闞延鵬， 張婷婷， 王 琪， 趙 璇， 林福清

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院麻醉科，上海 200072； 3. 上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與生理學(xué)系，上海 200025)

疼痛被列為第五大生命體征，受到越來(lái)越多的關(guān)注，消除患者的疼痛在臨床上也有了越來(lái)越高的呼聲和需求。2016年的一項(xiàng)研究顯示，每年美國(guó)因疼痛造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)六千多億美元，遠(yuǎn)超排名第2的心臟疾病[1]。疼痛對(duì)人們的生活造成了巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，所以對(duì)疼痛的基礎(chǔ)研究刻不容緩。島葉又稱腦島，位于大腦外側(cè)溝的深部，是大腦皮質(zhì)的一部分，與和痛覺(jué)有關(guān)的中央扣帶回相連。島葉是一個(gè)整合結(jié)構(gòu)，參與多種感覺(jué)和認(rèn)知過(guò)程，如學(xué)習(xí)、記憶和感知感覺(jué)[2-5]。近些年隨著對(duì)島葉研究的深入，發(fā)現(xiàn)島葉與慢性痛[6]、神經(jīng)病理性疼痛[7]、痛覺(jué)超敏[8]、疼痛調(diào)控[9-10]、情緒[11]密切相關(guān)。最近的研究發(fā)現(xiàn)島葉有不同類群的投射神經(jīng)元分別參與不同的神經(jīng)傳導(dǎo)通路[11]。前扣帶回皮質(zhì)到伏隔核的通路調(diào)控了共情所產(chǎn)生的疼痛[12]，并且神經(jīng)病理性疼痛會(huì)增加伏隔核TRPA1的表達(dá)[13]，因此本研究探討投向伏隔核的島葉神經(jīng)元對(duì)痛覺(jué)是否具有調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.2 試劑

實(shí)驗(yàn)所使用腺相關(guān)病毒(AAV-Syn-DIO-TetTox-mCherry/-mCherry，血清型AAV2/9；AAV-Syn-DIO-ChR2-mCherry/-mCherry，血清型AAV2/9；AAV-Syn-DIO-NpHR-mCherry/-mCherry，血清型AAV2/9)購(gòu)買自上海和元生物技術(shù)股份有限公司；病毒(AAV-Syn-Cre-EGFP，血清型AAV2/Retro)購(gòu)買自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司。光纖購(gòu)買自南京千奧星科生物技術(shù)有限公司[長(zhǎng)度4 mm，直徑200 μm，光纖數(shù)值孔徑(NA)為0.37，陶瓷插芯直徑為2.5 mm]。無(wú)線光纖購(gòu)買于武漢紐頓科技有限公司。辣椒素(Capsaicin)購(gòu)買于Sigma公司，溶于生理鹽水+7% Tween-80，使?jié)舛葹? μg/μL。

1.3 病毒注射及光纖埋置

1.4 急性疼痛模型以及縮足閾值檢測(cè)

在病毒注射3周充分表達(dá)后，進(jìn)行縮足閾值檢測(cè)以及急性疼痛的造模。在縮足閾值測(cè)試時(shí)，小鼠被放在透明盒子(10 cm×10 cm×5 cm)中置于架空的鐵絲網(wǎng)上，適應(yīng)30 min，再使用校準(zhǔn)的Von-Frey細(xì)絲，參照up-and-down的方法[15]，進(jìn)行縮足閾值的檢測(cè)。在縮足閾值檢測(cè)后的第3天，進(jìn)行急性疼痛的模型建立及行為學(xué)觀察。將小鼠放在不透明盒子(10 cm×10 cm×15 cm)中置于透明玻璃板上，相機(jī)位于玻璃板下進(jìn)行錄像，小鼠在該環(huán)境適應(yīng)30 min 后取出，擦凈玻璃板，在小鼠右后足底皮下注射15 μL辣椒素，再放回盒子中，錄像10 min，對(duì)錄像進(jìn)行人工統(tǒng)計(jì)5 min內(nèi)的舔爪時(shí)間和抬腳時(shí)間。為了適應(yīng)環(huán)境，所有小鼠在進(jìn)行縮足閾值測(cè)試以及急性疼痛模型建立之前會(huì)經(jīng)歷連續(xù)2 d的5 min撫觸及30 min的環(huán)境適應(yīng)。所有行為學(xué)實(shí)驗(yàn)均在白天進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析與繪圖

