huán)溶液預(yù)處理竹材可以脫除半纖維素和木質(zhì)素，大幅提高固體樣品中纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)至75.6%～90.7%。

3.2預(yù)處理后底物在纖維素酶用量20 FPU/g、β-葡萄糖苷酶用量30 IU/g和酶解時(shí)間48 h條件下，酶水解后纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的最高得率為92.8%；酶水解液可以直接用于發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸的得率最高可達(dá)73.2%。

3.3甲醛/1,4-二氧六環(huán)溶液預(yù)處理過程可使竹材表面蠟質(zhì)層幾乎完全被溶解脫除，得到的底物結(jié)構(gòu)變得疏松，從而有效提高了竹材纖維素酶解和發(fā)酵效率。