李 俊，陳蓓蓓，謝婷婷，何 偉，龔會琴，廖朝選▲

(1貴州省檢測技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州 貴陽 550002；2貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽 550014)

農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的作用，可控制病蟲害的發(fā)生并減少損失，保證農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)與產(chǎn)量，其對人類經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展意義重大。但由于農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的長期使用，對生態(tài)環(huán)境的安全和人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。唑蟲酰胺(Tolfnpyrad)是原日本三菱化學(xué)公司開發(fā)的新型吡唑雜環(huán)類殺蟲殺螨劑[1]，毒性中等，具有觸殺作用，并兼具殺卵、抑食、抑制產(chǎn)卵作用，殺蟲譜廣，對鱗翅目、半翅目、鞘翅目、膜翅目、雙翅目、纓翅目害蟲及螨類均有效，尤其是對鱗翅目小菜蛾、纓翅目薊馬等害蟲有特效[2-4]。由于該藥具有較好的速效性，持效期長，在蔬菜生產(chǎn)中被廣泛使用。但是唑蟲酰胺的多次、超劑量使用，會隨地下水或土壤徑流等進(jìn)入河流、湖泊等水體，對水生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成威脅。

斑馬魚作為典型的水生試驗動物模型，其基因與人類具有80%以上的高度同源性[5]。大型溞是一種常見的水生生物，主要以藻類為食，是魚類和無脊椎動物的餌料，是水生態(tài)系統(tǒng)中能量流動和物質(zhì)循環(huán)的重要環(huán)節(jié)[6]。羊角月牙藻是眾多藻類中常見的一種，是水生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者，藻類是水生食物鏈的基礎(chǔ)，其種類的多樣性和初級生產(chǎn)量直接影響水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[7]。斑馬魚、大型溞和羊角月牙藻分別位于水生態(tài)系統(tǒng)中不同營養(yǎng)級，具有易獲取、成本低廉、個體小、繁殖快且對毒物敏感的特點，常被用于農(nóng)藥和化學(xué)品等環(huán)境污染物的的毒性測試，用以評價水生態(tài)系統(tǒng)的暴露風(fēng)險[8]。

有研究報道，15%唑蟲酰胺懸浮劑在田間推薦用藥量下對七星瓢蟲和螟黃赤眼蜂有致死或毒性效應(yīng)，在農(nóng)田內(nèi)施用對非靶標(biāo)節(jié)肢動物的危害商值HQin>5，風(fēng)險不可接受[9]。由此可知，唑蟲酰胺對環(huán)境生物有害，對生態(tài)系統(tǒng)具有一定威脅。目前，對于水生態(tài)系統(tǒng)中魚類、溞類和藻類的毒性研究較少，缺少相關(guān)數(shù)據(jù)開展風(fēng)險評估。本研究以斑馬魚、大型溞、羊角月牙藻為試驗生物，分別探究了30%唑蟲酰胺懸浮劑對三種水生生物的毒性效應(yīng)，結(jié)合農(nóng)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行等級劃分，為30%唑蟲酰胺懸浮劑安全使用和風(fēng)險評價提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

溶解氧測試儀：美國哈希公司，HQ-25d；智能人工氣候培養(yǎng)箱：上海比郎儀器制造有限公司，PRX-250B；照度計：柯尼卡美能達(dá)(中國)投資有限公司，T-10A；藻類智能鑒定計數(shù)儀，杭州迅數(shù)科技有限公司，E100。

1.2 試驗生物

斑馬魚：購自于上海宏業(yè)觀賞魚養(yǎng)殖場，2～3月齡，體長19～23 mm，體重0.13～0.19 g。試驗開始前在溫度為21～25 ℃、pH為6.0～8.5、溶解氧>80% ASV(空氣飽和值)的條件下馴養(yǎng)7天。

大型溞：購自于武漢可樂多生物科技有限公司，由本實驗室自行繁殖，以純種小球藻喂養(yǎng)，于溫度20 ℃±2 ℃、光暗比為16∶8、光照強(qiáng)度1000～1500 lux條件下培養(yǎng)，選取溞齡小于24 h的非頭胎溞進(jìn)行試驗。

羊角月牙藻：購自于中國科學(xué)院淡水藻種庫，由本實驗室培養(yǎng)，于溫度為21～24 ℃、光照強(qiáng)度為4440～8880 Lux的條件下培養(yǎng)，選擇處于對數(shù)生長期、生長良好的藻類進(jìn)行試驗。

