趙滋潤，羅月芳，高娜娜，吳瓊，譚朝陽，徐德宏

(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 生物工程實驗室，湖南 長沙 410208)

紅景天苷(salidroside)是一種由對羥基苯乙醇(又稱為酪醇)和葡萄糖化合形成的糖苷，其化學(xué)名為對羥基苯乙基-β-D-葡萄糖苷，首先發(fā)現(xiàn)于紅景天屬植物中，隨后在女貞屬、杜鵑屬、越橘屬等植物中也有發(fā)現(xiàn)[1]。藥理學(xué)研究表明，紅景天苷是紅景天屬植物最重要的藥效成分，具有良好的抗疲勞、抗缺氧、抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、增強免疫力、保護心血管、保護神經(jīng)元等多種功效[2]，因其作為主要成分的醫(yī)藥保健產(chǎn)品被廣泛的開發(fā)與應(yīng)用[3]，導(dǎo)致當前市場對其需求量不斷增加，因而如何既經(jīng)濟又高效地獲取紅景天苷，已成為醫(yī)藥研究者亟待解決的問題。

紅景天屬植物是提取紅景天苷的主要來源，但一方面由于該屬植物野生資源匱乏，另一方面人工栽培時由于紅景天種子成熟度差、發(fā)芽率低，種植所需生長環(huán)境要求高，根腐病較嚴重[4-5]，導(dǎo)致當前原材料的供應(yīng)難以滿足大規(guī)模提取的需求?；瘜W(xué)合成是獲取紅景天苷的另一種方法，此法雖不受原材料的限制，但由于紅景天苷含葡萄糖基，需經(jīng)過多步保護和去保護措施，致使整個合成過程復(fù)雜且產(chǎn)率不高，副產(chǎn)物多且難于分離，故化學(xué)合成紅景天苷有待進一步改進[6]。

采用生物技術(shù)對藥用活性物質(zhì)進行生物合成是一種經(jīng)常采用的手段，目前人們對紅景天苷的生物合成主要有紅景天屬植物組織或細胞培養(yǎng)法[7-9]、生物酶法[10-11]、微生物合成法[12]等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，通過供給外源性的酪醇，少部分植物在生長過程中可吸收并轉(zhuǎn)化苷元生成紅景天苷，其中唇形科植物益母草(LeonurusjaponicasHoutt.)在自然生長狀況下不含紅景天苷，但對其進行含酪醇的水培時，能較好地將酪醇轉(zhuǎn)化為紅景天苷。故本文對益母草水培和懸浮細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)化酪醇生成紅景天苷的條件進行探討，從而為益母草生產(chǎn)紅景天苷，以及開發(fā)益母草相關(guān)的醫(yī)藥保健產(chǎn)品奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

益母草(LeonurusjaponicusHoutt.)成熟種子由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室王智老師在湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園采集并鑒定。

紅景天苷標準品購自中國藥品生物制品檢定所(批號110818-201005)；酪醇購自武漢金諾化工有限公司(批號GPC-13JNHG0123A)；瓊脂購自福建省石獅市高新瓊脂有限公司；甲醇為色譜純，其余化學(xué)試劑均為分析純，都采購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

天津市泰斯特儀器有限公司的GZX-450光照培養(yǎng)箱；天津市歐諾儀器有限公司的雙層恒溫培養(yǎng)搖床；日本島津公司的LC-16高效液相色譜泵；日本島津公司的SPD-M20A檢測器；日本島津公司的SIL-16自動進樣器；美國沃特世科技公司的Waters Xevo G2-XS QTof 高分辨質(zhì)譜；蘇州凈化設(shè)備有限公司的SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺；天津市泰斯特儀器有限公司的COND電導(dǎo)率儀；上海雷磁科學(xué)儀器有限公司的pH計。

1.2 益母草轉(zhuǎn)化酪醇生成紅景天苷的水培研究

益母草水培營養(yǎng)液采用華南農(nóng)業(yè)大學(xué)葉菜B配方[13]進行配制。

取益母草種子，經(jīng)0.1%的高錳酸鉀溶液浸泡消毒1 min，用水沖洗后，浸泡6～8 h，播種于裝有椰糠的不銹鋼盤中，用水澆灌，待發(fā)芽之后，用0.5倍營養(yǎng)液及蒸餾水交替澆灌保濕。幼苗長至3～4片真葉后，取出，用海棉將根包裹，移至定植籃中，放入水培箱中進行培養(yǎng)。初期用0.5倍營養(yǎng)液，然后逐漸過度至1倍營養(yǎng)液，每日用氣泵通氣2次，并監(jiān)測水培液的電導(dǎo)率和pH，定期更換，培養(yǎng)60 d后的益母草植株可用于實驗。

