樸兆佳， 于海業(yè)， 張郡赫， 周海根， 劉 爽， 孔麗娟， 黨敬民

吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院， 吉林 長春 130022

引 言

小麥是我國的主要糧食作物， 其產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)量的五分之一左右， 在國民經(jīng)濟發(fā)展中具有舉足輕重的地位[1]。 然而， 隨著全球氣候變暖， 海平面上升， 耕地鹽漬化問題日趨明顯。 我國耕地面積約3460萬hm2， 發(fā)生鹽漬化的土壤近760萬hm2[2]。 土壤的鹽漬化， 導(dǎo)致小麥產(chǎn)量明顯降低。 與此同時， 小麥在生長期間經(jīng)常遭遇昆蟲取食。 全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心制定的《2020年小麥玉米油菜重大病蟲害防控技術(shù)方案》指出， 我國小麥主要產(chǎn)區(qū)蟲害發(fā)生達3.8億畝次。 昆蟲通過對小麥葉片和莖稈等部位進行刺吸和咬食， 極易造成物理損傷， 進而影響小麥光合作用及營養(yǎng)的吸收和傳導(dǎo)[3]。 由此可見， 鹽和物理損傷脅迫已經(jīng)對小麥健康生長和最終產(chǎn)量造成了嚴重的影響。 研究表明， 細胞壁是植物細胞直接抵御逆境脅迫的重要防線。 鹽脅迫下， 細胞滲透壓增大， 質(zhì)膜的透性會受到一定程度的影響。 為了維持細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)， 植物細胞壁中的果膠等多糖物質(zhì)會發(fā)生不同程度的轉(zhuǎn)化和改變[4]。 物理損傷， 會加深植物細胞膜脂過氧化的程度， 使膜通透性增大， 導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的流失和降解。 受到損傷的部位及其周邊細胞還會發(fā)生栓化以阻塞病菌的侵入[5]。 在鹽和物理損傷脅迫下， 植物的細胞壁和膜系統(tǒng)都會做出相應(yīng)的響應(yīng)[6]。 因此， 作為植物細胞壁主要成分且能夠反映細胞壁以及膜系統(tǒng)的完整性和透過性[7]的果膠， 可以作為研究脅迫下植物內(nèi)部物質(zhì)響應(yīng)規(guī)律的重要指標。

目前， 檢測果膠的常用方法有質(zhì)量法、 比色法、 液相色譜法等[8-10]。 張方艷等利用質(zhì)量法對獼猴桃所含果膠進行了測定。 實驗中， 將氯化鋇(BaCl2)溶液和氯化鈣(CaCl2)溶液作為沉淀試劑加入到各自的目標汁液中。 結(jié)果表明， 通過前者提取的果膠含量比后者提取的高將近1個百分點， 而且準確性更高[8]。 陶阿麗等采用比色法對豆腐柴葉內(nèi)的果膠含量進行了研究。 實驗過程中， 對濃硫酸用量、 水解溫度、 咔唑無水乙醇溶液等測定條件進行了優(yōu)化。 此方法的相對標準偏差(RSD)為1.529%[9]。 吳玉萍等基于液相色譜法分析了煙草中果膠的含量。 方法是， 先將煙草酸化處理產(chǎn)生半乳糖醛酸， 然后測定半乳糖醛酸含量， 最終換算成果膠含量。 該方法的RSD優(yōu)于1.4%[10]。 上述果膠含量檢測方法操作繁瑣、 實時性不強、 對樣本損耗較大， 并且難以實現(xiàn)大面積作物果膠含量連續(xù)監(jiān)測。 亟需一種操作簡便、 速度快、 無損的檢測方法。 高光譜技術(shù)以其檢測速度快、 無損、 可重復(fù)操作等優(yōu)點， 廣泛應(yīng)用于作物生理信息的無損檢測[11-12]。 本工作旨在通過高光譜技術(shù)， 建立一種鹽與物理損傷脅迫下小麥果膠含量反演的新方法， 從而實現(xiàn)果膠含量的高精度、 快速、 無損檢測。

1 實驗部分

1.1 實驗環(huán)境及設(shè)置

實驗于吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院日光溫室內(nèi)進行。 溫室配有完善的通風(fēng)、 補光、 控溫、 加濕等裝置， 能夠有效調(diào)節(jié)小麥生長所需的環(huán)境。

將煙農(nóng)0428小麥作為研究對象。 先將小麥種子置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽， 一周后選取長勢一致的幼苗移栽到定時增氧型水培箱中。 培養(yǎng)液選用霍格蘭(Hoagland’s)標準營養(yǎng)液， 水培箱內(nèi)保持每日增氧時長8 h以上。 用TDS&EC測試儀監(jiān)測營養(yǎng)液濃度及pH值， 并對水培環(huán)境及時做出調(diào)整。

