耿顯勝，葉碧歡，張威，陳友吾，舒金平，林明

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023）

榧樹(shù)Torreya grandis是紅豆杉科Taxaceae 榧樹(shù)屬Torreya常綠針葉樹(shù)種，也是國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物[1]。榧樹(shù)自然變異類型或單株中選出的優(yōu)良栽培品種香榧T.grandis‘Merrillii’是我國(guó)東南部的重要經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，在當(dāng)?shù)亓謽I(yè)經(jīng)濟(jì)中發(fā)揮著重要作用[2-3]。香榧種子不僅富含蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、角鯊烯、植物甾醇、生育酚、煙酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性成分，而且風(fēng)味獨(dú)特、香氣誘人，深受中國(guó)消費(fèi)者歡迎，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1,4-7]。香榧的種植面積和堅(jiān)果年產(chǎn)量均不大，產(chǎn)品供不應(yīng)求，市場(chǎng)價(jià)格高達(dá)120～200 元·kg-1，是目前價(jià)格最高的干果之一[2-3,8]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，浙江省諸暨市趙家鎮(zhèn)和東白湖鎮(zhèn)每年生產(chǎn)香榧堅(jiān)果1 000 多噸，年收入約4 億元人民幣[3,8]。目前，中國(guó)有超過(guò)5 萬(wàn)農(nóng)民以種植香榧和生產(chǎn)香榧堅(jiān)果作為主要的經(jīng)濟(jì)收入來(lái)源，香榧已成為農(nóng)民發(fā)家致富的潛力樹(shù)種[3,8]。

癭螨Eriophyoidea 是植食性螨類中經(jīng)濟(jì)重要性僅次于葉螨Tetranychoidea 的一類害螨[9]。癭螨不僅直接刺吸危害植物，危害造成蟲(chóng)癭、毛氈、水皰、叢生、器官變色和卷曲畸形、器官脫落等癥狀，同時(shí)還能傳播植物病毒病，造成間接危害。我國(guó)危害香榧的癭螨最早報(bào)道于1988 年[10]，而浙江省香榧受癭螨危害的報(bào)道最早是在2002 年[11]。目前，浙江省的各香榧產(chǎn)區(qū)均發(fā)現(xiàn)有癭螨危害，癭螨已成為香榧的主要害蟲(chóng)。癭螨群聚于香榧葉片上吸取細(xì)胞汁液和葉綠體，輕則造成葉片失綠呈黃褐色，影響葉片的光合作用，重則引起大量落葉，甚至整株樹(shù)木死亡[11-12]。如何高效地防控癭螨，保障香榧林的健康經(jīng)營(yíng)，成為生產(chǎn)中需要解決的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。

癭螨由于個(gè)體小，形態(tài)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，用于分類的外部形態(tài)特征少，并且有些形態(tài)特征存在同塑性進(jìn)化（Homoplastic evolution）現(xiàn)象，這給傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定帶來(lái)了困難和挑戰(zhàn)[9,13-14]?；诜肿由飳W(xué)的鑒定技術(shù)具有鑒定速度快、精確度高、重復(fù)性好、對(duì)樣品完整性要求低等特點(diǎn)，已成為物種鑒定的重要方法[15-16]。而將形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)與分子生物學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合的鑒定方法，已成為癭螨物種鑒定最有效的方法[9,13-14,17]。本研究擬采用形態(tài)學(xué)鑒定法對(duì)香榧癭螨進(jìn)行物種鑒定，采用林間生物測(cè)定法測(cè)定了4 種殺螨劑和1 種捕食螨的防治效果，以期為香榧癭螨的物種鑒定及高效防控提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 香榧癭螨的形態(tài)學(xué)鑒定

2020 年6 月，于浙江省杭州市富陽(yáng)區(qū)癭螨危害的香榧林（30°2′2" N，119°42′32" E），用枝剪剪取香榧枝條，裝于自封袋內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室。從枝條上剪取香榧葉片，置于VHX-5000 超景深三維顯微鏡下觀察，初步確定葉片上存在大量的癭螨。使用毛筆挑取葉片上的癭螨，制備成玻片標(biāo)本，用于形態(tài)學(xué)鑒定和繪圖。

