丁海麗 靳松林 李倫宇 閆丹丹 黃增浩 任在方 王瑞元

1 成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康研究所，運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院（成都610041）

2 黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院（哈爾濱150036）

3 中日友好醫(yī)院（北京100029）

4 北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院（北京100084）

人體長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)或承受不適應(yīng)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷可導(dǎo)致肌纖維超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，呈現(xiàn)出肌肉僵硬、肌力下降以及主觀感覺疼痛等癥狀和體征，稱為運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷（exercise-induced muscle damage，EIMD），進(jìn)而引起延遲性肌肉酸痛（delayed onset muscle soreness，DOMS）[1]。若不及時(shí)進(jìn)行干預(yù)，將影響肌肉工作能力、加劇損傷并影響運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)[1-3]。運(yùn)動(dòng)誘發(fā)骨骼肌損傷后可使與肌肉收縮密切相關(guān)的“鈣庫”——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白聚集以及鈣離子平衡紊亂，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），其發(fā)生與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩個(gè)重要功能酶Ca2+-ATP 酶（Ca2+-ATPase，SERCA）和蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）密切相關(guān)[4-6]。ERS可導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），上調(diào)UPR 靶蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein78，GRP78）、鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）等表達(dá)，從而代償輔助蛋白折疊，并可啟動(dòng)自噬途徑以平衡蛋白聚集與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹[7-8]。適度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬作為細(xì)胞防御機(jī)制之一，可以有效清除異?；蚶匣膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)片段以及易聚集蛋白，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)；過度激活則可能清除健康內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活其他細(xì)胞反應(yīng)，不利于骨骼肌乃至整個(gè)機(jī)體健康。研究證實(shí)，134 序列相似的家庭成員B（family with sequence similarity 134，member B，F(xiàn)AM134B）可能作為一種受體蛋白，介導(dǎo)了選擇性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬[9]。該過程通過選擇性錨定受損內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，促使異常內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎裂成片段與正常結(jié)構(gòu)脫離，并招募自噬蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）形成自噬體。然而，關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬與EIMD的關(guān)系如何目前鮮有研究。

EIMD 屬中醫(yī)勞損傷筋范疇?！鹅`樞-經(jīng)筋》記載：“治在燔針劫刺，以知為數(shù)，以痛為腧”[10]，奠定了針刺治療經(jīng)筋病的淵源。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)斜刺針法治療EIMD 效果顯著[11，12]，并可能與線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激自噬有關(guān)。近年來，我們?cè)趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與EIMD的作用機(jī)制方面進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能、結(jié)構(gòu)、鈣信號(hào)等[4-6]在內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑在EIMD 的恢復(fù)中作用顯著，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬這一亞細(xì)胞器水平的應(yīng)激相關(guān)機(jī)制尚不明確?；诖耍緦?shí)驗(yàn)旨在觀察針刺干預(yù)對(duì)EIMD 大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬蛋白的影響，以期進(jìn)一步揭示針刺改善運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷的分子機(jī)制，為傳統(tǒng)針刺療法在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用實(shí)踐提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

小動(dòng)物跑臺(tái)（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司，中國(guó)）、酶標(biāo)儀（BIO-RAD）、垂直電泳槽（北京凱元儀器設(shè)備廠）、透射電子顯微鏡（日本電子）、水平脫色搖床（北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心）。

BCA 蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所P0012s）、大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵（SERCA）ELISA 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所E02S0463）、大鼠蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）ELISA 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所E02P0078）、組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白提取試劑盒（BestBio BB-31454-1）；GRP78一抗（Abcam ab21685）、calreticulin 一抗（Abcam ab22683）、FAM134B 一抗（Abcam ab151755）、LC3B一抗（Abcam ab48394）。

1.2 研究對(duì)象與分組

健康雄性8周齡SD大鼠88只，SPF級(jí)，體重233.51 ± 11.07 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001，在北京體育大學(xué)科研中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)和訓(xùn)練。按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組（C 組）、模型組（E 組）和針刺干預(yù)組（EA組），E組和EA組根據(jù)運(yùn)動(dòng)及干預(yù)后不同取材時(shí)間點(diǎn)，又分為0 h、12 h、24 h、48 h、72 h 五個(gè)亞組，共11 個(gè)組別，每組8 只。大鼠自由飲食飲水，室內(nèi)溫度20℃～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h 明暗交替。實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置符合國(guó)家科學(xué)技術(shù)部2006 年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定，獲得北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 建立運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷大鼠模型

