余敏芬，梅家琪，何立平，李東賓，徐棟斌，楊影，袁虎威，閆道良，鄭炳松

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省森林芳香植物康養(yǎng)功能研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；3.寧波市林場(chǎng)，浙江 寧波 315440）

櫟屬Q(mào)uercus是殼斗科Fagaceae 中分布最廣、種類最多的屬，主要分布在亞洲、非洲、歐洲以及美洲地區(qū)[1]。如我國(guó)的栓皮櫟Q.variabilis，從遼寧省南部到云南省中部皆有分布，并且分布的海拔上限從北到南不斷增加[2]，橫跨亞熱帶、熱帶[3]。與其它樹種相比，櫟屬植物應(yīng)用頗多。櫟屬植物的木材堅(jiān)硬。趙涇峰等[4]發(fā)現(xiàn)陜西4 種櫟屬植物的木材皆可用作實(shí)木地板和建筑材料。櫟屬Q(mào)uercus樹種又稱橡樹，其種子被稱作橡子。橡子可以食用，營(yíng)養(yǎng)豐富。魏練平等[5]測(cè)定了安徽黃山出產(chǎn)的橡子粉，其淀粉含量高達(dá)83.24%。橡子亦可用于釀酒。據(jù)報(bào)道，將橡子粉和糯米以一定的比例混合發(fā)酵，可以產(chǎn)生大量酒精，成品酒中富含糖分、有機(jī)酸，還含有氨基酸、礦質(zhì)元素和維生素等[6]。由此可見，櫟屬植物具有巨大的開發(fā)利用價(jià)值。

鑒定不同櫟屬植物的遺傳多樣性和親緣關(guān)系是對(duì)其進(jìn)行有效利用的基礎(chǔ)和前提。分子標(biāo)記是分析物種遺傳多樣性和親緣關(guān)系的有力工具。在眾多分子標(biāo)記中，簡(jiǎn)單序列重復(fù)間擴(kuò)增（inter-simple sequence repeat，ISSR）標(biāo)記是目前最有效的分子標(biāo)記之一[7]，具有操作簡(jiǎn)單、多態(tài)性高、經(jīng)濟(jì)方便等優(yōu)點(diǎn)。ISSR 標(biāo)記是以在簡(jiǎn)單重復(fù)序列的末端加2～4 個(gè)隨機(jī)核苷酸序列為引物，通過PCR 反應(yīng)在簡(jiǎn)單重復(fù)序列間進(jìn)行擴(kuò)增的標(biāo)記技術(shù)[8]。ISSR分子標(biāo)記可用于分子輔助育種、親緣關(guān)系分析和遺傳多樣性分析等多個(gè)方面。目前，已有大量研究利用ISSR 分子標(biāo)記對(duì)植物進(jìn)行親緣關(guān)系分析和遺傳多樣性分析。廖菊陽(yáng)等[9]利用ISSR 標(biāo)記對(duì)28 種杜鵑屬Rhododendron植物進(jìn)行了分析，擴(kuò)增出127 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性比例高達(dá)96.21%，并以平均相似系數(shù)0.588 為閾值，將28種杜鵑屬植物分為三個(gè)類群。曾惠敏等[10]利用ISSR 標(biāo)記對(duì)14 個(gè)八仙花（繡球Hydrangea macrophylla）品種進(jìn)行分析，計(jì)算出的14 個(gè)八仙花品種的遺傳相似系數(shù)皆大于0.9，表明了其相近的親緣關(guān)系，并在遺傳相似性系數(shù)約0.38 處將14 個(gè)八仙花品種分為兩類。李杉杉[11]等利用ISSR 標(biāo)記對(duì)20 個(gè)種質(zhì)的紫花苜蓿Medicago sativa進(jìn)行遺傳多樣性分析，其多態(tài)性條帶比率達(dá)82.67%。禹靚倩等[12]采用ISSR 分子標(biāo)記分析了27 個(gè)櫟屬樹種的親緣關(guān)系，利用12 條引物擴(kuò)增出140 個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)比率為82.14%，將27 個(gè)櫟屬樹種分為5 類。Coutinho等[13]利用ISSR 分子標(biāo)記分析了國(guó)外部分櫟屬資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，為其開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