1.2 脅迫實驗設(shè)計

通過向培養(yǎng)液中施加氯化鈉(NaCl)溶液和對小麥第一片葉主脈兩側(cè)針刺分別模擬鹽脅迫和昆蟲叮咬造成的物理損傷。 鹽脅迫和物理損傷脅迫程度分別由NaCl溶液的濃度以及針刺孔數(shù)控制。 共選取120株小麥， 分別按單因素脅迫和復(fù)合脅迫分組， 并設(shè)置了對照組(CK)。 施加脅迫水平及分組如表1所示。

1.3 信息采集與處理

使用美國Analytical Spectral Devices公司的HH2型地物光譜儀對小麥葉片樣本進行測量， 并采集高光譜數(shù)據(jù)。 測量點分別位于每株小麥葉片樣本的上、 中、 下部， 每點重復(fù)測量10次取平均值。 將葉片樣本采集并充分勻漿， 加入提取液混合后置于90 ℃恒溫水浴鍋中浸提30 min。 取出后冷卻， 于5 000 r、 25 ℃離心10 min， 除上清液。 重復(fù)離心后加入1 mL提取液， 置于90 ℃恒溫水浴鍋中水解1 h。 取出冷卻后， 于8 000 r、 25 ℃離心15 min， 取上清液。 分光光度計調(diào)至530 nm， 用蒸餾水調(diào)零。 最后， 使用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒測定果膠含量。 小麥葉片果膠及高光譜數(shù)據(jù)的處理利用Origin2018， SPSS.26， Matlab R2018a， ViewSpecPro， AvaSoft7.2， TQ Analyst等軟件。

表1 鹽及物理損傷脅迫實驗設(shè)計

2 結(jié)果與討論

2.1 不同脅迫條件下小麥葉片果膠含量和高光譜特征

2.1.1 葉片果膠含量

依據(jù)設(shè)計的方案進行了為期一周的脅迫實驗， 單因素和復(fù)合因素脅迫下小麥葉片果膠含量的變化情況如圖1所示。 其中， A1S1和A1S2組果膠含量均呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢。 脅迫初期， 由于細胞基質(zhì)多糖間相互作用增強， 機體通過增加纖維素含量而降低果膠含量來抵御逆境傷害[13]， 小麥葉片細胞壁中層和初生壁中果膠含量均下降。 隨后， 含有抗逆基因的調(diào)控蛋白和擴展蛋白發(fā)揮作用， 通過增加果膠含量來加強細胞間的結(jié)合。 在A3S1和A3S2組中， 葉片細胞形態(tài)遭到嚴重破壞， 果膠甲酯酶活性降低， 細胞壁嚴重甲酯化， 離子進入細胞內(nèi)使大量細胞死亡[14]， 最終導(dǎo)致果膠含量迅速下降。 圖2為不同脅迫因素對應(yīng)的小麥果膠含量七天的平均值。 從圖中可以看出， 經(jīng)過脅迫處理組小麥葉片的果膠含量均值明顯低于對照組， 而且果膠含量均值與脅迫程度呈負相關(guān)。 此外， 經(jīng)差異性分析后可知， A1， A3， S2， A2S1， A2S2， A3S1， A3S2與CK差異顯著(p<0.05)。

圖1 一周內(nèi)不同脅迫因素下小麥葉片果膠含量變化

圖2 不同脅迫因素對應(yīng)的小麥葉片果膠含量七天的平均值

2.1.2 高光譜特征

利用光譜儀獲取了不同脅迫條件下， 325～1 075 nm波段范圍內(nèi)小麥葉片的高光譜特征。 光譜始末兩端冗余噪聲較多、 光譜信息波動較大， 而500～800 nm波段內(nèi)噪聲低、 光譜信息穩(wěn)定， 且在750～800 nm波段形成反射平臺， 故選取500～800 nm波段作為研究對象。 在500～800 nm波段內(nèi)， 單因素和復(fù)合因素脅迫條件下小麥葉片反射光譜如圖3(a)和(b)所示。 從圖中可以看出， 不同脅迫條件下， 波峰(550 nm)和反射平臺(750～800 nm)處的光譜特征(反射率)均呈現(xiàn)出明顯差異, 并表現(xiàn)出一定的規(guī)律。 其中， 在單因素脅迫條件下， 550 nm波峰處， A1組和S1組表現(xiàn)出較高的反射率水平， A2組、 S2組與CK組的反射率水平居中， A3組的反射率最低。 在復(fù)合脅迫條件下， 750～800 nm反射平臺內(nèi)， 當物理損傷處于S1水平時， 反射率表現(xiàn)出的變化為A1S1>A2S1>A3S1。 當物理損傷處于S2水平時， 反射率的變化為A1S2>A2S2>A3S2。 即物理損傷水平一定時， 反射率與鹽脅迫程度呈負相關(guān)。 因此， 高光譜曲線特征可以在一定程度上反映小麥受脅迫程度， 但難以表征果膠含量的變化規(guī)律， 因此需要建立高光譜特征與果膠含量之間的聯(lián)系。

