李俊猛， 翟雪東， 楊子涵， 趙艷茹, 2, 3， 余克強(qiáng), 2, 3*

1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)機(jī)械與電子工程學(xué)院， 陜西 楊凌 712100 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)物聯(lián)網(wǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 楊凌 712100 3. 陜西省農(nóng)業(yè)信息感知與智能服務(wù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 楊凌 712100

引 言

重金屬污染對(duì)生態(tài)環(huán)境危害已引起廣泛關(guān)注[1]。 其中， 銅是最常見的重金屬污染元素， 也是最容易積累且不易降解的污染元素。 重金屬銅元素會(huì)破壞農(nóng)作物的組織結(jié)構(gòu)， 然而其內(nèi)部結(jié)構(gòu)人眼無法看見， 并且根系是重金屬脅迫農(nóng)作物的直接對(duì)象， 易被植物根部吸收。 過量的銅離子一旦進(jìn)入根細(xì)胞， 會(huì)改變代謝物水平， 進(jìn)而影響農(nóng)作物產(chǎn)量[2]。 因此亟須尋找一種對(duì)農(nóng)作物體內(nèi)重金屬快速、 準(zhǔn)確的檢測(cè)方法， 有利于探明農(nóng)作物的重金屬逆境脅迫響應(yīng)機(jī)制。

重金屬物質(zhì)的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要是借助化學(xué)分析法來完成的， 如電化學(xué)方法和原子光譜法等[3]， 這些方法雖然檢測(cè)靈敏度高， 但也存在所用化學(xué)試劑易形成二次污染， 難以大批量快速檢測(cè)等缺點(diǎn)。 拉曼光譜技術(shù)通常具有更高的選擇性， 提供了更窄的光譜帶， 能夠提供豐富和高分辨率的化學(xué)信息[4]。 目前， 一些學(xué)者采用拉曼光譜技術(shù)進(jìn)行農(nóng)作物中重金屬含量的檢測(cè)。 王海陽(yáng)等[5]基于拉曼光譜技術(shù)評(píng)估香根草根內(nèi)部鉛離子的含量， 其檢測(cè)模型的預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)高于0.85， 其誤差小于5.7%， 結(jié)果表明拉曼光譜技術(shù)可用于測(cè)定植物根部重金屬的含量。 Tomas等[6]利用拉曼光譜技術(shù)比較了四種植物金屬硫蛋白亞型， 表達(dá)其鋅團(tuán)簇和蛋白質(zhì)構(gòu)象的見解， 并做進(jìn)一步分析得出， 拉曼光譜技術(shù)可以分析植物體內(nèi)的金屬鹽和絡(luò)合物。 Barimah等[7]提出一種無標(biāo)記的氧化亞銅/銀(Cu2O/Ag)表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)納米探針來檢測(cè)茶中的總砷含量， 開發(fā)的Cu2O/Ag耦合化學(xué)計(jì)量學(xué)SERS方法可用于有效地確定、 量化和預(yù)測(cè)茶葉中的砷含量。 雖然運(yùn)用拉曼光譜技術(shù)監(jiān)測(cè)重金屬脅迫下農(nóng)作物的響應(yīng)已有一定成果， 但對(duì)于重金屬脅迫下蘋果砧木根系微觀診斷尚需要深入研究。

蘋果砧木是蘋果樹生長(zhǎng)(或改良)的基礎(chǔ)， 對(duì)控制樹體生長(zhǎng)勢(shì)、 增強(qiáng)蘋果樹抗逆性及抗病能力、 擴(kuò)大果樹品種適應(yīng)范圍都具有重要意義。 本研究利用拉曼光譜技術(shù)進(jìn)行蘋果砧木根系Cu2+的脅迫檢測(cè)， 可對(duì)蘋果砧木根系進(jìn)行精準(zhǔn)有效的治理提供方法依據(jù)， 進(jìn)而提高蘋果樹幼苗的抗逆性以及幼苗存活率， 而且對(duì)農(nóng)作物在重金屬污染評(píng)價(jià)和作物對(duì)重金屬脅迫的應(yīng)答機(jī)制方面研究有重要指導(dǎo)意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣本