參照Armstrong 等[13]的運(yùn)動(dòng)誘發(fā)骨骼肌損傷方案，予E 組和EA 組大鼠以一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)建立EIMD 模型。使用小動(dòng)物電動(dòng)跑臺(tái)訓(xùn)練，先進(jìn)行3 天適應(yīng)性訓(xùn)練，第1 天跑臺(tái)坡度0°，速度16 m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間5 min；第2 天坡度0°，速度16 m/min，時(shí)間10 min；第3天休息。適應(yīng)性訓(xùn)練后開始正式實(shí)驗(yàn)，坡度-16°，速度16 m/min，時(shí)間90 min。

1.4 針刺干預(yù)方案

運(yùn)動(dòng)后即刻對(duì)針刺干預(yù)組施以“阿是穴-斜刺”。固定器固定并消毒大鼠雙后肢，用直徑0.25 mm 的無菌毫針［漢醫(yī)牌，津食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2009 第2270002號(hào)］，以斜刺進(jìn)針法，針與皮膚間的傾斜角約30°，沿大鼠小腿三頭肌的縱向從遠(yuǎn)端穿過肌腹，留針2 min。前期研究證實(shí)[14]，依據(jù)“以痛為腧”采用“阿是穴-斜刺”可有效治療EIMD。

1.5 樣本采集和指標(biāo)檢測(cè)

取材：按照各組對(duì)應(yīng)時(shí)相將大鼠稱重，腹腔注射10%水合氯醛（3.5 ml/kg 體重）麻醉，腹主動(dòng)脈取血并分離血清，迅速分離比目魚肌。冰冷生理鹽水漂洗，濾紙拭干，剔除結(jié)締組織。右側(cè)比目魚肌組織取2 mm×3 mm 組織塊投入2.5%戊二醛固定液，制備電鏡樣品，剩余組織剪碎后勻漿，待測(cè)ELISA 實(shí)驗(yàn)；左側(cè)比目魚肌組織組織置于液氮迅速冷凍后-80℃冰箱保存，待測(cè)Western Blot實(shí)驗(yàn)。

透射電鏡觀察肌纖維超微結(jié)構(gòu)：經(jīng)戊二醛固定，鋨酸再固定，丙酮溶液脫水，環(huán)氧樹脂Spurr 包埋后，制備超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色。采用H-600IV型透射電子顯微鏡觀察骨骼肌纖維超微結(jié)構(gòu)。

ELISA 法測(cè)定血清血清肌酸激酶（creatine kinase，CK）、骨骼肌型肌酸激酶（creatine kinase，muscle，CK-MM）和肌組織SERCA、PDI 含量：酶標(biāo)板空白孔中加入100 μL 樣品，空白對(duì)照加入100 μL 蒸餾水，各孔加入50 μL 酶標(biāo)記溶液，密封后37℃孵育1 h；洗滌并拍干，加顯色劑A、B 各50 μL，室溫避光10 min；加50 μL 終止液，置于酶標(biāo)儀30℃孵育2 h；在550 nm波長(zhǎng)處每隔1 min連續(xù)測(cè)定各孔光密度OD值。

Western Blot 法檢測(cè)肌組織GRP78、CRT、FAM134B、LC3 蛋白表達(dá)量：取比目魚肌于冰上研缽中剪碎、研磨，按1 mg∶10 μL 加入裂解液，14000 rpm、4℃離心10 min，取上清，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。配制12%分離膠，5%濃縮膠，上樣量20 μg/孔；濃縮膠恒壓90 V，約20 min，分離膠恒壓120 V。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色，封閉PVDF 膜。5%BSA-TBST 稀釋一抗（1∶1000），5%BSA-TBST 稀釋HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶10000）。膠片曝光，顯影，定影。分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肌纖維超微結(jié)構(gòu)變化