取大小長勢基本一致的水培益母草植株，分為3組，每組2個水培箱(500 mm×380 mm×228 mm)，每箱12株益母草，每個水培箱中裝入10 L 1倍營養(yǎng)液，于8：00在3組水培箱營養(yǎng)液中加入酪醇，使其終濃度分別為1、3、7 mmol·L-1，每天18：00取樣，每箱采1株益母草，共采集10 d。取益母草的葉，檢測紅景天苷含量，同時取未施加酪醇的益母草葉作為空白對照，同法檢測。

水培益母草植株分為3組，于8：00分別噴灑濃度為0.2%(14.3 mmol·L-1)、0.5%(36.2 mmol·L-1)、0.8%(57.9 mmol·L-1)的酪醇溶液于益母草植株的葉面和葉背上，以噴濕葉片為度，每天18：00取樣，每箱采1株益母草，共采集10 d。取益母草的葉，檢測紅景天苷含量。

水培益母草植株分為3組，8：00分別對3組益母草按不同方式施加酪醇，A組在水培液中加入酪醇，使其濃度為2 mmol·L-1，B組向益母草葉片噴灑0.5%(36.2 mmol·L-1)的酪醇溶液，C組在水培液中加入酪醇，使其終濃度為2 mmol·L-1，同時在益母草葉片上噴灑0.5%的酪醇溶液，每天18：00取樣，每箱采1株益母草，共采集10 d。取益母草的葉，檢測紅景天苷含量。

1.3 益母草轉(zhuǎn)化酪醇生成紅景天苷的懸浮細胞研究

根據(jù)李學(xué)棟等[14]的方法進行益母草愈傷組織的培養(yǎng)，并按羅月芳等[15]的方法建立益母草懸浮細胞系。

酪醇母液用過濾法除菌，無菌條件下，向益母草懸浮細胞轉(zhuǎn)化體系中添加適量酪醇母液，使轉(zhuǎn)化體系中酪醇終濃度為1、3和7 mmol·L-1，添加后分別在24、48、84 h收獲。將收獲的益母草懸浮細胞培養(yǎng)液處理，并測定紅景天苷含量和計算轉(zhuǎn)化率。

酪醇母液用過濾法除菌，無菌條件下，向益母草懸浮細胞轉(zhuǎn)化體系中添加適量酪醇母液，使轉(zhuǎn)化體系中酪醇終濃度為3 mmol·L-1，添加后每隔一定時間取樣。將收獲的益母草懸浮細胞處理，并測定紅景天苷含量和計算轉(zhuǎn)化率。

1.4 紅景天苷含量測定和轉(zhuǎn)化率計算

取益母草鮮葉，精密稱定10 g，剪碎，精密加入50%甲醇15 mL，稱量，80 ℃水浴回流提取1 h。冷卻稱重后，用50%甲醇補足失量，過0.45 μm濾膜，取濾液作為益母草水培植株的供試品溶液。

益母草懸浮細胞培養(yǎng)液經(jīng)抽濾后，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，作為胞外供試品溶液。抽濾得到的細胞用水清洗3遍，加入10倍量70%甲醇，稱重，80 ℃水浴回流提取1 h。冷卻稱重后，用70%甲醇補足失重，過0.45 μm濾膜，取濾液作為胞內(nèi)供試品溶液。

取紅景天苷標準品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含0.05 mg的溶液，制備紅景天苷標準品溶液。

色譜柱為C18色譜柱(太瑋科技JADE-PAK?ODS-AQ，4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(12∶88)；檢測波長為275 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量為20 μL。

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)檢測色譜柱為Agilent ZORBAX Bonus-RP(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流動相為甲醇-0.1%甲酸溶液(6∶94)；流速為0.5 mL·min-1；檢測波長為275 nm；進樣量為10 μL；柱溫為40 ℃。質(zhì)譜檢測采用正離子模式，電噴霧質(zhì)譜干燥氣流速為6 L·min-1；噴霧器壓力為275.8 kPa；霧化氣溫度為325 ℃；鞘氣溫度為350 ℃，鞘氣流速為12 L·min-1，毛細管電壓為4 000 V；碎裂電壓為110 V，質(zhì)譜采集范圍為50～1 000m/z，碰撞電壓為20、10 eV。

