白玉婷，格日力，王立生，蘇曉靈△

(1.青海省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，西寧 810001；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心，西寧 810001；3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心分子診斷與再生醫(yī)學(xué)科，山東青島 266000)

胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)是一種廣泛用于非計(jì)數(shù)型原代細(xì)胞和永生化細(xì)胞培養(yǎng)的具有代表性的添加劑。FBS的精確組成成分尚不清楚，因?yàn)檫@種添加劑包含各種未知的天然小分子和比例不同的蛋白質(zhì)(批次之間成分變化)。牦牛是一種生存于海拔3 500 m以上的野生牛種，是青藏高原及中國(guó)周邊地區(qū)的標(biāo)志[1]。牦?？梢猿浞掷闷渌箅y以利用的高山草原，并為高海拔居民提供了必要的資源，是高海拔居民生存的手段[2]。牦牛與低海拔牛在解剖學(xué)和生理學(xué)方面有許多不同之處，除通過消除低氧導(dǎo)致的血管收縮而生活在高海拔地區(qū)外[3]，其心肺增大、缺氧性肺血管收縮不足、覓食能力增強(qiáng)、能量代謝增加使其能更好適應(yīng)高海拔地區(qū)。牦牛作為理解適應(yīng)的分子基礎(chǔ)模型動(dòng)物，其最小生物信息學(xué)在整個(gè)基因組測(cè)序之前便已完成[4]，但牦牛的非正常存活生物學(xué)機(jī)制及其對(duì)高原氧化應(yīng)激的反應(yīng)機(jī)制目前尚不清楚[5],其對(duì)細(xì)胞的增殖及衰老有何影響至今少見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過與其他品種FBS進(jìn)行比較，研究了牦牛血清對(duì)胚胎大鼠心肌細(xì)胞(H9c2細(xì)胞)生長(zhǎng)、增殖及衰老的影響，以期找到H9c2細(xì)胞生長(zhǎng)更相適應(yīng)的血清。

1 材料與方法

1.1材料

H9c2由中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所傳代保存。試劑為杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)液、二甲亞砜、CCK8試劑、血清(四季青、Hyclone)等。

1.2方法

1.2.1H9c2細(xì)胞培養(yǎng)

使用含10%牦牛血清、Hyclone血清、四季青血清加DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱，每2天更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2牦牛血清的制備

取靜脈血，室溫下靜置1 h，2 500 r/min離心15 min，分離血清，并經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，30 min水浴滅活。

1.2.3細(xì)胞計(jì)數(shù)法

取待測(cè)細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞懸液各10 μL，滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在低倍鏡下計(jì)數(shù)4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞。邊緣壓線細(xì)胞以數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則進(jìn)行。

1.2.4H9c2細(xì)胞增殖檢測(cè)

將H9c2細(xì)胞以5×103細(xì)胞/mL密度(100 μL)接種于96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48、72 h。培養(yǎng)結(jié)束前每孔加入10 μL CCK8，37 ℃避光孵育2 h后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值。

1.2.5q-PCR測(cè)定

用Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，配置好q-PCR反應(yīng)液后以4副孔加樣，瞬時(shí)離心去氣泡后采用ABI 7500 FAST q-PCR儀進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增程序：50 ℃ 20 s，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1不同血清對(duì)H9c2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

牦牛血清培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)在第2～6天均顯著高于四季青血清，在第2天顯著高于Hyclone血清，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其他時(shí)間點(diǎn)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Hyclone血清培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)在第3、4、5、6天均顯著高于四季青血清，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 3種血清對(duì)H9c2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.2不同血清對(duì)H9c2細(xì)胞增殖的影響

牦牛血清培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞倍增數(shù)在第24、48、72、96、120小時(shí)均顯著高于Hyclone血清和四季青血清，Hyclone血清培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞倍增數(shù)在第24小時(shí)顯著高于四季青血清(P<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 3種血清對(duì)H9c2細(xì)胞增殖的影響

