王 靖，白 皓，王新力，張思琦，王天吉，馮亞非，雷 偉

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科，陜西，西安 710032)

血管新生對(duì)于組織的損傷修復(fù)至關(guān)重要[1]，而其本身也受到損傷周圍環(huán)境等多種因素的調(diào)控[23]。其中，單核巨噬細(xì)胞在損傷早期即被募集到損傷周圍，而再生修復(fù)階段的巨噬細(xì)胞將分泌多種促血管生成因子調(diào)控血管新生，如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子等[4]。巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)對(duì)于血管新生及組織的損傷愈合至關(guān)重要。研究表明，促炎表型(M1型)的巨噬細(xì)胞將抑制血管新生[5]，而抗炎表型(M2型)的巨噬細(xì)胞則可通過(guò)分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)促進(jìn)血管新生[6]，但巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)血管再生的關(guān)鍵機(jī)制尚不清楚。

谷氨酰胺是血漿中最豐富的非必需氨基酸，是組織內(nèi)重要的氮、碳和能量運(yùn)輸載體[7]。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞消耗大量的谷氨酰胺，谷氨酰胺代謝降低將影響巨噬細(xì)胞極化并導(dǎo)致炎性因子分泌增多，補(bǔ)充谷氨酰胺可以改善巨噬細(xì)胞促炎/抗炎表型失衡并抑制炎性因子的分泌，從而促進(jìn)肌肉組織再生[810]。但谷氨酰胺代謝異常的巨噬細(xì)胞能否影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的增殖和血管新生功能尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在明確谷氨酰胺代謝異常的巨噬細(xì)胞對(duì)HUVECs增殖、遷移和成管能力的影響，并初步探討其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

Esco Airstream生物安全柜(ESCO公司，新加坡)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國(guó))；FLUOstar Omega全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(BMG LABTECH公司，德國(guó))；HUVECs(賽百慷生物技術(shù)股份有限公司，中國(guó))；低糖DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司，美國(guó))；胎牛血清、CCK-8試劑盒(InCellGene公司，美國(guó))；巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)(PeproTech公司，美國(guó))；青霉素鏈霉素、胰蛋白酶、紅細(xì)胞裂解液(碧云天公司，中國(guó))；TRIzol reagent(Invitrogen公司，美國(guó))；基質(zhì)膠(Corning公司，美國(guó))；兔抗p-VEGFR2(Tyr1054+Tyr1059)、兔抗VEGFR2、兔抗p-Akt(Ser473)、兔抗Akt、兔抗α-Tubulin等一抗，山羊抗兔二抗等抗體(Cell Signaling Technology公司，美國(guó))；谷氨酰胺酶(glutaminase,GLS)flox(Glsf/f)小鼠和巨噬細(xì)胞特異性Cre(Lyz2-Cre)小鼠(上海南方模式動(dòng)物有限公司，中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建巨噬細(xì)胞特異性GLS敲除小鼠(Glsf/f；Lyz2-Cre小鼠) 將Glsf/f小鼠和Lyz2-Cre小鼠進(jìn)行交配，即可獲得Glsf/f；Lyz2-Cre小鼠。同胎出生的Glsf/f小鼠作為野生對(duì)照小鼠(wild type小鼠，WT小鼠)。

1.2.2 分離原代骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages，BMDMs) 6～8周的Glsf/f；Lyz2-Cre小鼠及WT小鼠，處死后于750 mL/L乙醇浸泡消毒5 min后，在超凈臺(tái)中分離小鼠股骨和脛骨，并用PBS沖洗出骨髓，1 000 r/min離心5 min后 ，用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，重懸于巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中(低糖DMEM培養(yǎng)基+20 μg/L M-CSF+100 mL/L胎牛血清+10 mL/L雙抗)。誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后即為BMDMs。

1.2.3 制備BMDMs條件培養(yǎng)基(conditioned medium，CM) 不同組BMDMs經(jīng)10 mL/L 胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)上清，1 000 r/min離心5 min去除死細(xì)胞及細(xì)胞碎片后凍存于-80 ℃，以備后用。將培養(yǎng)Glsf/f;Lyz2-Cre小鼠BMDMs的CM表示為GLS KO-CM(GLS KO-CM組)，WT小鼠BMDMs的CM表示為 WT-CM(WT-CM組)。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將消化后重懸的HUVECs接種于6孔板或96孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后更換為BMDMs CM(500 mL/L BMDMs培養(yǎng)上清+100 mL/L胎牛血清+10 mL/L雙抗)，37 ℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24、48 h后：①6孔板經(jīng)PBS洗滌2次后，利用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行圖片采集；②96孔板每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔A450 nm值。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 將消化后重懸的HUVECs接種于6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率達(dá)到100%時(shí)，用200 μL槍頭在細(xì)胞層上進(jìn)行劃痕。用PBS洗2次后加入BMDMs CM(500 mL/L BMDMs培養(yǎng)上清+10 mL/L胎牛血清+10 mL/L雙抗)，37 ℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，并于24、48 h用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行圖片采集，并計(jì)算劃痕距離。