1.2 香榧癭螨的系統(tǒng)發(fā)育分析

顯微鏡下使用毛筆挑取香榧葉片上的癭螨，置于含180 μL Buffer GL 的2 mL 離心管內(nèi)，每管挑30 頭癭螨，共挑3 管。依據(jù)通用型基因組提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0,TaKaRa）的方法提取基因組總DNA。

以提取的總DNA 為模板，采用3 對(duì)引物（表1）擴(kuò)增28S rDNA、18S rDNA 和COI基因片段。28S rDNA和18S rDNA 基因片段PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2×PCR Mix 10 μL，10 μmol·L-1的正、反向引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，加ddH2O 補(bǔ)足20 μL。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性35 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。COI基因片段PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系和條件參考Xue 等[18]的方法，具體的反應(yīng)體系為：2×PCR Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1的正、反向引物各1 μL，DNA 模板2 μL，加ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：96 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，46 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR 擴(kuò)增為陽(yáng)性的產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序序列使用DNAMAN 9.0 進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，并使用NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線比對(duì)分析，下載與候選序列具有很高同源性的GenBank 序列。

表1 本研究使用的引物序列Table 1 Primer sequences

使用PhyloSuite v.1.2.2 軟件對(duì)癭螨總科26 個(gè)物種/憑證樣本的28S rDNA-18S rDNA 序列聯(lián)合構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[19]，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)時(shí)使用的外群為葉螨總科Tetranychoidea 的神澤葉螨Tetranychus kanzawai。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的具體方法和參數(shù)設(shè)置參見(jiàn)Geng 等[20]的方法和參數(shù)設(shè)置。構(gòu)建好的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)使用FigTree v.1.4.3及Adobe Illustrator CS6 查看和美化。

1.3 香榧癭螨防控技術(shù)研究

1.3.1 供試藥劑和捕食螨 15% 噠螨靈（廣西田園生化股份有限公司），3%甲維·虱螨脲和5%阿維菌素（浙江世佳科技有限公司），21%阿維·螺螨酯（浙江永農(nóng)生物科學(xué)有限公司）；加州新小綏螨Neoseiulus californicus（福建福州冠農(nóng)生物科技有限公司）。

1.3.2 化學(xué)農(nóng)藥林間防治效果測(cè)定 2021 年10 月15 日，在浙江省衢州市衢江區(qū)選取冷杉納氏癭螨Nalepella abiesis危害的12 年生香榧人工林（29°07′16" N，118°58′21" E）開(kāi)展林間防治效果測(cè)定。參考農(nóng)藥使用說(shuō)明書(shū)推薦的施用濃度，用自來(lái)水將15%噠螨靈、3% 甲維·虱螨脲、5%阿維菌素和21%阿維·螺螨酯4 種化學(xué)農(nóng)藥分別配制成高濃度（1 500 倍、1 000 倍、1 000 倍和2 500 倍）和推薦濃度（3 000 倍、2 000 倍、2 000 倍和5 000 倍）2 個(gè)濃度梯度。采用噴霧法施藥，每個(gè)處理噴霧4 株香榧，每株香榧的平均噴霧量為5 L。試驗(yàn)以噴霧清水為對(duì)照處理。噴霧前和噴霧后7 d，每株香榧從東南西北4 個(gè)方向各剪取1 個(gè)枝條，帶回實(shí)驗(yàn)室。每個(gè)枝條上取新葉和老葉各1 片，在VHX-5000 顯微鏡下統(tǒng)計(jì)施藥前后每片葉子上冷杉納氏癭螨的蟲(chóng)口數(shù)量，計(jì)算每個(gè)處理的蟲(chóng)口減退率和防治效果。蟲(chóng)口減退率和防治效果的計(jì)算公式如下：

1.3.3 加州新小綏螨室內(nèi)和林間捕食效果測(cè)定 在室內(nèi)使用培養(yǎng)皿搭建水阻隔平臺(tái)，進(jìn)行加州新小綏螨室內(nèi)捕食實(shí)驗(yàn)。采集冷杉納氏癭螨危害的香榧葉片，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)葉片上癭螨的數(shù)量，之后將葉片放置于培養(yǎng)皿中，接入加州新小綏螨，實(shí)驗(yàn)共用9 片香榧葉片。接螨后的水阻隔平臺(tái)放置于人工氣候箱內(nèi)。人工氣候箱的設(shè)置為：溫度25℃，相對(duì)濕度85%，光照強(qiáng)度2 000 lx，光周期12D:12L。48 h 后統(tǒng)計(jì)香榧葉片上的冷杉納氏癭螨數(shù)量，計(jì)算捕食率。捕食率的計(jì)算公式如下：

