劉雅妮，牛紅青

(1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院全科醫(yī)療科，廣西桂林 541001； 2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，山西太原 030001)

痛風(fēng)是一種由尿酸單鈉(MSU)晶體沉積引起的晶體相關(guān)疾病，與尿酸排泄減少或嘌呤代謝紊亂引起的高尿酸血癥直接相關(guān)。由于生活方式的改變和人口老齡化，痛風(fēng)的發(fā)病率和患病率逐步升高，且呈年輕化趨勢(shì)。許多證據(jù)表明，高尿酸血癥和痛風(fēng)是慢性腎病、高血壓、心腦血管疾病及糖尿病等的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也是患者早期死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。痛風(fēng)治療的目的是緩解關(guān)節(jié)炎癥狀，降低血尿酸以防止急性發(fā)作和復(fù)發(fā)，并最大限度減少關(guān)節(jié)損傷和功能障礙，但目前用藥仍存在爭(zhēng)議。臨床實(shí)踐已證實(shí)傳統(tǒng)中草藥作為輔助治療可能有益于痛風(fēng)患者。因此，進(jìn)一步尋找一種安全、有效的藥物并探明其作用機(jī)制具有重要意義。黃酮類(lèi)化合物廣泛存在于自然界，具有多種抗炎、抗氧化、降尿酸、抗腫瘤等藥理作用。木犀草素屬于黃酮類(lèi)化合物之一，是一種重要的中藥活性成分，多以糖苷的形式存在于很多植物中?，F(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)炎癥，但缺乏更多的機(jī)制研究。為進(jìn)一步探討木犀草素治療痛風(fēng)的潛在機(jī)制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法作一詳細(xì)闡述。

1 資料與方法

從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubchem.ncbi.nlm.nih)中獲得木犀草素的SMILES結(jié)構(gòu)式，用于靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。

將木犀草素的SMILES結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)并以可能性(probability)>0為限制條件進(jìn)行靶點(diǎn)篩選。分別在TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://db.idrblab.net/web/)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/)中輸入“gout”關(guān)鍵詞搜索痛風(fēng)疾病靶點(diǎn)，去除其他物種靶點(diǎn)及重復(fù)靶點(diǎn)后結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行篩選，最終獲得痛風(fēng)疾病靶點(diǎn)。進(jìn)一步將得到的藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，獲取二者的共同靶點(diǎn)，通過(guò)在線(xiàn)工具Calculate and draw custom Venn diagrams(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制韋恩圖，擬定為木犀草素作用于痛風(fēng)的潛在靶點(diǎn)。

將木犀草素與痛風(fēng)的共同靶點(diǎn)上傳至String在線(xiàn)平臺(tái)(https://stringdb.org/)，選用Multiple proteins工具，限定物種為人類(lèi)，置信區(qū)間為大于0.4，獲得蛋白質(zhì)靶點(diǎn)互作拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)(PPI)。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.9.0軟件，利用cytohubba(MCC算法)插件篩選中心節(jié)點(diǎn)。

利用Metascape在線(xiàn)平臺(tái)(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)對(duì)上述化合物和疾病共同靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(GO)富集分析，物種選擇H.sapiens，以<0.01為條件分別對(duì)生物過(guò)程(biological processes，BP)、細(xì)胞成分(cellular components，CC)和分子功能(molecular functions，MF)進(jìn)行篩選，把得到的條目按值大小排序。同樣方法再對(duì)所有共同靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析，得到主要相關(guān)通路(pathway)。

分子對(duì)接能有效預(yù)測(cè)化合物與靶點(diǎn)結(jié)合的可能性，將木犀草素化合物與1.3中獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接。首先準(zhǔn)備木犀草素配體文件，將1.2中獲取的2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為mol2格式。準(zhǔn)備受體文件，將潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(ProteinData Bank，PDB)(https://www.rcsb.org/)，下載靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)，去除配體、去除溶劑后保存為pbd格式。之后運(yùn)用AutoDock4.2.6軟件，設(shè)置Grid Box為整個(gè)蛋白分子，運(yùn)行AutoDock4.2.6軟件對(duì)化合物及靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，得到結(jié)合能，以驗(yàn)證靶點(diǎn)與化合物的結(jié)合活性。最后用Pymol軟件將對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié) 果

從Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)獲得木犀草素作用靶點(diǎn)104個(gè)。TTD數(shù)據(jù)庫(kù)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET分別獲得痛風(fēng)疾病靶點(diǎn)為18個(gè)、203個(gè)、205個(gè)。取交集后共獲得木犀草素治療痛風(fēng)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)19個(gè)(圖1)，具體為：醛酮還原酶家族1B10(AKR1B10)、碳酸酐酶1(CA1)、甲狀腺素運(yùn)載蛋白(TTR)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF1R)、多藥耐藥蛋白1(ABCB1)、花生四烯酸5-脂氧合酶(ALOX5)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶(SRC)、囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)、醛糖還原酶(AKR1B1)、醛酮還原酶家族1成員C4(AKR1C4)、CXC趨化因子受體1型(CXCR1)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(ABCC1)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、醛酮還原酶家族1成員C3(AKR1C3)、黃嘌呤脫氫酶/氧化酶(XDH)、3α-羥基類(lèi)固醇3-脫氫酶(AKR1C2)、二氫二醇脫氫酶(AKR1C1)、細(xì)胞色素P4501B1(CYP1B1)、ATP結(jié)合盒亞家族G成員2(ABCG2)。

圖1 木犀草素治療痛風(fēng)潛在靶點(diǎn)韋恩圖 圖2 木犀草素治療痛風(fēng)潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

將19個(gè)共同靶點(diǎn)上傳至String在線(xiàn)平臺(tái)，構(gòu)建得到的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖包括19個(gè)節(jié)點(diǎn)、32條邊，平均節(jié)點(diǎn)度3.37、局部聚類(lèi)系數(shù)0.6(圖2)。使用Cytoscape的cytohubba插件篩選得到核心靶點(diǎn)基因共5個(gè)，分別為PTGS2、ABCG2、ABCB1、SRC、AKR1C3。

將19個(gè)共同靶點(diǎn)上傳到Metascape平臺(tái)進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示木犀草素治療痛風(fēng)的潛在靶點(diǎn)分別被富集在烯烴化合物代謝、對(duì)脂肪酸的反應(yīng)、視黃醇代謝、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)、花生四烯酸代謝、對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)有機(jī)磷的反應(yīng)、體液調(diào)節(jié)和細(xì)胞趨化10條生物過(guò)程(圖3)；糖醇NADP氧化還原酶活性、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、血紅素結(jié)合、鐵離子結(jié)合和蛋白質(zhì)二聚化活性5條分子功能(圖4)；裂解液泡、頂端質(zhì)膜、膜面和膜筏4條細(xì)胞組分(圖5)。

圖3 木犀草素治療痛風(fēng)潛在靶點(diǎn)GO富集(生物過(guò)程)結(jié)果

圖4 木犀草素治療痛風(fēng)潛在靶點(diǎn)GO富集(分子功能)結(jié)果

圖5 木犀草素治療痛風(fēng)潛在靶點(diǎn)GO富集(細(xì)胞組分)結(jié)果

在Metascape平臺(tái)繼續(xù)對(duì)木犀草素作用于痛風(fēng)的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)加以KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點(diǎn)富集在7條通路上，包括卵巢類(lèi)固醇合成、類(lèi)固醇激素合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)、葉酸生物合成、化學(xué)致癌、內(nèi)吞作用和癌癥相關(guān)的通路(圖6)。