1.3 試驗方法

1.3.1 魚類急性毒性試驗

本試驗參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全性評價試驗準(zhǔn)則》第12部分：魚類急性毒性試驗[10]的規(guī)定進(jìn)行，采用靜態(tài)法進(jìn)行試驗，每個濃度組放入10尾斑馬魚，試驗液體積為3 L，每個濃度組設(shè)1個平行對照組，同時設(shè)空白對照組，試驗周期為96 h。每24 h觀察并記錄一次供試魚的中毒癥狀和統(tǒng)計魚的死亡率；每24 h測定一次試驗液的溫度、溶解氧含量、pH值。

1.3.2 溞類急性活動抑制試驗

本試驗參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全性評價試驗準(zhǔn)則》第13部分：溞類急性活動抑制試驗[11]的規(guī)定進(jìn)行，采用靜態(tài)法進(jìn)行試驗，每個濃度組放入5只溞齡小于24 h的非頭胎溞，試驗液體積為50 mL，每個處理組同時設(shè)置4個平行對照組，同時設(shè)空白對照組，試驗周期為48 h。試驗開始后，每24 h觀察并記錄一次大型溞的中毒癥狀和統(tǒng)計分析溞的抑制率；分別于0 h和48 h記錄試驗溶液的溫度、溶解氧含量、pH值。

1.3.3 藻類生長抑制試驗

本試驗參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全性評價試驗準(zhǔn)則》第14部分：藻類生長抑制試驗[12]的規(guī)定進(jìn)行，用處于對數(shù)生長期的藻溶液配制試驗液，采用靜態(tài)法進(jìn)行試驗，每個濃度組的試驗液體積為100 mL，同時設(shè)置3個平行對照組和1個空白對照組，試驗周期為72 h。試驗開始后，每24 h觀察每個濃度組中藻的生長情況，并統(tǒng)計分析藻的生長抑制率；分別于0 h和72 h記錄試驗溶液的pH值和光照強(qiáng)度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)試驗統(tǒng)計的毒性測試結(jié)果，使用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總，采用SPSS 19.0軟件中的Probit(概率單位法)對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，然后分別計算30%唑蟲酰胺懸浮劑對斑馬魚的96 h半數(shù)致死濃度LC50、大型溞的48 h半數(shù)抑制效應(yīng)濃度EC50、羊角月牙藻的72 h半數(shù)抑制效應(yīng)濃度ErC50、EyC50、95%置信區(qū)間及回歸方程。

1.5 毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》進(jìn)行毒性等級劃分，毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Toxicity classification standard

2 結(jié)果與分析

2.1 參比物試驗

為了評估受試生物對毒性的敏感性是否符合試驗要求，試驗前用重鉻酸鉀對斑馬魚、大型溞、羊角月牙藻進(jìn)行參比試驗。結(jié)果表明：重鉻酸鉀對斑馬魚的24 h-LC50為223 mg/L，95%置信限為202～243 mg/L，重鉻酸鉀對斑馬魚的24 h-LC50在200～400 mg/L范圍內(nèi)，符合質(zhì)量控制要求；重鉻酸鉀對大型溞的24 h-EC50為1.08 mg/L，95%置信限為0.97～1.21 mg/L，重鉻酸鉀對大型溞的24 h-LC50在0.6～2.1 mg/L范圍內(nèi)，符合質(zhì)量控制要求；重鉻酸鉀對羊角月牙藻的72 h-ErC50為1.1 mg/L，95%置信限為0.7～1.6 mg/L，符合質(zhì)量控制要求。

2.2 毒性效應(yīng)

在30%唑蟲酰胺懸浮劑暴露下，斑馬魚出現(xiàn)抽搐、異?？焖儆蝿?、正面或側(cè)面平躺、死亡等中毒癥狀。由表2可知，在3.00～15.00 μg a.i./L的5個等比試驗濃度中，斑馬魚發(fā)生了不同程度的死亡，在96 h試驗周期內(nèi)累計死亡率分別為10%、40%、60%、90%、100%，其死亡率與試驗濃度呈正相關(guān)關(guān)系。

表2 魚類急性毒性試驗中斑馬魚的死亡率統(tǒng)計結(jié)果Tab.2 Mortality statistics of Barchydanio rerio in the acute toxicity test

在0.30～3.40 μg a.i./L的30%唑蟲酰胺懸浮劑影響下，大型溞發(fā)生游動緩慢、體色改變、死亡等中毒抑制癥狀，隨時間的推移，抑制效應(yīng)愈加明顯。從表3可知，在0.30 μg a.i./L、0.50 μg a.i./L、0.80 μg a.i./L、1.30 μg a.i./L、2.10 μg a.i./L、3.40 μg a.i./L濃度暴露的試驗溞，24 h的抑制率分別為0、10%、20%、25%、40%、70%，48 h的抑制率分別為5%、15%、25%、30%、65%、90%。