2.3不同血清對(duì)H9c2細(xì)胞p21、p16、p38、p53表達(dá)的影響

四季青血清p21、p53表達(dá)均顯著高于牦牛血清和Hyclone血清，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3種血清p16、p38 mRNA表達(dá)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 3種血清對(duì)H9c2細(xì)胞p21、p16、p38、p53表達(dá)的影響

3 討 論

血清是從牛胎血液中所獲得的體外培養(yǎng)基的常見補(bǔ)充物，包含生長(zhǎng)因子、激素、維生素、氨基酸、脂肪酸和細(xì)胞生長(zhǎng)所需的微量元素，因此，早期即被引入細(xì)胞生物學(xué)研究中[6]。血清作為真核細(xì)胞體外培養(yǎng)的補(bǔ)充物，在心肌細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖過程中發(fā)揮著重要作用。不同血清對(duì)心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)影響不同，因此，找到與H9c2細(xì)胞生長(zhǎng)相適應(yīng)的血清顯得尤為重要。

牦牛能很好地適應(yīng)高寒草原環(huán)境，在空氣稀薄、溫度低、紫外線強(qiáng)、草短等惡劣高原環(huán)境下自由生活和繁殖[7]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，牦牛血中的低聚肽抗氧化能力及脂質(zhì)過氧化抑制能力均顯著優(yōu)于商品化大豆低聚肽，且牦牛血低聚肽還可緩解缺氧導(dǎo)致的機(jī)體應(yīng)激損傷，具有潛在藥用價(jià)值[8]。但在以往，牦牛血未能得到良好的利用及研究，本研究通過比較3種不同品種FBS對(duì)H9c2細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖發(fā)現(xiàn)，H9c2細(xì)胞在含有牦牛血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞活力好，增殖倍數(shù)優(yōu)于Hyclone血清和四季青血清，提示與Hyclone血清和四季青血清比較，H9c2細(xì)胞可能更適應(yīng)于在牦牛血清中生長(zhǎng)。

衰老是細(xì)胞、組織和器官結(jié)構(gòu)和功能漸進(jìn)性惡化的生物過程，細(xì)胞衰老的典型特征是不可逆的細(xì)胞周期阻滯，可能由DNA損傷、氧化應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)剝奪、致癌損傷或化療毒性引起[9]。目前有研究表明，細(xì)胞衰老具有兩面性，一方面在衰老過程中衰老細(xì)胞在各種組織中積累，導(dǎo)致發(fā)生許多與年齡相關(guān)的疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥、肝脂肪變性、阿爾茨海默病、纖維化肺病和骨關(guān)節(jié)炎[9-12]，而消除這些衰老細(xì)胞可以延長(zhǎng)壽命[13]。另一方面衰老細(xì)胞在胚胎發(fā)育、腫瘤抑制、傷口愈合和組織修復(fù)等過程中發(fā)揮著多種有益作用[14]。細(xì)胞增殖和衰老是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多種細(xì)胞成分和信號(hào)通路，其中p21、p53腫瘤抑制基因家族是與衰老相關(guān)的最具特征性的因素[15]，而p16是由大多數(shù)衰老細(xì)胞表達(dá)的用于鑒定衰老的關(guān)鍵標(biāo)記物[16]。p38作為一種有絲分裂原激活的蛋白激酶，可被外界信號(hào)和炎性細(xì)胞因子激活，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移、衰老和凋亡等多種細(xì)胞生物學(xué)過程[17]。因此，本研究通過檢測(cè)上述指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，與牦牛血清和Hyclone血清比較，四季青血清H9c2細(xì)胞p21、p53表達(dá)最高，而p38、p16表達(dá)無(wú)明顯差異，提示p21、p53過度表達(dá)可能導(dǎo)致H9c2細(xì)胞衰老進(jìn)而影響H9c2細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。而LPEZ-OTN等[18]和MUNOZ-ESPIN等[19]研究也表明，在衰老細(xì)胞中不可逆細(xì)胞周期阻滯主要是由細(xì)胞周期抑制劑——p16、p21、p53上調(diào)所致。然而，牦牛血清與其他血清的不同之處及其如何影響細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及衰老尚需進(jìn)一步深入研究。