1.2.6 HUVECs成管實(shí)驗(yàn) 預(yù)冷的槍頭吸取50 μL左右的基質(zhì)膠加入到96孔板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，待其凝膠后，將消化重懸后的HUVECs按照1×104個(gè)/孔的密度接種到凝膠上，待細(xì)胞貼壁后更換為BMDMs CM(500 mL/L BMDMs培養(yǎng)上清+100 mL/L胎牛血清+10 mL/L雙抗)，37 ℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后利用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行圖片采集并分析。

1.2.7 Western blotting檢測(cè) 經(jīng)不同處理后的HUVECs用PBS洗2次后提取蛋白，利用BCA法進(jìn)行蛋白定量，并將樣品煮沸10 min，使得蛋白樣品變性。利用100 g/L SDS-PAGE凝膠進(jìn)行蛋白電泳。蛋白樣品按照10 μg/孔進(jìn)行上樣跑膠，結(jié)束后利用恒流濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，室溫條件下利用50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，之后孵育一抗[兔抗VEGFR2、兔抗p-VEGFR2(Tyr1054+Tyr1059)、兔抗Akt、兔抗p-Akt(Ser473)、兔抗α-Tubulin]，一抗?jié)舛染鶠?∶1 000。4 ℃條件下孵育過(guò)夜，之后加入山羊抗兔二抗(1∶5 000)，在室溫下孵育1 h后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光并采集圖像。利用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 HUVECs增殖能力檢測(cè)

為研究巨噬細(xì)胞谷氨酰胺代謝異常對(duì)于HUVECs增殖的影響，利用500 mL/L GLS KO-CM和WT-CM處理HUVECs 24、48 h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行圖像采集并結(jié)合CCK-8法檢測(cè)兩組細(xì)胞A450 nm值以反映增殖情況。結(jié)果顯示，經(jīng)GLS KO-CM處理48 h后的HUVECs數(shù)量明顯減少，細(xì)胞形態(tài)較WT-CM組更不規(guī)則(圖1A)；經(jīng)GLS KO-CM處理24、48 h后HUVECs的A450 nm值較WT-CM組明顯降低(P<0.05，圖1B)。以上結(jié)果提示巨噬細(xì)胞敲除GLS將顯著抑制HUVECs的增殖能力。

A：HUVECs增殖情況(標(biāo)尺為100 μm，n=6)；B：HUVECs CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)A450 nm值(n=6，aP<0.05)。WT-CM：對(duì)照組巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基；GLS KO-CM：GLS敲除的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基；HUVECs：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。圖1 HUVECs增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 HUVECs遷移能力檢測(cè)

利用劃痕實(shí)驗(yàn)研究巨噬細(xì)胞谷氨酰胺代謝異常對(duì)于HUVECs遷移的影響(圖2)，結(jié)果顯示，HUVECs細(xì)胞劃痕經(jīng)500 mL/L GLS KO-CM和WT-CM處理24 h后，GLS KO-CM組的細(xì)胞劃痕愈合效率略小于WT-CM組(P>0.05)，48 h后差異尤為顯著(P<0.05)。以上結(jié)果提示巨噬細(xì)胞敲除GLS將顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。

A：HUVECs0、24、48 h遷移圖(標(biāo)尺為100 μm，n=6)；B：HUVECs遷移百分比統(tǒng)計(jì)圖(n=6，aP<0.05)。WT-CM：對(duì)照組巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基；GLS KO-CM：GLS敲除的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基；HUVECs：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。圖2 HUVECs遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 HUVECs成管能力分析

利用成管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同BMDMs CM處理后HUVECs的成管能力(圖3)，結(jié)果顯示，處理4 h后，GLS KO-CM處理組HUVECs在基質(zhì)膠上形成的管腔數(shù)量明顯少于WT-CM組(P<0.05，圖3B)，且形成的小管總長(zhǎng)度也較WT-CM組顯著減少(P<0.01，圖3C)。以上結(jié)果說(shuō)明巨噬細(xì)胞敲除GLS將抑制HUVECs的成管能力。