近年來(lái)，我國(guó)從國(guó)外引進(jìn)了一些櫟屬植物，但對(duì)這些櫟屬植物的遺傳多樣性和相對(duì)親緣關(guān)系還不清楚，限制了其在我國(guó)的開發(fā)利用。本文擬用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)9 種從國(guó)外引進(jìn)的櫟屬植物（種或品種）進(jìn)行遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系分析，以期為從國(guó)外引種的櫟屬植物的有效利用提供科學(xué)依據(jù)并奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2017 年10 月，寧波市林場(chǎng)從海寧俄勒崗苗木繁育技術(shù)有限公司引進(jìn)‘針櫟’Q.palustris‘Pin Oak’、‘猩紅橡木’Q.coocinea‘Scarlet Oak’、‘太平洋光輝’Q.palustris‘Pacific Brilliance’、‘沼澤白橡木’Q.icolor‘Swamp White Oak’、‘北方紅橡’Q.rubra‘Red Oak’、‘綠柱’Q.palustris‘Green pillar’ 6 個(gè)櫟屬品種（均為海寧俄勒崗苗木繁育技術(shù)有限公司2014 年從美國(guó)引入）地徑為2～5 cm 的實(shí)生苗，按4 m×4 m 株行距在露地?zé)o保護(hù)狀態(tài)下栽培。種植試驗(yàn)地的海拔為730 m，面積為0.67 hm2。2017 年11 月，寧波市林場(chǎng)從湖南長(zhǎng)沙引進(jìn)柳葉櫟Q.phellos和2 種娜塔櫟Q.nuttallii種質(zhì)（紅葉娜塔櫟和綠葉娜塔櫟）苗木，均為早期從北美引進(jìn)種子進(jìn)行播種培育的5 年生實(shí)生苗。這些櫟屬品種引進(jìn)后均生長(zhǎng)良好，能在寧波市林場(chǎng)基地正常萌芽、生長(zhǎng)、變色和落葉，但部分櫟屬品種冬天易受雪壓折斷，部分出現(xiàn)病蟲害，還在進(jìn)一步觀察和研究中。

本文以這9 種國(guó)外引進(jìn)的櫟屬植物的葉片為實(shí)驗(yàn)材料，葉片于2018 年5 月9 日采自寧波市林場(chǎng)種植基地，多株混合采樣，樣品采集后立即放入液氮中暫存，隨后帶到浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，在－80℃超低溫冰箱中保存以用于后續(xù)測(cè)定。9 種櫟屬植物的基本信息如表1。

表1 9 種國(guó)外引進(jìn)櫟屬植物的基本信息Table 1 Morphological traits of introduced nine species/cultivars of Quercus

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 的提取及質(zhì)量檢測(cè) 參考王玲玲等[14]的方法，利用改良CTAB 法提取櫟屬植物葉片基因組DNA。每個(gè)樣品至少進(jìn)行3 次重復(fù)提取。提取后用NanoDrop-1000 分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 的濃度和純度（OD260/280）；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的質(zhì)量。

1.2.2 ISSR引物的篩選及PCR擴(kuò)增 基于前人的研究[15-17]，結(jié)合加拿大哥倫比亞大學(xué)報(bào)道的100條櫟屬植物ISSR引物，從中篩選出26 條引物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。根據(jù)公司提供的引物的Tm 值，設(shè)定合適的退火溫度，具體信息如表2。