捕食率=被捕食的癭螨數(shù)量÷癭螨總數(shù)×100%

2021 年10 月15 日，在浙江省衢州市衢江區(qū)選取冷杉納氏癭螨危害的12 年生香榧人工林開(kāi)展林間防治效果測(cè)定。每株香榧樹(shù)上掛5 袋加州新小綏螨（3 000 頭·袋-1），實(shí)驗(yàn)重復(fù)4 次。釋放捕食螨前和7 d 之后，每株香榧從東南西北4 個(gè)方向各剪取1 個(gè)枝條，帶回實(shí)驗(yàn)室。依據(jù)1.3.2 的方法統(tǒng)計(jì)葉片上害螨的蟲(chóng)口數(shù)量，使用1.3.2 的公式計(jì)算蟲(chóng)口減退率和防治效果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2010 和SPSS 23.0 進(jìn)行分析處理。使用SPSS 23.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)、方差齊性檢驗(yàn)和方差分析。方差分析時(shí)，需要對(duì)蟲(chóng)口減退率和防治效果的原始數(shù)據(jù)做反正旋轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果與分析

2.1 香榧癭螨的形態(tài)學(xué)鑒定

室內(nèi)顯微觀察發(fā)現(xiàn)，香榧葉片上存在大量的癭螨。癭螨的卵和若蟲(chóng)存在于葉片的背面，成蟲(chóng)活動(dòng)能力強(qiáng)于若蟲(chóng)，主要存在于葉片的背面，但腹面也有分布。癭螨使用刺吸式口器吸食香榧葉片的汁液和葉綠體，造成受害部位初期呈白色失綠狀，后期呈黃褐色。大量癭螨聚集在香榧葉片上危害，輕則造成葉片發(fā)黃且失去光澤，嚴(yán)重者引起葉片脫落，甚至整株樹(shù)木死亡。

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，危害香榧的癭螨為冷杉納氏癭螨。該癭螨隸屬于植羽癭螨科Phytoptidae 納氏癭螨屬Nalepella。冷杉納氏癭螨的主要鑒別特征為：體紡錘形；喙斜下伸，口針略彎曲；須肢端部平截，須肢背膝節(jié)剛毛不分叉；背盾板具前葉突，背瘤發(fā)達(dá)，圓柱形，背毛3 根，包括1 根短的內(nèi)頂毛和2 根長(zhǎng)的背毛；足6 節(jié)，具模式剛毛，羽狀爪完整，9 支，爪端球明顯，足I 脛節(jié)上具小刺，基節(jié)剛毛3 對(duì)；大體無(wú)亞背毛，腹剛毛俱全，如圖1。

圖1 冷杉納氏癭螨成螨的形態(tài)特征Figure 1 The morphological characteristics of adult N.abiesis

2.2 香榧癭螨的系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR 擴(kuò)增結(jié)果表明，3 對(duì)引物都能夠擴(kuò)增出特異性條帶，并且擴(kuò)增條帶的大小與預(yù)期大小一致（圖2），初步確定3 對(duì)引物能夠特異性擴(kuò)增出癭螨的28S rDNA、18S rDNA 和COI基因片段。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和序列分析，得到癭螨28S rDNA的460 bp 序列、18S rDNA 的807 bp 序列和COI基因的658 bp序列。

圖2 PCR 擴(kuò)增冷杉納氏癭螨28S rDNA、18S rDNA 和COI 基因片段Figure 2 PCR amplification of 28S rDNA,18S rDNA,and COI fragment from genomic DNA extracted from N.abiesis on T.grandis ‘Merrillii’

DNAMAN 9.0 多重序列比對(duì)結(jié)果表明，3 個(gè)樣品間18S rDNA 的同源性為99.75%，而3 個(gè)樣品間28S rDNA和COI 基因片段的同源性為100%。測(cè)序序列經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，未在GenBank 中找到同源性很高的癭螨物種序列。本研究獲取了冷杉納氏癭螨28S rDNA、18S rDNA 和COI基因序列，將這些序列提交到GenBank（登錄號(hào)分別為：OM701792、OM717253 和OM692372）。