A：HUVECs 誘導(dǎo)成管4 h圖(標(biāo)尺為50 μm，n=6)；B：+HUVECs成管過(guò)程中形成的管腔數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖(n=6，aP<0.05)；C：HUVECs成管過(guò)程中形成的小管總長(zhǎng)度相對(duì)值統(tǒng)計(jì)圖(n=6，bP<0.01)。WT-CM：對(duì)照組巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基；GLS KO-CM：GLS敲除的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基；HUVECs：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。圖3 HUVECs成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 巨噬細(xì)胞敲除GLS抑制HUVECs功能的分子機(jī)制

利用Western blotting檢測(cè)HUVECs經(jīng)不同BMDMs CM處理48 h后細(xì)胞中VEGFR2/PI3K/Akt通路的變化(圖4)，結(jié)果顯示，GLS KO-CM處理的HUVECs中p-VEGFR2/VEGFR2比值較WT-CM組降低29.3%(P<0.05)、p-Akt/Akt比值較WT-CM組降低21.9%(P<0.05)。由此說(shuō)明，敲除GLS的巨噬細(xì)胞可能通過(guò)分泌因子抑制HUVECs中VEGFR2/PI3K/Akt通路的表達(dá)從而抑制HUVECs的增殖與遷移。

A：HUVECs 中VEGFR2/PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)情況(n=6)；B：HUVECs中磷酸化VEGFR2(Tyr1054+Tyr1059)與VEGFR2的比值統(tǒng)計(jì)圖；C：HUVECs中磷酸化Akt(Ser473)與Akt的比值統(tǒng)計(jì)圖(n=6，aP<0.05)。WT-CM：對(duì)照組巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基；GLS KO-CM：GLS敲除的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基；HUVECs：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。圖4 HUVECs信號(hào)通路檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

血管新生是指在現(xiàn)有血管網(wǎng)的基礎(chǔ)上通過(guò)擴(kuò)張從而形成新的血管，包括基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，出芽以及血管網(wǎng)的構(gòu)建等一系列過(guò)程[11]。損傷發(fā)生后，巨噬細(xì)胞作為最先到達(dá)的反應(yīng)細(xì)胞之一，在組織損傷愈合及血管新生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[12]。目前對(duì)于巨噬細(xì)胞極化影響血管新生的研究相對(duì)較多[3,13]，但巨噬細(xì)胞代謝特別是谷氨酰胺代謝對(duì)血管新生的影響如何，目前尚不明確。

在本研究中，我們利用GLS KO-CM及WT-CM處理HUVECs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與WT-CM組相比，GLS KO-CM處理的HUVECs增殖、遷移及成管能力明顯受抑制，且HUVECs中促血管新生的VEGFR2/PI3K/Akt通路被抑制。由此證實(shí)，谷氨酰胺代謝受損的巨噬細(xì)胞可通過(guò)分泌因子抑制HUVECs中的VEGFR2/PI3K/Akt通路從而抑制HUVECs的增殖和遷移。

根據(jù)不同的表面標(biāo)志及功能，目前普遍認(rèn)為：M1型巨噬細(xì)胞因其分泌大量的炎性因子而導(dǎo)致組織愈合延遲，相反M2型巨噬細(xì)胞因分泌抗炎因子及促生長(zhǎng)因子而促進(jìn)組織愈合與再生[14]。巨噬細(xì)胞中的谷氨酰胺經(jīng)GLS分解為谷氨酸，后者在谷氨酸脫氫酶的作用下進(jìn)一步分解為α酮戊二酸并參與三羧酸循環(huán)，從而實(shí)現(xiàn)糖回補(bǔ)[15]。有研究顯示，抑制巨噬細(xì)胞谷氨酰胺代謝將導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向M1促炎表型轉(zhuǎn)化，從而分泌大量的炎性因子，而補(bǔ)充谷氨酰胺及其代謝產(chǎn)物如α酮戊二酸將促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化[16]。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，M2型巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)血管生成，M1型巨噬細(xì)胞則抑制血管生成[3]，這與本研究結(jié)論相一致，即抑制巨噬細(xì)胞谷氨酰胺代謝導(dǎo)致巨噬細(xì)胞傾向于促炎表型而明顯抑制HUVECs的增殖、遷移和成管功能，且這種效應(yīng)與HUVECs中促血管新生的VEGFR2/PI3K/Akt通路受抑制有關(guān)[1718]。

綜上所述，本研究揭示了谷氨酰胺代謝在巨噬細(xì)胞調(diào)控血管新生過(guò)程中扮演的重要角色，該結(jié)果將為改善組織損傷愈合過(guò)程中血管新生的探索提供新的思路。