表2 ISSR 引物信息Table 2 The ISSR primers used in this study

以提取的9 份櫟屬植物的DNA 為PCR 反應(yīng)的模板，分別用26 條引物進(jìn)行產(chǎn)物擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系共25.0 μL，包括櫟屬植物DNA 0.5 μL、ISSR 引物2.0 μL、rTaq 酶12.5 μL。反應(yīng)體系中的rTaq Mix 為預(yù)混型rTaq 酶（日本，Takara），其中包含了DNA 聚合酶、Mg2+、反應(yīng)緩沖液、dNTP 等成分。ISSR-PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，依據(jù)表5 中的Tm 值退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5% 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，恒壓135 V 電泳35 min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳條帶并拍照。每個(gè)樣品的PCR 擴(kuò)增至少進(jìn)行3 次重復(fù)，以減少誤差。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

電泳條帶記錄時(shí)，用數(shù)字“1”表示電泳圖中某孔道在該行中存在條帶，用數(shù)字“0”表示電泳圖中某孔道在該行中不存在條帶。根據(jù)條帶統(tǒng)計(jì)結(jié)果，用分析軟件NTsys-pc 2.10e 計(jì)算9 種櫟屬植物之間的遺傳相似系數(shù)，并基于遺傳相似系數(shù)進(jìn)行聚類分析，聚類方法選用UPGMA。

2 結(jié)果與分析

2.1 9 種櫟屬植物的ISSR 擴(kuò)增結(jié)果

用26 條ISSR 引物（見表2）對(duì)9 種櫟屬植物的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，共篩選出23 條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高的ISSR 引物。以4 號(hào)引物UBC-810 所擴(kuò)增結(jié)果為例，9 種櫟屬植物在該引物擴(kuò)增位點(diǎn)的多態(tài)性較高，共擴(kuò)增出18 條電泳條帶，其中多態(tài)性條帶有17 條，多態(tài)性條帶百分率達(dá)94.44%（圖1），初步顯示了9 種櫟屬植物間的遺傳差異。

圖1 9 種櫟屬植物的ISSR 擴(kuò)增結(jié)果（以4 號(hào)引物UBC-810 為例）Figure 1 ISSR amplification bands of the introduced nine species of Quercus (primer: UBC-810)

2.2 9 種櫟屬植物的ISSR 遺傳多樣性

以擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高的23 條ISSR 引物進(jìn)行9 種櫟屬植物間的遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)23 條引物共擴(kuò)增出319 條條帶，除UBC-879 僅擴(kuò)增出3 條條帶以外，其它每條引物至少擴(kuò)增出了9 條條帶，其中引物UBC-845 擴(kuò)增出的條帶數(shù)最多（為20 條），平均每個(gè)引物擴(kuò)增出13.87 條條帶。在319 條擴(kuò)增條帶中，298 條為多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性條帶百分率為93.42%。在23 條引物中，多態(tài)性條帶百分率最低的為66.67%（3 號(hào)引物），最高的為100%（共有11 條引物）（表3），表明這9種櫟屬植物的遺傳多樣性較為豐富。

表3 9 種櫟屬植物在23 條ISSR 引物位點(diǎn)上的擴(kuò)增條帶統(tǒng)計(jì)Table 3 Bands amplified by the 23 ISSR polymorphic primers of nine introduced species of Quercus

2.3 9 種櫟屬植物的親緣關(guān)系分析

從9 種櫟屬植物的遺傳相似系數(shù)分析結(jié)果可以看出，除了Q6 (‘沼澤白橡木’)與其它櫟屬植物的遺傳相似系數(shù)在0.485 9～0.558 0 外，其它8 種櫟屬植物互相之間的遺傳相似系數(shù)都在0.605 0～0.764 9（表4）。由此可以說(shuō)明‘沼澤白橡木’與其它8 種櫟屬植物的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。在9 種櫟屬植物中，遺傳相似系數(shù)最大，即兩個(gè)品種間親緣關(guān)系最近的是Q9 (‘綠柱’)和Q4 (‘太平洋光輝’)，兩者間的遺傳相似系數(shù)為0.764 9，與其同屬于沼生櫟品種的客觀事實(shí)相符。