利用外標一點法進行紅景天苷產(chǎn)量計算，W=A(W)/(A)，其中W與A分別代表供試品中紅景天苷的含量及相應(yīng)的峰面積。(W)及(A)分別代表在標準品中紅景天苷的含量及相應(yīng)峰面積。

紅景天苷總轉(zhuǎn)化率和紅景天苷總產(chǎn)量計算公式如下：

紅景天苷總產(chǎn)量=胞內(nèi)所含紅景天苷的產(chǎn)量+胞外上清液中紅景天苷的產(chǎn)量；

紅景天苷總轉(zhuǎn)化率=(胞內(nèi)所含紅景天苷的摩爾數(shù)+胞外上清液中紅景天苷的摩爾數(shù))/加入培養(yǎng)體系中酪醇的總摩爾數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 益母草水培結(jié)果

2.1.1 益母草水培植株可轉(zhuǎn)化酪醇生成紅景天苷

在益母草水培營養(yǎng)液中添加酪醇后，經(jīng)過一段時間的轉(zhuǎn)化，利用HPLC對植株體內(nèi)是否生成紅景天苷進行檢測，結(jié)果顯示，在添加酪醇的植株體內(nèi)檢測到紅景天苷的生成，而未添加酪醇的植株則無紅景天苷產(chǎn)生(圖1)。

A—紅景天苷標準品；B—施加酪醇的益母草；C—未施加酪醇的益母草。圖1 益母草水培植株轉(zhuǎn)化酪醇生成紅景天苷的HPLC結(jié)果

對施加酪醇的益母草與紅景天苷標準品具有相同保留時間的色譜峰進行質(zhì)譜檢測，測得其一級質(zhì)譜(M+Na)m/z為323，二級質(zhì)譜測得其主要碎片離子m/z為121、170、251，均與紅景天苷標準品相同(圖2)，因而可以確定益母草中新轉(zhuǎn)化合成的物質(zhì)為紅景天苷。

A—紅景天苷標準品一級質(zhì)譜；B—益母草中紅景天苷的一級質(zhì)譜；C—紅景天苷標準品二級質(zhì)譜；D—益母草中紅景天苷的二級質(zhì)譜。圖2 益母草水培植株轉(zhuǎn)化酪醇生成紅景天苷的質(zhì)譜檢測結(jié)果

水培液中添加酪醇后，當天益母草葉中就可檢出紅景天苷，隨后含量逐漸增加，在3～4 d達到最高。總體來說，添加酪醇的濃度越高，益母草體內(nèi)轉(zhuǎn)化合成的紅景天苷含量也越高(圖3)。但在7 mmol·L-1組中，益母草在添加酪醇2 d后葉片開始出現(xiàn)枯萎現(xiàn)象，隨著時間的推移個別植株死亡，并觀察到益母草根系腐爛發(fā)黑，說明高濃度的酪醇對益母草根系造成了嚴重損傷，影響了根系吸收功能。綜合考慮以上情況，水培液中添加酪醇濃度以3 mmol·L-1為佳。

圖3 水培液中不同酪醇添加量的轉(zhuǎn)化結(jié)果

2.1.2 益母草植株可由葉吸收酪醇生成紅景天苷

如圖4所示，益母草葉面噴灑酪醇后，同樣很快就能轉(zhuǎn)化合成紅景天苷，其中噴灑0.8%酪醇組的益母草在2 d后葉面開始出現(xiàn)黑色斑點，整體長勢較差，個別植株出現(xiàn)死亡，其他2組無此現(xiàn)象，說明高濃度的酪醇對益母草植株有較大的損害作用。此外，0.8%酪醇組轉(zhuǎn)化生成紅景天苷的含量2 d即達最高值，隨后下降很快，甚至比0.5%組還低，這說明0.5%酪醇溶液為最佳噴灑濃度。