圖1 顯示，C 組肌節(jié)清晰，明、暗帶分界清楚，排列規(guī)則，Z 線整齊且兩側(cè)線粒體均勻分布。E 組0 h、12 h、24 h 和48 h 出現(xiàn)不同程度的Z 線加寬、斷裂，明、暗帶分界不清，線粒體腫脹并聚集在肌膜下，72 h有所緩解但未完全恢復(fù)。EA 組對(duì)應(yīng)時(shí)相比E 組明顯改善，72 h肌節(jié)結(jié)構(gòu)整齊，線粒體在肌膜兩側(cè)排列整齊。

圖1 各組大鼠肌纖維超微結(jié)構(gòu)圖（透射電鏡，×8000）

2.2 各組大鼠血清CK和CK-MM含量比較

血清CK 和CK-MM 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，不同干預(yù)和時(shí)相兩因素以及二者的交互作用顯著（P＜0.05），因此逐一分析各因素的單獨(dú)主效應(yīng)。由圖2 可知，與C 組比較，E 組CK 和CK-MM 在0 h 至48 h 均顯著升高（P＜0.05）；EA 組CK 在0 h、12 h、24 h 顯著升高（P＜0.05），48 h 和72 h 已無顯著差異，CK-MM 呈相似變化趨勢(shì)。與E 組對(duì)應(yīng)時(shí)相比較，EA 組CK 在0 h 至48 h 均顯著降低（P＜0.05），CK-MM 在0 h 和12 h 顯著降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠血清CK、CK-MM 含量比較（n=8）

2.3 各組大鼠肌組織SERCA和PDI含量比較

肌組織SERCA 和PDI 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，不同干預(yù)和時(shí)相兩因素以及二者的交互作用顯著（P＜0.05），因此逐一分析各因素的單獨(dú)主效應(yīng)。由圖3可知，與C組比較，E 組SERCA 在0 h 至48 h 均顯著降低（P＜0.05），而PDI含量在各時(shí)相均無顯著差異；EA 組SERCA 在0 h、12 h、24 h 顯著降低（P＜0.05），48 h 和72 h 已無顯著差異；PDI 在各時(shí)相均顯著升高（P＜0.05）。與E 對(duì)應(yīng)時(shí)相比較，EA 組SERCA 在48 h 和72 h 顯著升高（P＜0.05），而PDI在各時(shí)相均顯著升高（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠肌組織SERCA、PDI含量比較（n=8）

2.4 各組大鼠肌組織GRP78和CRT蛋白表達(dá)比較

肌組織GRP78 和CRT 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，不同干預(yù)和時(shí)相兩因素以及二者的交互作用顯著（P＜0.05），因此逐一分析各因素的單獨(dú)主效應(yīng)。由圖4可知，與C組比較，E 組GRP78 在運(yùn)動(dòng)后0 h 至72 h 均顯著升高（P＜0.05），CRT 在0 h 至48 h 顯著升高（P＜0.05）；EA 組GRP78和CRT僅0 h顯著升高（P＜0.05），其余時(shí)相則無顯著差異。與E 組對(duì)應(yīng)時(shí)相比較，EA 組GRP78 各時(shí)相均顯著降低（P＜0.05），CRT 在24 h 和48 h 顯著降低（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠肌肉GRP78、CRT蛋白表達(dá)比較（n=8）

2.5 各組大鼠肌組織FAM134B和LC3蛋白表達(dá)比較

肌組織FAM134B 和LC3II/I統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，不同干預(yù)和時(shí)相兩因素以及二者的交互作用顯著（P＜0.05），因此逐一分析各因素的單獨(dú)主效應(yīng)。由圖5可知，與C組比較，E 組FAM134B 和LC3Ⅱ/Ⅰ在0 h 至48 h 均顯著升高（P＜0.05）；EA 組FAM134B在0 h和12 h顯著升高（P＜0.05），其余無顯著差異；LC3Ⅱ/Ⅰ僅在0 h 顯著升高（P＜0.05），其余則無顯著差異。與E組對(duì)應(yīng)時(shí)相比較，EA 組FAM134B 在12 h、48 h 和72 h 顯著降低（P＜0.05），LC3Ⅱ/Ⅰ在12 h、24 h 和48 h 顯著降低（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠肌肉內(nèi)質(zhì)網(wǎng)FAM134B、LC3蛋白表達(dá)比較（n=8）