表4 9 種櫟屬植物的遺傳相似系數(shù)Table 4 Genetic similarity coefficients of the nine introduced species of Quercus

根據(jù)遺傳相似系數(shù)對(duì)9 種櫟屬植物進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖2。由圖2 可知，在遺傳相似系數(shù)0.650 處，9種櫟屬植物可分為3 類，其中3 個(gè)沼生櫟品種（‘綠柱’‘太平洋光輝’和‘針櫟’）和2 種娜塔櫟種質(zhì)（紅葉娜塔櫟和綠葉娜塔櫟）被歸為第一類，柳葉櫟、‘猩紅橡木’以及‘北方紅橡’被歸為第二類，而‘沼澤白橡木’單獨(dú)歸為第三類。在第一類中，‘綠柱’和‘太平洋光輝’沼生櫟兩者之間的親緣關(guān)系最近?！訚砂紫鹉尽推渌? 種櫟屬植物的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖2 基于遺傳相似系數(shù)的9 種櫟屬植物UPGMA 聚類Figure 2 UPGMA dendrogram of the nine introduced species of Quercus based on genetic similarity coefficients

3 結(jié)論與討論

櫟屬植物具有重要的開發(fā)利用價(jià)值[18-19]。世界上的櫟屬植物約有300 種，我國(guó)僅有51 種，因此，引進(jìn)并合理開發(fā)利用國(guó)外優(yōu)良櫟屬種質(zhì)資源對(duì)于豐富我國(guó)櫟屬種質(zhì)資源并促進(jìn)其開發(fā)利用具有重要意義。近年來(lái)，我國(guó)從國(guó)外引進(jìn)了一些櫟屬植物資源，但對(duì)其開發(fā)利用水平有限。充分利用國(guó)外優(yōu)良櫟屬種質(zhì)資源的優(yōu)勢(shì)提升我國(guó)櫟屬植物的遺傳改良水平對(duì)于促進(jìn)我國(guó)櫟屬植物的開發(fā)利用具有積極影響。了解國(guó)外引進(jìn)櫟屬植物的相對(duì)親緣關(guān)系和遺傳多樣性，是將其應(yīng)用到我國(guó)櫟屬植物遺傳改良進(jìn)程中的基礎(chǔ)性工作。

分子標(biāo)記技術(shù)是對(duì)植物種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系分析和遺傳多樣性評(píng)價(jià)的有效技術(shù)手段。在多種分子標(biāo)記中，ISSR 分子標(biāo)記是最簡(jiǎn)便有效的分子標(biāo)記之一，被廣泛應(yīng)用于輔助選育[20]、品種鑒定[21]、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、遺傳多樣性研究[22]、遺傳圖譜構(gòu)建[23]以及親緣關(guān)系分析[24]等多個(gè)方面。ISSR 分子標(biāo)記在多個(gè)物種的親緣關(guān)系分析和遺傳多樣性分析上具有廣泛應(yīng)用。王志清[25]等采用ISSR 標(biāo)記分析了61 份細(xì)辛Asarum sieboldii種質(zhì)的遺傳多樣性，其多態(tài)性條帶的比例為86.3%。原勤勤等[26]對(duì)38 個(gè)優(yōu)良棗Ziziphus jujuba品種進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)品種間的親緣關(guān)系與地理位置密切相關(guān)。寧?kù)o等[27]對(duì)110 個(gè)株系的黃金茶Camellia sinensis‘Huangjincha’ 進(jìn)行了親緣關(guān)系分析和遺傳多樣性分析，共獲得187 個(gè)多態(tài)性條帶，多態(tài)率高達(dá)91.22%，并在遺傳相似系數(shù)平均值0.55處，將黃金茶分為7 個(gè)類群。嚴(yán)華[28]等利用ISSR 分子標(biāo)記對(duì)38 個(gè)品種的國(guó)蘭（蘭科Orchidaceae 蘭屬Cymbidium植物）進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，得出的親緣關(guān)系聚類圖與傳統(tǒng)分類的結(jié)果基本一致，并選用其中兩個(gè)品種進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，獲得其成形的干果。由此也說(shuō)明了ISSR 分子標(biāo)記在親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性評(píng)價(jià)、指導(dǎo)植物輔助育種等方面具有一定的可行性。