2 結(jié) 果

2.1 毀損投向伏隔核的島葉神經(jīng)元引起小鼠痛閾上升

首先進(jìn)行了破傷風(fēng)毒素的沉默實(shí)驗(yàn)，在雙側(cè)島葉皮質(zhì)注射腺相關(guān)病毒AAV-Syn-DIO-TetTox-mCherry/-mCherry，在雙側(cè)伏隔核注射腺相關(guān)病毒AAV-Syn-Retro-Cre-EGFP，這樣保證島葉投射到伏隔核的神經(jīng)元表達(dá)破傷風(fēng)輕鏈毒素，阻止其神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，達(dá)到沉默這條投射的效果。在病毒表達(dá)3周后，進(jìn)行縮足閾值的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組小鼠的痛閾較對(duì)照組有明顯的升高(圖1B，P=0.01)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，灌流染色確認(rèn)了病毒的表達(dá)位置(圖1C)。

圖1 毀損投向伏隔核的島葉神經(jīng)元引起小鼠縮足閾值上升

2.2 光遺傳學(xué)抑制投向伏隔核的島葉神經(jīng)元引起小鼠痛閾上升

為了能更加實(shí)時(shí)觀察到投向伏隔核的島葉神經(jīng)元對(duì)痛覺(jué)的影響，接下來(lái)使用了光遺傳學(xué)技術(shù)進(jìn)行光抑制的實(shí)驗(yàn)。病毒注射的策略與之前相似，在雙側(cè)島葉皮質(zhì)注射腺相關(guān)病毒AAV-Syn-DIO-NpHR-mCherry/-mCherry，在雙側(cè)伏隔核注射腺相關(guān)病毒AAV-Syn-Retro-Cre-EGFP，使投向伏隔核的島葉神經(jīng)元表達(dá)會(huì)被黃光抑制的光敏感蛋白NpHR，NpHR表達(dá)于神經(jīng)元表面可以被590 nm的黃色激光照射通道開放，通透氯離子，抑制神經(jīng)元活性，將會(huì)特異性的實(shí)時(shí)抑制投向伏隔核的島葉神經(jīng)元。在埋置光纖的2周后，進(jìn)行縮足閾值的檢測(cè)，與沉默該群神經(jīng)元相同，在給予黃光抑制雙側(cè)島葉投射神經(jīng)元后，小鼠的縮足閾值也出現(xiàn)了上升(圖2B，P=0.02)。檢測(cè)完縮足閾值后，放回籠盒飼養(yǎng)，給予小鼠3 d的休息時(shí)間，后進(jìn)行急性疼痛的行為觀察。在小鼠右足底注射辣椒素并給予黃光，小鼠出現(xiàn)了因?yàn)樘弁磳?dǎo)致的舔爪和抬腳的行為，進(jìn)行10 min的錄像，統(tǒng)計(jì)小鼠在前5 min的舔爪和抬腳的時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)組小鼠觀察到了舔腳時(shí)間和抬腳時(shí)間的縮短(圖2C，P=0.04；圖2D，P=0.02)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，灌流染色確認(rèn)病毒表達(dá)及光纖埋置位置正確(圖2E)。