實(shí)驗(yàn)所采用的蘋果砧木為“八棱海棠”(Malus×robusta(Carrire) Rehder)。 其具有與果樹嫁接親和力強(qiáng)， 對(duì)低平原、 濱海和內(nèi)陸鹽堿地區(qū)有較強(qiáng)的適應(yīng)能力等特性， 是一種優(yōu)良的蘋果砧木， 廣泛用于蘋果樹的嫁接。 八棱海棠播種于2020年11月底， 為防止重金屬的污染， 均在不含重金屬的有機(jī)質(zhì)土壤中進(jìn)行育苗。 在土壤中加入重金屬難免會(huì)由于攪拌不均等因素造成實(shí)驗(yàn)誤差， 然而水培方法具有濃度均勻， 植物吸收快速， 條件單一等優(yōu)勢(shì)。 因此本實(shí)驗(yàn)采用水培方法進(jìn)行試驗(yàn)。 2021年4月30日， 將蘋果砧木幼苗在清水里培育2周后進(jìn)行重金屬銅的脅迫實(shí)驗(yàn)， 在營(yíng)養(yǎng)液中分別添加銅離子(Cu2+)含量為0， 6， 12， 18和24 mg·L-1的CuSO4·5H2O溶液， 每個(gè)梯度有6株幼苗， 共30株蘋果砧木進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)。 2021年5月13日將處理過的蘋果砧木置于晝夜溫度均為23 ℃、 相對(duì)濕度85%的植物培養(yǎng)箱中進(jìn)行培育7 d， 7 d之后觀察各個(gè)濃度脅迫下的蘋果砧木并無明顯差異。

1.2 拉曼光譜數(shù)據(jù)采集

將不同銅離子濃度脅迫的蘋果砧木根系用振動(dòng)切片機(jī)(ZQP-86， 上海之信儀器有限公司， 中國(guó))沿橫截面進(jìn)行切片， 將切好的樣本組織置于載玻片上以備拉曼光譜的采集。 拉曼光譜儀使用Thermo ScientificTMDXRTM3xi顯微拉曼光譜儀(DXR 3xi， 賽默飛世爾科技， 美國(guó))， 激光器選用波長(zhǎng)為532 nm的固體激光器、 顯微鏡放大倍率10倍， 光譜儀具體參數(shù)和拉曼數(shù)據(jù)采集相關(guān)參數(shù)如表1所示。 將攜有樣本的載玻片置于載物臺(tái)， 聚焦并找到中心位置， 然后完成蘋果砧木根系的拉曼光譜數(shù)據(jù)采集。 對(duì)每個(gè)樣品分別進(jìn)行光譜測(cè)試， 每類樣本蘋果砧木植株共6株， 每個(gè)橫截面積采集5條拉曼光譜， 共采集30組拉曼光譜， 5類樣本共獲得150條拉曼光譜曲線。

表1 蘋果砧木根系采集拉曼光譜儀主要參數(shù)

1.3 蘋果砧木根系拉曼光譜圖像采集

通過對(duì)蘋果砧木根系橫截面區(qū)域掃描， 進(jìn)行重金屬脅迫后根系橫截面組織組成和結(jié)構(gòu)的變化研究。 圖1是蘋果砧木根系橫截面在放大倍率10倍下的白光圖， 共掃描1 015個(gè)點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)特征指紋峰進(jìn)行蘋果砧木根系組織處單波段處的偽彩圖成像， 進(jìn)而研究重金屬銅對(duì)蘋果砧木根系的影響。

圖1 蘋果砧木根系顯微截面圖

1.4 蘋果砧木根系拉曼光譜數(shù)據(jù)處理方法

采集蘋果砧木根系拉曼光譜數(shù)據(jù)時(shí)會(huì)受到外界噪聲， 光線以及熒光背景信息的干擾， 影響拉曼光譜質(zhì)量， 因此在進(jìn)行拉曼光譜分析時(shí)需要對(duì)獲得的原始拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。 S-G平滑是一種較為簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)處理方法， 通過平滑處理能夠有效地處理白噪聲， 處理在光譜測(cè)量中的一些由光學(xué)因素產(chǎn)生的影響[8]。 自適應(yīng)迭代重加權(quán)懲罰最小二乘法(adaptive iterative reweighting partial least squares， Air-PLS)是基于PLS方法不斷優(yōu)化的一種數(shù)據(jù)處理的方法， 自動(dòng)消除部分無用拉曼光譜峰并保留基線部分， 同時(shí)完成基線校正[9]， 用此方法來扣除光譜的熒光等背景信號(hào)。

偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis， PLS-DA)是一種被廣泛運(yùn)用的多元數(shù)據(jù)判別方法[10]， 可以應(yīng)用于光譜化學(xué)分析中的類型判別和模式識(shí)別等方面。 PLS-DA計(jì)算過程是先對(duì)訓(xùn)練集進(jìn)行建模， 之后對(duì)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)， 通過對(duì)比實(shí)際值與預(yù)測(cè)值可以得到模型的準(zhǔn)確率并能夠有效地解決多變量之間相關(guān)性的復(fù)雜問題[11]。 支持向量機(jī)(support vector machine， SVM)是被人們廣泛應(yīng)用的并且具有神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)所不具有的易收斂、 穩(wěn)定性較好等優(yōu)點(diǎn)的一種建模方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘋果砧木根系樣本拉曼光譜特征分析

圖2 拉曼光譜平均曲線圖

圖3(a)是濃度為0, 6, 12, 18和24 mg·L-1的CuSO4·5H2O脅迫蘋果砧木樣品所獲取的各個(gè)濃度下30組拉曼光譜的平均光譜圖。 圖3(b)是經(jīng)過先Air-PLS基線校正處理， 再經(jīng)過S-G平滑處理后的五種濃度脅迫下樣本的平均拉曼光譜圖。 圖3(b)相較于圖3(a)消除光譜的熒光等背景信號(hào)， 同時(shí)完成基線校正。 從圖3中可以看出隨著重金屬脅迫濃度的升高， 部分拉曼信號(hào)強(qiáng)度增加， 但是也有些隨脅迫濃度的增加而降低， 這可能是由于植物體內(nèi)物質(zhì)受脅迫的特性的關(guān)系。

圖3 (a)平均拉曼光譜圖； (b)預(yù)處理后的平均拉曼光譜圖

圖4表示五種濃度下1 096， 1 329， 1 605和2 937 cm-1波段的拉曼信號(hào)強(qiáng)度值。 植物體內(nèi)重金屬亞細(xì)胞的分布對(duì)重金屬的積累， 遷移和解毒至關(guān)重要[15-16]。 細(xì)胞壁作為阻止重金屬Cu進(jìn)入細(xì)胞的第一道屏障， 由纖維素， 半纖維素， 果膠和蛋白質(zhì)組成， 能夠絡(luò)合重金屬， 減少重金屬向細(xì)胞運(yùn)輸[17]。 其中在重金屬銅少量時(shí)， 對(duì)蘋果砧木生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用， 過量時(shí)對(duì)植物產(chǎn)生毒害。 從圖4中得出四種波段下隨著重金屬脅迫濃度的增加拉曼光譜峰強(qiáng)度呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)， 結(jié)合拉曼指紋峰特性可以得出隨著濃度的增加植物體內(nèi)纖維素、 木質(zhì)素的含量也隨之增加但是當(dāng)濃度超過18 mg·L-1， 可能此時(shí)銅脅迫會(huì)對(duì)蘋果砧木產(chǎn)生毒害作用， 此時(shí)纖維素、 木質(zhì)素的含量也隨著降低。 通過掃描重金屬脅迫下蘋果砧木根系以單波段1 096， 1 329， 1 605和2 937 cm-1拉曼峰成像所得到的偽彩色圖像如圖5所示， 圖中不同的顏色表示拉曼光譜信號(hào)的強(qiáng)度。