圖4 葉面噴灑不同濃度酪醇的轉(zhuǎn)化結(jié)果

2.1.3 不同酪醇施加方式會影響紅景天苷生成量

如圖5所示，B組紅景天苷含量始終高于A組，說明葉面噴灑比水培添加更有利于紅景天苷的生成。對于C組，前9 d的紅景天苷產(chǎn)量高于A、B 2組，但在水培過程中觀察發(fā)現(xiàn)，植株隨著水培時間延長，葉片枯萎、植株倒伏現(xiàn)象逐漸嚴重，說明水培添加結(jié)合葉面噴灑的方式，使益母草根系和葉面受損情況比其他2組要嚴重，因而在2種方式同時處理益母草時，應(yīng)以噴灑0.5%酪醇溶液為主，再輔之以低濃度(<2 mmol·L-1)的酪醇水培液，這樣就能更好地促進益母草轉(zhuǎn)化酪醇生成紅景天苷。

圖5 酪醇不同施加方式的轉(zhuǎn)化結(jié)果

2.2 益母草懸浮細胞結(jié)果

2.2.1 益母草懸浮細胞系的紅景天苷產(chǎn)量受酪醇濃度影響

不同濃度酪醇對益母草懸浮細胞系紅景天苷總產(chǎn)量和細胞鮮重的影響如圖6所示。在不同時間點采集的益母草懸浮細胞中，3 mmol·L-1組的紅景天苷總產(chǎn)量最大，其次是7 mmol·L-1組，最小為1 mmol·L-1組；細胞鮮重在不同時間點則是1 mmol·L-1組最大，其次是3 mmol·L-1組，最小是7 mmol·L-1組。造成以上結(jié)果的主要原因可能與酪醇濃度有關(guān)，當酪醇濃度為1 mmol·L-1時，酪醇對細胞毒性小，不影響細胞生長，但也對細胞中酶的活性刺激小，導(dǎo)致紅景天苷總產(chǎn)量偏低。當添加7 mmol·L-1酪醇時，雖然紅景天苷產(chǎn)量有所提升，但對細胞毒性較大，導(dǎo)致細胞生長狀況不好，最終紅景天苷總產(chǎn)量也不高。處于中間濃度的3 mmol·L-1組，既能較好刺激細胞中負責(zé)酪醇糖基化的酶，同時又對細胞生長不產(chǎn)生太大的抑制作用，故3 mmol·L-1的酪醇濃度是益母草懸浮細胞系產(chǎn)紅景天苷的最佳濃度。

2.2.2 益母草懸浮細胞系的紅景天苷轉(zhuǎn)化率受轉(zhuǎn)化時間影響

轉(zhuǎn)化時間是影響益母草懸浮細胞系產(chǎn)紅景天苷的一個重要因素，當轉(zhuǎn)化時間為48 h時，紅景天苷的總轉(zhuǎn)化率可達63%，而且在轉(zhuǎn)化前期紅景天苷總轉(zhuǎn)化率、胞內(nèi)胞外轉(zhuǎn)化率都比較低，中期紅景天苷總轉(zhuǎn)化率、胞內(nèi)轉(zhuǎn)化率逐漸升高，后期紅景天苷總轉(zhuǎn)化率和胞內(nèi)轉(zhuǎn)化率下降、胞外轉(zhuǎn)化率明顯上升，如圖7所示。出現(xiàn)以上實驗結(jié)果的原因在于，前期細胞處于生長的延緩期，細胞生長緩慢、活性相對較低，故吸收酪醇的速度較慢，轉(zhuǎn)化也比較低；中期細胞生長快、活性高，鮮重增加，酪醇幾乎完全被吸收，因此胞內(nèi)轉(zhuǎn)化率明顯增加；后期一方面生成的紅景天苷被進一步代謝轉(zhuǎn)化，另一方面部分細胞由于酪醇的長期毒害，致使自身破碎死亡，于是紅景天苷釋放胞外，造成胞外轉(zhuǎn)化率上升，以及胞內(nèi)轉(zhuǎn)化率和總轉(zhuǎn)化率的下降。

圖6 不同酪醇濃度對益母草懸浮細胞系紅景天苷總產(chǎn)量和細胞鮮重的影響

圖7 轉(zhuǎn)化時間對益母草懸浮細胞系紅景天苷總轉(zhuǎn)化率的影響

3 討論

紅景天苷是酪醇的葡萄糖苷，其生物合成的最后一步是在植物體內(nèi)，由糖基轉(zhuǎn)移酶將尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的葡萄糖基轉(zhuǎn)移至酪醇上[16]。糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase，EC 2.4.x.y)普遍存在于植物中，能通過合成糖苷鍵實現(xiàn)糖基的轉(zhuǎn)移，而且如果糖基供體為UDPG，則稱之為葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)。UGTs在植物體內(nèi)催化生成的產(chǎn)物多是與植物次生代謝相關(guān)的物質(zhì)[17]，例如本研究中紅景天苷便是UGTs合成的一種次生代謝產(chǎn)物。