使用癭螨總科26 個(gè)物種/憑證樣本的28S rDNA-18S rDNA 串聯(lián)序列采用貝葉斯推斷法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，建樹(shù)時(shí)28S rDNA 和18S rDNA 使用的核苷酸替換模型都是GTR+I+G。從貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以看出，26 個(gè)癭螨總科的物種/憑證樣本分成3 個(gè)分支，本研究的冷杉納氏癭螨與三毛癭螨屬Trisetacus、納氏癭螨屬Nalepella、博氏癭螨屬Boczekella和Setoptus屬的7 個(gè)物種/憑證樣本形成Clade I 分支，該分支所有物種/憑證樣本都屬于植羽癭螨科，表明這4 個(gè)屬間的親緣關(guān)系很近（圖3）。分析Clade I 包含物種的寄主植物，所有8個(gè)癭螨物種/憑證樣本的寄主植物都是裸子植物門的針葉樹(shù)種，表明寄生在親緣關(guān)系近的寄主植物上的癭螨物種也具有較近的親緣關(guān)系。Clade II 分支包含癭螨科Eriophyidae 和羽爪癭螨科Diptilomiopidae 的16 個(gè)物種/憑證樣本，表明癭螨科和羽爪癭螨科物種間的親緣關(guān)系很近（圖3）。Clade III 分支包含植羽癭螨科的2 個(gè)物種，這2 個(gè)物種都采集于俄羅斯，并且其寄主均為草本的莎草科Cyperaceae 植物（圖3）。

圖3 基于28S rDNA 和18S rDNA 序列聯(lián)合構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 3 Bayesian inference phytogenic tree based on 28S rDNA and 18S rDNA sequences

2.3 冷杉納氏癭螨防控技術(shù)研究

經(jīng)室內(nèi)顯微觀察，浙江省衢州市衢江區(qū)實(shí)驗(yàn)林的香榧葉片上也存在大量的冷杉納氏癭螨（圖4）。由表2 可知，防治前其蟲(chóng)口密度在16.84～30.84 頭·片葉-1，防治后其蟲(chóng)口密度降低到3.41～18.31 頭·片葉-1。施藥和釋放加州新小綏螨后冷杉納氏癭螨蟲(chóng)口密度和蟲(chóng)口減退率的方差分析結(jié)果表明，不同處理間差異顯著（P＜0.05）。所有9 種處理與對(duì)照處理間的差異都達(dá)到顯著水平（P＜0.05），表明所有的處理均能顯著降低香榧葉片上癭螨的蟲(chóng)口密度。高濃度和推薦濃度的15%噠螨靈、5%阿維菌素和21% 阿維·螺螨酯施用后，各處理的蟲(chóng)口密度差異均不顯著（P＞0.05）（表2），表明這3種農(nóng)藥在推薦濃度下即可明顯降低香榧葉片上的癭螨的蟲(chóng)口密度；施用高濃度（1 000 倍）和推薦濃度的3% 甲維·虱螨脲后，蟲(chóng)口密度差異顯著（P＜0.05）（表2），表明該藥劑在高濃度時(shí)對(duì)香榧葉片上癭螨的蟲(chóng)口密度的降低作用更明顯。

圖4 香榧葉片上的冷杉納氏癭螨Figure 4 N.abiesis on T.grandis ‘Merrillii’ leaf

防治效果表明，9 種處理的防治效果在55.93%～88.70%（表2），其中21%阿維·螺螨酯和15% 噠螨靈在推薦濃度下的防治效果在87.00%以上，高于5%阿維菌素和3%甲維·虱螨脲的防治效果，也顯著高于（P＜0.05）捕食螨的防治效果。因此，21%阿維·螺螨酯和15%噠螨靈對(duì)冷杉納氏癭螨的防治效果更好。

表2 施藥和釋放天敵前后香榧葉片上冷杉納氏癭螨的蟲(chóng)口密度和防治效果Table 2 Population density of N.abiesis on T.grandis ‘Merrillii’ leaves before and after chemical control and natural enemy release