圖2 光遺傳學(xué)抑制投向伏隔核的島葉神經(jīng)元引起小鼠痛閾上升

2.3 光遺傳學(xué)激活投向伏隔核的島葉神經(jīng)元僅引起小鼠縮足閾值降低

在沉默和抑制投向伏隔核的島葉神經(jīng)元之后都觀察到了機(jī)械痛閾的上升，并且在光抑制該通路后還觀察到了小鼠對(duì)辣椒素造模產(chǎn)生的急性疼痛的耐受程度增加，接下來(lái)繼續(xù)驗(yàn)證激活該通路后對(duì)小鼠痛覺(jué)的影響。在左側(cè)島葉皮質(zhì)注射腺相關(guān)病毒AAV-Syn-DIO-ChR2-mCherry/-mCherry，在左側(cè)伏隔核注射腺相關(guān)病毒AAV-Syn-Retro-Cre-EGFP，使左側(cè)投向伏隔核的島葉神經(jīng)元表達(dá)可以被藍(lán)光激活的光敏感蛋白ChR2，ChR2表達(dá)于神經(jīng)元可以被480 nm的藍(lán)色激光激活，通透陽(yáng)離子，提高神經(jīng)元活性。待病毒表達(dá)后，埋置無(wú)線光纖。在實(shí)驗(yàn)中，給予480 nm的藍(lán)光，進(jìn)行縮足痛閾的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在激活此通路后，小鼠會(huì)出現(xiàn)極顯著的痛閾下降的現(xiàn)象(圖3B，P=0.000 8)。但同樣在藍(lán)光激活的情況下，在急性疼痛模型中，小鼠的舔舐時(shí)間和抬腳時(shí)間沒(méi)有出現(xiàn)顯著的差異(圖3C，P=0.95；圖3D，P=0.46)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，灌流染色確認(rèn)病毒表達(dá)及光纖埋置位置正確(圖3E)。

圖3 光遺傳學(xué)激活投向伏隔核的島葉神經(jīng)元僅引起小鼠縮足閾值下降

3 討 論

如前所述，島葉屬于皮質(zhì)的一部分，參與多種信息的處理包括認(rèn)知、感覺(jué)以及情緒，尤其是疼痛方面。文獻(xiàn)曾經(jīng)報(bào)道大腦皮質(zhì)和島葉皮質(zhì)是對(duì)外周疼痛輸入反應(yīng)潛伏期最短的區(qū)域[16]，而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的電生理[17-18]和人類受試者的腦成像研究[19-21]證實(shí)了島葉在疼痛處理中的重要作用[6]。有研究人員對(duì)后島葉進(jìn)行毀損后發(fā)現(xiàn)其可以阻止機(jī)械異常性疼痛，但對(duì)焦慮樣癥狀的發(fā)展沒(méi)有影響[22]，這些研究都說(shuō)明島葉皮質(zhì)可以感受多種體感信息，并且參與自身狀態(tài)的感受，而疼痛就是重要的本體感受之一。但是這些研究都是從整個(gè)島葉層面進(jìn)行的研究，隨著實(shí)驗(yàn)手段的進(jìn)展和腦區(qū)功能探索的越來(lái)越精細(xì)，2015年，Peng等[23]發(fā)現(xiàn)調(diào)控甜味和苦味的島葉皮質(zhì)完全分離；2019年，研究發(fā)現(xiàn)了島葉有兩種不共標(biāo)的神經(jīng)元亞群，分別投射向伏隔核和中央杏仁核，并且島葉有部分神經(jīng)元對(duì)疼痛、甜味、苦味和恐懼有響應(yīng)[11]，說(shuō)明島葉皮質(zhì)可能存在精細(xì)的神經(jīng)元亞群參與疼痛反應(yīng)。而伏隔核在疼痛中的作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)。2015年，研究發(fā)現(xiàn)激活前額葉皮質(zhì)介導(dǎo)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)是由伏隔核介導(dǎo)的[24]；而2018年，研究發(fā)現(xiàn)抑制前額葉皮質(zhì)到伏隔核的通路會(huì)加重大鼠在急性疼痛中的感覺(jué)和情感狀態(tài)[25]。