益母草在自然生長條件下不含紅景天苷，這與益母草細胞無法自身生產(chǎn)酪醇有關(guān)。當向益母草植株外源性添加酪醇，并培養(yǎng)一段時間后，其葉片可檢出酪醇和紅景天苷的存在，這說明益母草可通過根系或葉片將酪醇吸收至細胞內(nèi)，并利用自身含有的UGTs轉(zhuǎn)化酪醇生成紅景天苷。酪醇是酚類化合物，對植物生長有一定的毒害作用，因而植物通過糖基化，可降低酪醇對自身的影響[18]，但酪醇濃度超過一定限度后，會造成不可逆損傷，例如益母草出現(xiàn)根系腐爛、葉片發(fā)黑等現(xiàn)象。在本研究中，通過對酪醇轉(zhuǎn)化條件和施加方式的考察，發(fā)現(xiàn)采用以噴灑0.5%酪醇溶液為主，再輔之以低濃度酪醇(<2 mmol·L-1)水培液的方式，可取得較好的轉(zhuǎn)化效果，究其原因在于此種施加方式益母草受到的毒害較小，對酪醇利用率較高，轉(zhuǎn)化合成紅景天苷含量較高，而且可根據(jù)需要進行多次噴灑，以提高紅景天苷在益母草體內(nèi)的積累量。總之，利用益母草本身具有的UGTs，通過添加外源性酪醇，然后在體內(nèi)轉(zhuǎn)化合成紅景天苷，可成為紅景天苷生產(chǎn)的一條全新途徑。

益母草懸浮細胞系轉(zhuǎn)化酪醇生成紅景天苷，是以益母草水培實驗結(jié)果為基礎(chǔ)開展的。通過此項實驗，進一步驗證了益母草細胞含有轉(zhuǎn)化酪醇生成紅景天苷的UGTs。同時，比較2項實驗結(jié)果，還可看到益母草懸浮細胞系在產(chǎn)紅景天苷上具有以下2方面的優(yōu)勢：時間優(yōu)勢，益母草從種子萌芽到植株長成需較長的水培周期，而益母草懸浮細胞系一旦建成，便可對細胞進行不間斷地繼代培養(yǎng)，甚至是冷凍保存，當再次需要進行轉(zhuǎn)化合成時，又可在短時間內(nèi)活化，因而能有效縮短紅景天苷的生產(chǎn)周期。此外，益母草植株從外界吸收酪醇到產(chǎn)生紅景天苷需1 d左右時間，而益母草懸浮細胞系則只需幾個小時，這也說明益母草懸浮細胞系較益母草水培植株，在生成紅景天苷上具有較大的時間優(yōu)勢；空間優(yōu)勢，一株益母草的水培需要較大空間來容納水培相關(guān)設(shè)備，如水培箱、通氣泵等，而一瓶益母草懸浮細胞則不需要太大空間，因而采用懸浮細胞的培養(yǎng)方式，可實現(xiàn)有限的生產(chǎn)空間最大化的生產(chǎn)目標產(chǎn)物。綜合以上分析，益母草懸浮細胞系是比水培方式更加適合益母草大規(guī)模生產(chǎn)紅景天苷的新方式。

益母草作為一種草本中藥材，具有活血調(diào)經(jīng)、利尿消腫、清熱解毒等作用，常用于月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)經(jīng)閉、惡露不盡、水腫尿少、瘡瘍腫毒等病癥[19]。在本研究中通過水培或懸浮細胞培養(yǎng)，使其含有了新物質(zhì)紅景天苷。該物質(zhì)的抗疲勞、抗缺氧、抗炎、增強免疫力等功效，在一定程度上有助于益母草發(fā)揮其原有的藥效，達到更好的治療效果，因而后續(xù)有待進一步對含紅景天苷的益母草或懸浮細胞進行相關(guān)研究，從而為益母草生產(chǎn)紅景天苷，以及開發(fā)益母草相關(guān)的醫(yī)藥保健產(chǎn)品奠定理論基礎(chǔ)。