室內(nèi)捕食螨的捕食效果表明，加州新小綏螨對(duì)冷杉納氏癭螨的卵、若螨和成螨均具有捕食功能，加州新小綏螨對(duì)9 張葉片上癭螨的捕食率為95.45%～100%。林間釋放加州新小綏螨時(shí)，其蟲(chóng)口減退率和防治食效果僅為26.25%和55.93%，低于室內(nèi)測(cè)定結(jié)果，也低于4 種化學(xué)農(nóng)藥的林間測(cè)定結(jié)果。很有可能是香榧葉片上冷杉納氏癭螨的蟲(chóng)口密度太大，釋放加州新小綏螨難以捕食掉所有的害螨。因此，生產(chǎn)中應(yīng)將捕食螨與化學(xué)農(nóng)藥聯(lián)合使用，先施用21%阿維·螺螨酯或15%噠螨靈，將蟲(chóng)口密度降低下來(lái)，然后再釋放加州新小綏螨。

3 結(jié)論與討論

本研究采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)的方法對(duì)香榧癭螨進(jìn)行物種鑒定，明確了危害香榧的癭螨為冷杉納氏癭螨，研究結(jié)果可為冷杉納氏癭螨的快速鑒定提供參考。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，冷杉納氏癭螨與三毛癭螨屬、納氏癭螨屬、博氏癭螨屬和Setoptus屬的7 個(gè)物種/憑證樣本間親緣關(guān)系近，而所有8 個(gè)癭螨物種/憑證樣本的寄主植物都是裸子植物門Gymnospermae 的針葉樹(shù)種，揭示癭螨物種的進(jìn)化與寄主植物相關(guān)聯(lián)。

香榧是一種壽命很長(zhǎng)的四季常綠的針葉樹(shù)種[2]，長(zhǎng)壽命和冬季不落葉的特性為冷杉納氏癭螨的寄生提供了穩(wěn)定的環(huán)境條件。冷杉納氏癭螨個(gè)體微小，人眼難以觀察到，加上早期的危害癥狀不明顯，這為冷杉納氏癭螨通過(guò)種苗或嫁接繁殖體遠(yuǎn)距離傳播和擴(kuò)散創(chuàng)造了條件。自2002 年首次在浙江省發(fā)現(xiàn)冷杉納氏癭螨危害以來(lái)，該害螨在浙江省迅速擴(kuò)散和蔓延。目前，浙江省的絕大多數(shù)種植區(qū)的香榧都遭受癭螨的危害。癭螨危害致使香榧葉片失綠，嚴(yán)重者葉片大量脫落，甚至整株死亡[11,17]。如何高效地防控冷杉納氏癭螨，成為生產(chǎn)中需要解決的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。本研究通過(guò)林間生物測(cè)定法，測(cè)定了4 種殺螨劑和1 種捕食螨在林間的防治效果。4 種化學(xué)農(nóng)藥中，21%阿維·螺螨酯和15%噠螨靈在推薦濃度下的防治效果均超過(guò)87.00%，高于另外2 種化學(xué)農(nóng)藥。因此，21%阿維·螺螨酯和15%噠螨靈的防治效果更好。生產(chǎn)中可以將這2 種化學(xué)農(nóng)藥交替使用，防止冷杉納氏癭螨產(chǎn)生抗藥性。另外，本研究選擇在香榧果實(shí)采收后施藥，避免了化學(xué)農(nóng)藥對(duì)香榧果實(shí)的污染，保障了可食用林產(chǎn)品的品質(zhì)。

加州新小綏螨對(duì)冷杉納氏癭螨的卵、若螨和成螨均具有捕食功能，其在林間的防治效果為55.93%。生產(chǎn)中應(yīng)將加州新小綏螨與化學(xué)農(nóng)藥聯(lián)合使用，先施用化學(xué)農(nóng)藥降低冷杉納氏癭螨的蟲(chóng)口密度，然后再釋放加州新小綏螨，利用捕食螨主動(dòng)搜尋獵物的功能，將葉片上殘存的害螨清除掉，從而達(dá)到高效防控冷杉納氏癭螨的目的。

致謝：本研究中癭螨物種的形態(tài)學(xué)鑒定得到廣西大學(xué)王國(guó)全教授和貴州大學(xué)乙天慈教授的幫助，謹(jǐn)此致謝。