3 討論

3.1 針刺對(duì)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)大鼠骨骼肌損傷的改善效應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)采用“阿是穴-斜刺”干預(yù)大鼠運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷（exercise-induced muscle damage，EIMD），通過透射電鏡觀察和血清肌酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，針刺干預(yù)可以緩解肌纖維超微結(jié)構(gòu)改變，顯著下調(diào)運(yùn)動(dòng)后血清肌酸激酶CK 及同工酶CK-MM 水平，提示針刺可改善運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌損傷，促進(jìn)其修復(fù)進(jìn)程，與課題組前期研究結(jié)果相一致[5-6]；張安寧[15]、朱世鵬[16]等通過腓腸肌鈍挫傷模型，也證實(shí)了針刺阿是穴可有效促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)。

《靈樞-經(jīng)筋》首次提出“以痛為腧”，并記載了19首處方，標(biāo)志著經(jīng)筋病以痛為腧治法的形成。包括阿是穴在內(nèi)的經(jīng)筋病取穴方法，在緩解疼痛和改善運(yùn)動(dòng)功能等方面效果確切[17-20]。20 世紀(jì)70 年代中期，盧鼎厚先生在學(xué)習(xí)“阿是穴溫針”療法的基礎(chǔ)上，將“以痛為腧”進(jìn)一步發(fā)展提出“以勞損肌束為腧”，采用“阿是穴斜刺，不提針、捻針，留針3~5 min”的方案可有效治療肌肉運(yùn)動(dòng)損傷，緩解大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后延遲性肌肉酸痛癥狀，促進(jìn)骨骼肌機(jī)能恢復(fù)[20]。其后陸續(xù)有研究從細(xì)胞骨架、蛋白質(zhì)代謝、信號(hào)通路、細(xì)胞因子及線粒體等細(xì)胞器方面進(jìn)行了機(jī)制探討[5，6，12，21]。然而，參與收縮的重要細(xì)胞器內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)機(jī)制尚有待闡明。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，從介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬關(guān)鍵蛋白的角度探索針刺干預(yù)EIMD的機(jī)制。

3.2 針刺對(duì)EIMD大鼠骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的影響

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能包括Ca2+調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)折疊修飾及脂質(zhì)膽固醇合成等。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間的離心運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致肌漿網(wǎng)鈣釋放與回收能力下降，并可持續(xù)至運(yùn)動(dòng)后24~48 h[22]。劉陽等[5]認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)誘發(fā)骨骼肌損傷后可出現(xiàn)肌細(xì)胞內(nèi)的“鈣庫”——肌漿網(wǎng)膨大，Ca2+扮演著介導(dǎo)損傷和修復(fù)的關(guān)鍵角色，而針刺可能通過影響細(xì)胞鈣信號(hào)促進(jìn)損傷恢復(fù)。我們前期研究[4]也證實(shí)了運(yùn)動(dòng)后針刺可逐漸恢復(fù)[Ca2+]ER且有效調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度，初步探索了Ca2+調(diào)節(jié)機(jī)制與蛋白折疊的協(xié)同效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，針刺干預(yù)組Ca2+-ATP 酶（SERCA）含量在48 h 和72 h 時(shí)與模型組相比具有顯著性差異，結(jié)合其在運(yùn)動(dòng)即刻出現(xiàn)急劇降低至最低值的現(xiàn)象，提示一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后行針刺干預(yù)，骨骼肌SERCA 含量恢復(fù)在早期并沒有體現(xiàn)，表明SERCA 可能并未立即表現(xiàn)出針刺的直接靶點(diǎn)作用。