圖4 四種波段下拉曼信號(hào)強(qiáng)度圖

圖5 蘋果砧木根系組織處的單波段拉曼峰成像

圖5在相同測(cè)量條件下， 不同濃度脅迫和不同波段下的拉曼光譜成像可視化圖。 對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)相同濃度脅迫不同波數(shù)的偽彩圖差異不大， 但是不同濃度脅迫下相同波數(shù)的偽彩圖差異較大。 濃度為0， 6， 12和18 mg·L-1的拉曼光譜成像可視化圖基本符合圖4中的結(jié)果。 然而在24 mg·L-1脅迫濃度下出現(xiàn)異常， 影響拉曼光譜成像的因素有很多， 造成結(jié)果可能與在做切片時(shí)其根系的粗細(xì)不同且我們切片時(shí)的橫截面厚度較厚和不統(tǒng)一有關(guān)， 也可能受到光照的因素影響拉曼光譜技術(shù)的成像功能。 可見， 化學(xué)成像的可視化表達(dá)為拉曼光譜在重金屬脅迫檢測(cè)中提供了新的研究方向。

2.2 蘋果砧木根系中Cu2+含量判別模型的建立和對(duì)比分析

2.2.1 PLS-DA模型結(jié)果與分析

在進(jìn)行光譜預(yù)處理后， 用全部光譜進(jìn)行建模， 相比與拉曼光譜成像可視化表達(dá)， 建立數(shù)學(xué)模型可將實(shí)際問題簡(jiǎn)單化， 節(jié)省判別時(shí)間。 對(duì)快速檢測(cè)蘋果砧木根系是否受到重金屬銅脅迫具有重要意義。 運(yùn)用樣本分類kennard-stone(K-S)算法對(duì)150組樣本數(shù)據(jù)挑選進(jìn)入訓(xùn)練集， 從訓(xùn)練集中挑選100組數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA建模， 再挑選50組進(jìn)行預(yù)測(cè)處理。 運(yùn)用Matlab R2018b(The Math Works, Natick, MA, USA)平臺(tái)進(jìn)行建模分析， PLS-DA模型判別結(jié)果如表2所示。 從表2中可以看出， PLS-DA模型準(zhǔn)確率為96%(48/50)， 能夠較好的判別出蘋果砧木是否受到脅迫。

表2 PLS-DA判別結(jié)果混淆矩陣

圖6 (a)SVM尋優(yōu)參數(shù)； (b)SVM模型

2.2.2 SVM模型結(jié)果與分析

使用SVM方法對(duì)全部光譜進(jìn)行建模， 可以得到SVM最佳懲罰系數(shù)c=5.278，g=0.003 906 3如圖6(a)所示。 首先運(yùn)用K-means算法對(duì)每類樣本的30組數(shù)據(jù)依次進(jìn)行訓(xùn)練， 隨機(jī)選取20組進(jìn)行建模， 剩余的10組進(jìn)行預(yù)測(cè)。 建立的SVM模型圖如圖6(b)所示， 從實(shí)際和預(yù)測(cè)結(jié)果來看模型的準(zhǔn)確率為100%， 模型效果較好。 這一結(jié)果也驗(yàn)證了使用顯微拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)蘋果砧木是否受到重金屬脅迫具有可行性。

3 結(jié) 論

利用拉曼光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法， 對(duì)不同濃度重金屬銅離子脅迫下蘋果砧木根系進(jìn)行了判別分析研究。 主要有以下結(jié)論： (1)通過四個(gè)特征峰1 096， 1 329， 1 605和2 937 cm-1進(jìn)行單波段的拉曼光譜成像， 可得出在同一濃度下拉曼波數(shù)與拉曼信號(hào)強(qiáng)度成正相關(guān)， 而且同一波段下隨著脅迫濃度的增加拉曼信號(hào)呈先增后減的趨勢(shì)。 另外， 對(duì)圖像進(jìn)行可視化表達(dá)之后， 可以清晰地看出不同濃度脅迫拉曼成像有著一定的差距； (2)建立的PLS-DA模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為96%， SVM模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率達(dá)到100%， 因此， 兩類模型都具有優(yōu)越性， 能夠較好的預(yù)測(cè)出蘋果砧木根系是否受到脅迫， 為研究重金屬脅迫農(nóng)作物及其產(chǎn)品提供了新的技術(shù)思路。 在今后的研究中， 需要進(jìn)行根系中重金屬銅含量的定量檢測(cè)， 進(jìn)一步擴(kuò)大樣本范圍和重金屬濃度梯度以確定該模型的穩(wěn)定性和適用性。