本研究選用23 條ISSR 引物，利用PCR 技術(shù)對(duì)9 種國(guó)外引種的櫟屬植物進(jìn)行遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系分析，共擴(kuò)增出298 條多態(tài)性條帶，其多態(tài)性條帶比例達(dá)93.42%，其中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶的比率為100%的引物有11 條，表明這9 種櫟屬植物的遺傳多樣性較高。禹靚倩等對(duì)27 種櫟屬樹種親緣關(guān)系的分析發(fā)現(xiàn)，利用12 條ISSR 引物擴(kuò)增出140 個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)比率為82.14%[12]。本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)基于ISSR 分子標(biāo)記的櫟屬植物的多態(tài)性條帶比率均超過80%，顯示了所研究的櫟屬植物具有較高的遺傳多樣性；同時(shí)，本文研究的9 種國(guó)外引進(jìn)櫟屬植物的多態(tài)性條帶比例為93.42%，顯著高于前人對(duì)27 種櫟屬樹種的研究，顯示了國(guó)外引進(jìn)的9種櫟屬植物的較高遺傳多樣性，這也為其在國(guó)內(nèi)櫟屬植物遺傳改良中的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的材料基礎(chǔ)。

本研究利用ISSR分子標(biāo)記，從分子水平上揭示9種國(guó)外引進(jìn)的櫟屬植物的親緣關(guān)系。從遺傳相似系數(shù)來(lái)看，在遺傳相似系數(shù)為0.650 處，可將9 種櫟屬植物分為3 類，其中‘沼澤白橡木’和其它8 種櫟屬植物的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，而3 種沼生櫟（‘綠柱’‘太平洋光輝’和‘針櫟’）之間的親緣關(guān)系最近，ISSR 親緣分析聚類結(jié)果與傳統(tǒng)分類結(jié)果相似。從表型特征上看，‘綠柱’‘太平洋光輝’和‘針櫟’三者的樹形、秋色、樹高等表型特征較為接近，但仍能在分子水平上檢測(cè)出它們之間的差別，說(shuō)明根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，個(gè)體之間沒有較大差異的品種，利用ISSR 標(biāo)記仍能鑒別出其在分子水平上的差別。但值得注意的是，2 個(gè)娜塔櫟種質(zhì)的表型特征相近，最顯著的區(qū)別僅為葉色，但從分子水平上看，綠葉娜塔櫟種質(zhì)與3 個(gè)沼生櫟品種的親緣關(guān)系更近。因此，不能僅僅依據(jù)物種的表型特征來(lái)判斷物種之間的親緣關(guān)系。建議對(duì)于親緣關(guān)系的分析，應(yīng)該結(jié)合分子標(biāo)記、形態(tài)學(xué)標(biāo)記等多種遺傳標(biāo)記綜合考慮，進(jìn)而分析確定物種以及品種之間的親緣關(guān)系。當(dāng)然，當(dāng)前的分類結(jié)果是基于少數(shù)ISSR 位點(diǎn)的多態(tài)性，通量較低，可能對(duì)親緣分析結(jié)果有一定的影響，未來(lái)可應(yīng)用更多的標(biāo)記進(jìn)行進(jìn)一步分析。在未來(lái)育種過程中，參考本文的分析結(jié)果，利用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的品種進(jìn)行雜交可創(chuàng)造更為優(yōu)良的種質(zhì)資源，從而保證育種群體的遺傳多樣性，促進(jìn)櫟屬植物應(yīng)用的可持續(xù)發(fā)展。