圖3 不同脅迫因素下小麥葉片的高光譜特征

2.2 基于高光譜技術(shù)的果膠含量預(yù)測

2.2.1 特征波段提取

利用相關(guān)系數(shù)法對不同脅迫條件下測得的高光譜數(shù)據(jù)與小麥葉片果膠含量進行相關(guān)性分析， 二者的相關(guān)系數(shù)隨波長的變化關(guān)系如圖4(a)所示。 從圖中可知， 光譜數(shù)據(jù)在特定波段與果膠含量具有較好的相關(guān)性。 選取相關(guān)系數(shù)大于0.32的部分， 即702～728 nm波段為原始光譜特征波段， 記為W702～728。 與此同時， 對一階導(dǎo)數(shù)光譜與葉片果膠含量進行了相關(guān)性分析， 如圖4(b)所示。 選取相關(guān)系數(shù)大于0.45的部分， 即690～700 nm波段為一階導(dǎo)數(shù)光譜的特征波段， 記為W690～700。

圖4 相關(guān)系數(shù)法提取特征波長

2.2.2 果膠含量預(yù)測模型

共采集小麥葉片樣本145個， 剔除25個異常樣本后按1∶3合理劃分， 分別為訓(xùn)練集樣本90個， 驗證集樣本30個。 以光譜敏感波段作為模型輸入量， 選取主成分回歸(PCR)、 偏最小二乘法(PLS)、 逐步多元線性回歸(SMLR)三種建模方法， 并將其與多元散射校正(MSC)、 標準正態(tài)變換(SNV)、 一階導(dǎo)數(shù)(FD)、 卷積平滑(S-G)、 Norris導(dǎo)數(shù)濾波(NDF)[15]等五種預(yù)處理技術(shù)相結(jié)合， 共建立27種預(yù)測模型， 如表2所示。

表2 不同建模方法及預(yù)處理技術(shù)得到的預(yù)測模型

表2中，Rc和Rp分別為評價模型質(zhì)量的訓(xùn)練集相關(guān)系數(shù)和驗證集相關(guān)系數(shù)。 對比各模型的參數(shù)可知， 基于PLS+SNV+FD+NDF方法所建的模型為最優(yōu)模型，Rc和Rp值分別達到了0.978 2和0.981 4。

2.2.3 最優(yōu)模型性能分析

圖5(a)為不同脅迫條件下， 最優(yōu)模型的果膠預(yù)測含量與試劑盒測得的果膠含量之間的關(guān)系。 果膠含量的預(yù)測值與實測值一致性較高(擬合系數(shù)R2=0.997 6)， 均方根誤差(RMSE)為0.35， 表明所建模型具有良好的線性預(yù)測性能。 為了評估上述最優(yōu)模型的精密度， 對A1S2脅迫條件下、 同一小麥葉片樣本進行了多次高光譜測量。 圖5(b)為20次測量的模型預(yù)測結(jié)果。 從圖中可以看出， 預(yù)測結(jié)果重復(fù)性較好， RSD為1.2%(預(yù)測均值VM=9.56 μmol·g-1)， 說明該模型具有較高的精度。

圖5 (a) 最優(yōu)模型的果膠預(yù)測含量與試劑盒測得的果膠含量之間的關(guān)系; (b) 果膠預(yù)測模型的精密度評估

3 結(jié) 論

建立了基于高光譜技術(shù)的小麥鹽及物理損傷脅迫下果膠反演模型。 分析了單因素和復(fù)合因素脅迫下小麥葉片果膠含量以及對應(yīng)高光譜特征的變化規(guī)律。 針對果膠和高光譜數(shù)據(jù)， 首先采用相關(guān)系數(shù)法篩選特征波段， 然后分別將PCR， PLS和SMLR三種建模方法與MSC， SNV， FD， S-G和NDF五種預(yù)處理技術(shù)相結(jié)合， 最后得出基于PLS+SNV+FD+NDF方法所建的模型為最優(yōu)模型。 該最優(yōu)模型的Rc和Rp值分別達到0.978 2和0.981 4。 不同脅迫條件下的模型預(yù)測實驗可知， 果膠含量的預(yù)測值與實測值一致性較高(擬合系數(shù)R2=0.997 6)， 均方根誤差(RMSE)為0.35， 表明所建模型具有良好的線性預(yù)測性能。 模型精密度實驗可得， 預(yù)測結(jié)果重復(fù)性較好， RSD為1.2%(預(yù)測均值VM=9.56 μmol·g-1)， 說明該模型具有較高的精度。 與質(zhì)量法、 比色法、 液相色譜法等傳統(tǒng)果膠檢測方法相比， 基于高光譜技術(shù)的反演模型方法實現(xiàn)了鹽及物理損傷脅迫下果膠的高精度、 快速、 無損檢測， 可用于作物響應(yīng)逆境脅迫機理的研究， 并為大田作物脅迫預(yù)警及種植環(huán)境的精準管控提供科學(xué)參考。