本研究選取了島葉到伏隔核的投射通路，即島葉投射向伏隔核的神經(jīng)元亞群進(jìn)行研究，在病毒的幫助下，本研究特異性的感染了投射向伏隔核的島葉神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)在沉默和抑制這群島葉神經(jīng)元后，小鼠的縮足閾值有所上升，沉默和抑制時(shí)都從0.8 g左右的閾值上升到了1.2 g左右，說(shuō)明小鼠對(duì)纖維絲造成的機(jī)械疼痛產(chǎn)生了更強(qiáng)的耐受能力。而在急性疼痛的模型中，小鼠在足底注射辣椒素后，因?yàn)樘弁磿?huì)出現(xiàn)舔舐足底和注射足不敢落地的行為，15 μL辣椒素注射會(huì)引起小鼠約5 min內(nèi)的急性疼痛狀態(tài)。在急性疼痛的時(shí)間內(nèi)光抑制投射向伏隔核的島葉神經(jīng)元，實(shí)驗(yàn)組小鼠顯示出了明顯相對(duì)于對(duì)照組更少的舔爪時(shí)間和更少的抬爪時(shí)間，所以本研究認(rèn)為在抑制投射向伏隔核的島葉神經(jīng)元會(huì)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛的效應(yīng)。而在特異性的光激活投射向伏隔核的島葉神經(jīng)元時(shí)，在機(jī)械痛閾上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相符，產(chǎn)生了與抑制該通路相反的現(xiàn)象，小鼠的機(jī)械痛閾出現(xiàn)了下降，小鼠忍受疼痛的程度有所下降，出現(xiàn)了痛覺(jué)敏化。但是在光遺傳學(xué)激活投射向伏隔核的島葉神經(jīng)元時(shí)，急性疼痛的實(shí)驗(yàn)組小鼠并沒(méi)有展現(xiàn)出相對(duì)于對(duì)照組小鼠更長(zhǎng)的舔爪時(shí)間和更長(zhǎng)的抬腳時(shí)間，對(duì)于這一點(diǎn)，本研究認(rèn)為是地板效應(yīng)所導(dǎo)致的，即小鼠在5 min內(nèi)已經(jīng)達(dá)到了痛覺(jué)感受的峰值，環(huán)路激活所帶來(lái)的痛覺(jué)敏化并不能被很好地檢測(cè)出來(lái)。

本研究的優(yōu)勢(shì)在于在島葉使用了Cre重組酶依賴的腺相關(guān)病毒，結(jié)合下游伏隔核注射的包含Cre重組酶片段的腺相關(guān)病毒，特異性的標(biāo)記以及操控島葉皮質(zhì)投射向伏隔核的神經(jīng)元亞群，以神經(jīng)元亞群作為研究對(duì)象，更精準(zhǔn)地展示了島葉皮質(zhì)投射向伏隔核的神經(jīng)元亞群對(duì)疼痛的調(diào)控，為以后實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的通過(guò)環(huán)路調(diào)控小鼠的痛覺(jué)感受做出了鋪墊。本結(jié)果顯示，不論在正常狀態(tài)還是急性疼痛的狀態(tài)下，島葉到伏隔核的通路都參與了痛覺(jué)的傳遞以及處理，沉默和抑制通路會(huì)使小鼠疼痛耐受增加和鎮(zhèn)痛，激活通路會(huì)使小鼠產(chǎn)生痛覺(jué)敏化，說(shuō)明在島葉皮質(zhì)內(nèi)存在精細(xì)的投射依賴的神經(jīng)元對(duì)疼痛響應(yīng)，對(duì)于疼痛的信息島葉皮質(zhì)的神經(jīng)元可能有更精細(xì)的調(diào)控策略，后續(xù)將繼續(xù)深入探究另一群投射向中央杏仁核的島葉神經(jīng)元對(duì)于痛覺(jué)的影響，探究?jī)扇和渡湎虿煌掠蔚膷u葉神經(jīng)元對(duì)疼痛的調(diào)控和傳遞是協(xié)同一致還是相互拮抗亦或是投射向中央杏仁核的神經(jīng)元對(duì)疼痛沒(méi)有響應(yīng)。當(dāng)然，本研究也存在一些不足，如對(duì)疼痛的檢測(cè)手段較為單一，僅使用了縮足閾值檢測(cè)以及辣椒素產(chǎn)生的急性痛覺(jué)的行為觀察，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，將使用更多的疼痛檢測(cè)手段如完全弗氏佐劑局部注射造成的炎性痛、冷熱板、慢性疼痛模型等，以及檢測(cè)干預(yù)島葉神經(jīng)元亞群對(duì)慢性疼痛所造成的焦慮樣行為是否有所改善。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了投射到伏隔核的島葉神經(jīng)元參與了疼痛信息的傳遞以及處理，在阻斷通路之后，會(huì)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛的效果，而激活之后，在機(jī)械疼痛中小鼠展現(xiàn)出痛覺(jué)的敏化。

致謝：

本研究特別感謝上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院徐天樂(lè)教授課題組在研究平臺(tái)和技術(shù)上的大力支持！本研究同時(shí)感謝復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院李偉廣研究員在課題方向和研究思路方面的悉心指導(dǎo)！