骨骼肌也具有分泌活性物質(zhì)的功能，可表達(dá)、合成和分泌多種生物信號(hào)分子，是一種極為重要的內(nèi)分泌器官[23]。分泌型蛋白前體需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)過翻譯、加工、修飾等過程，才能成為成熟的蛋白質(zhì)，肌肉中的分泌蛋白或者說肌肉因子于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)通過在分子內(nèi)或分子間形成二硫鍵，從而形成其天然構(gòu)象，蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）是催化這些二硫鍵形成和異構(gòu)化的重要功能酶[24]，其表達(dá)有助于蛋白質(zhì)正確折疊。本研究為了完整地對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，在分析鈣泵變化的同時(shí)，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中唯一的分子伴侶兼蛋白折疊酶PDI含量進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于針刺干預(yù)后SERCA 變化情況，PDI 的反應(yīng)更為及時(shí)和明顯，從而可有效應(yīng)對(duì)運(yùn)動(dòng)后骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的未折疊、錯(cuò)誤折疊蛋白聚集。一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后PDI 含量?jī)H在運(yùn)動(dòng)后即刻有所升高，而針刺干預(yù)后PDI 含量在各時(shí)相均顯著提升，可見大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后骨骼肌未能有效對(duì)抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損導(dǎo)致的蛋白折疊障礙，而針刺可緩解大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損情況。

3.3 針刺對(duì)EIMD 大鼠骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬蛋白的影響

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂時(shí)，未折疊、錯(cuò)誤折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以及鈣離子失衡從而導(dǎo)致ERS。適度ERS 可應(yīng)對(duì)細(xì)胞環(huán)境擾動(dòng)并恢復(fù)良好的蛋白折疊環(huán)境；過度ERS則引起細(xì)胞功能失調(diào)、自噬或凋亡。持續(xù)的ERS 和未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬是參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的主要方式之一，可以有效清除細(xì)胞中受損的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)片段和無效蛋白質(zhì)，但過度激活則可清除細(xì)胞內(nèi)健康內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或通過傳導(dǎo)信號(hào)激活其他細(xì)胞反應(yīng)，反而加劇機(jī)體病變[25-31]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、鈣網(wǎng)蛋白（CRT）定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)且為發(fā)生ERS 的重要標(biāo)志。本研究結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)后針刺干預(yù)可顯著下調(diào)GRP78 和CRT 表達(dá)，說明針刺可有效緩解EIMD 大鼠骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。CRT 作為Ca2+結(jié)合蛋白不僅可以感受鈣紊亂，還能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)幫助錯(cuò)誤折疊蛋白重新折疊并激活自噬途徑[32]。大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后即刻CRT急劇增加并有可能在應(yīng)對(duì)急性的錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白聚集以及鈣離子平衡紊亂過程中激活自噬途徑。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬可降解多余內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，能夠控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體積從而維持細(xì)胞穩(wěn)定。已有研究揭示了不同類型運(yùn)動(dòng)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系[33]，但有關(guān)運(yùn)動(dòng)后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)的后續(xù)效應(yīng)目前較少關(guān)注。134 序列相似的家庭成員B（FAM134B）家族基因與哺乳動(dòng)物肌肉的生理功能密切相關(guān)[30-31]。Khaminets[9]、Kurth[34]等的研究指出，F(xiàn)AM134B 的N 端具有LIR 結(jié)構(gòu)域，可與自噬蛋白微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（LC3）結(jié)合并相互作用，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬啟動(dòng)后，F(xiàn)AM134B錨定受損內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，幫助其碎裂成片段并與正常結(jié)構(gòu)脫離，隨即與LC3 相互作用，進(jìn)而被自噬膜包裹形成自噬體。FAM134B錨定的靶向部位是含KDEL序列的蛋白，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)。CRT是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的KDEL 家族成員，亦是骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要蛋白。因此，F(xiàn)AM134B 可能作為一種自噬受體蛋白，通過錨定CRT 后招募LC3，介導(dǎo)選擇性骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬。本實(shí)驗(yàn)中針刺顯著下調(diào)了FAM134B、LC3Ⅱ/Ⅰ及CRT表達(dá)，提示FAM134B可能是介導(dǎo)針刺調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬水平的靶點(diǎn)之一，但其確切作用途徑和分子機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

4 小結(jié)

本研究表明，針刺可以有效改善運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷，促進(jìn)其恢復(fù)進(jìn)程，相關(guān)作用機(jī)制可能與上調(diào)二硫鍵異構(gòu)酶PDI 輔助蛋白折疊，下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78 與CRT 表達(dá)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬蛋白FAM134B 與LC3表達(dá)，從而調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬水平有關(guān)。