表3 溞類急性活動抑制試驗中大型溞的抑制率統(tǒng)計結(jié)果Tab.3 Inhibition rate of Daphnia magna in the acute activity inhibition test

羊角月牙藻暴露于0.030～7.20 μg a.i./L的30%唑蟲酰胺懸浮劑試驗液中，藻細(xì)胞會發(fā)生變形、變小、粘連式聚集的中毒癥狀，唑蟲酰胺對羊角月牙藻的藻細(xì)胞生長和生物量均有抑制作用。從表4可知，在72 h的暴露時間里，0.030 mg a.i./L、0.068 mg a.i./L、0.17 mg a.i./L、0.47 mg a.i./L、1.10 mg a.i./L、2.80 mg a.i./L和7.20 mg a.i./L濃度的30%唑蟲酰胺懸浮劑試驗液中，藻類生長抑制率分別為0.3%、8.5%、14.7%、16.5%、22.5%、63.7%和82.8%，而生物量增長的抑制率為1.7%、35.6%、53.5%、57.2%、66.9%、91.4%、97.2%。羊角月牙藻的生物量指標(biāo)相對藻類生長指標(biāo)對唑蟲酰胺更為敏感。

表4 藻類生長抑制試驗中羊角月牙藻的抑制率統(tǒng)計結(jié)果Tab.4 Inhibition rate of Pseudokirchneriella subcapitata in the growth inhibition test

2.3 50%致死/效應(yīng)濃度與毒性等級

將試驗測試濃度與試驗生物死亡率或抑制率進(jìn)行相關(guān)性分析，并用“1.4數(shù)據(jù)處理”相關(guān)方法進(jìn)行統(tǒng)計分析。由表5知，30%唑蟲酰胺懸浮劑對斑馬魚96 h的急性毒性LC50為0.0055 mg a.i./L，95%置信限為0.0048～0.0063 mg a.i./L；對大型溞48 h急性活動抑制效應(yīng)EC50為0.0015 mg a.i./L，95%置信限為0.0011～0.0021 mg a.i./L；對羊角月牙藻72 h的藻細(xì)胞生長抑制效應(yīng)ErC50=1.88 mg a.i./L，95%置信限為0.99～4.94 mg a.i./L；對藻生物量增長72 h的抑制效應(yīng)EyC50為0.26 mg a.i./L，95%置信限為0.11～0.54 mg a.i./L。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗導(dǎo)則》相關(guān)規(guī)定及劃分標(biāo)準(zhǔn)，30%唑蟲酰胺懸浮劑對斑馬魚、大型溞、羊角月牙藻的毒性等級分別為劇毒、劇毒、高毒。

表5 供試物30%唑蟲酰胺懸浮劑對3種水生生物的毒性結(jié)果分析Tab.5 Analysis of toxicity of 30% tolfenpyrad suspending agent on the three aquatic organisms

3 結(jié)論與討論

魚類、溞類和藻類作為水生脊椎動物、無脊椎動物和初級生產(chǎn)者的代表，其中對毒物敏感的物種常被用于水生毒理試驗。研究采用的試驗生物對重鉻酸鉀的敏感性測試結(jié)果分別為斑馬魚(24 h-LC50=223 mg a.i./L)、大型溞(24 h-EC50=1.08 mg a.i./L)和羊角月牙藻(72 h-ErC50為1.1 mg a.i./L)，表明研究使用生物對毒物敏感，符合試材規(guī)定。

研究結(jié)果顯示，30%唑蟲酰胺懸浮劑對斑馬魚、大型溞和羊角月牙藻會造成不同程度的抑制效應(yīng)或致死效應(yīng)，等級分別為劇毒、劇毒、高毒。表明唑蟲酰胺對水生生物具有很高的毒性，使用唑蟲酰胺產(chǎn)品后，不能直接在河流、湖泊等水體進(jìn)行包裝清洗，或剩余藥液直接傾倒入水。同時，在生態(tài)漁業(yè)生產(chǎn)的稻-魚、稻-蝦等環(huán)境中，不能使用唑蟲酰胺產(chǎn)品，以防造成漁業(yè)毒害。據(jù)中國農(nóng)藥信息網(wǎng)報道，唑蟲酰胺相關(guān)產(chǎn)品主要登記于茶樹、甘藍(lán)、柑橘樹、茄子、豇豆的害蟲防治，其不直接作用于水體，嚴(yán)格按規(guī)定用藥可能對水生態(tài)系統(tǒng)風(fēng)險有限，但具體風(fēng)險情況還需結(jié)合產(chǎn)品的性質(zhì)和行為開展風(fēng)險評估。