圖6 木犀草素治療痛風(fēng)潛在靶點(diǎn)KEGG富集結(jié)果

將木犀草素的2D結(jié)構(gòu)與2.2中的關(guān)鍵靶點(diǎn)PTGS2、ABCG2、ABCB1、SRC、AKR1C3對(duì)應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutoDock4.2.6軟件進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)合能分別為-5.63、-3.97、-4.78、-5.99、-6.81。結(jié)果表明木犀草素化合物與這些靶點(diǎn)之間具有良好的對(duì)接活性。其中最有意義的靶點(diǎn)為PTGS2、ABCG2，將其對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化分析(圖7、圖8)。

圖7 木犀草素與PTGS2分子對(duì)接 圖8 木犀草素與ABCG2分子對(duì)接

3 討 論

目前國(guó)際上通用的痛風(fēng)急性期常用藥物為秋水仙堿、非甾體抗炎藥和糖皮質(zhì)激素，降血尿酸藥物為抑制尿酸合成的別嘌呤醇或非布司他、促進(jìn)尿酸排泄的苯溴馬隆或丙磺舒，以及分解尿酸的重組尿酸氧化酶。但從實(shí)際情況看，這些藥物均存在一定弊端。中醫(yī)藥治療痛風(fēng)雖然有效，但藥理機(jī)制尚不清楚，從而限制其傳播。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種研究藥物有效性和安全性的新思路，已成為中藥研究和開(kāi)發(fā)不可或缺的手段。本研究就是通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理及分子對(duì)接分析木犀草素治療痛風(fēng)的潛在靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)核心靶點(diǎn)包括PTGS2、ABCG2、ABCB1、SRC、AKR1C3。其中，PTGS2、ABCG2最具臨床意義。

痛風(fēng)急性發(fā)作是由于尿酸鈉晶體在關(guān)節(jié)等部位局部沉積導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，這時(shí)NLRP3炎癥小體激活、白細(xì)胞介素(IL)-1β釋放，并進(jìn)一步導(dǎo)致其他促炎細(xì)胞因子和趨化因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在這一過(guò)程中，環(huán)氧合酶2(COX-2)可由單核巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞PTGS2基因迅速編碼表達(dá)，通過(guò)花生四烯酸代謝途徑參與炎癥反應(yīng)，是導(dǎo)致痛風(fēng)炎性反應(yīng)和組織損傷的關(guān)鍵酶之一。而花生四烯酸的代謝產(chǎn)物主要包括前列腺素(PG)和白細(xì)胞三烯(LT)等，它們均是重要的炎癥因子，可導(dǎo)致發(fā)熱、疼痛、血管擴(kuò)張、通透性升高及白細(xì)胞滲出等炎癥反應(yīng)?，F(xiàn)今最常用于緩解急性痛風(fēng)炎癥、疼痛和發(fā)熱的選擇性COX-2非甾體類(lèi)抗炎藥，就是通過(guò)選擇性抑制COX-2活性而發(fā)揮作用。多個(gè)實(shí)驗(yàn)已表明，木犀草素能通過(guò)減少活性氧及活性氮合成、花生四烯酸代謝、NF-κB和MAPK等多種炎癥通路抑制包括COX-2在內(nèi)的炎性細(xì)胞因子表達(dá)，從而降低疾病的炎癥反應(yīng)，但在痛風(fēng)的研究相對(duì)較少。本研究則通過(guò)篩選核心靶點(diǎn)，預(yù)測(cè)木犀草素同樣能夠通過(guò)PTGS2靶點(diǎn)抑制COX-2的表達(dá)，從而緩解痛風(fēng)急性炎癥反應(yīng)。經(jīng)GO富集分析也進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)木犀草素治療痛風(fēng)的主要生物過(guò)程包含花生四烯酸(AA)代謝過(guò)程。

痛風(fēng)發(fā)病與ABCG2基因多態(tài)性有關(guān)。其編碼蛋白屬于ABC(ATP結(jié)合盒)轉(zhuǎn)運(yùn)超家族并具有穿過(guò)膜輸送多種底物的能力，是尿酸排出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一種，不僅在腎近端小管細(xì)胞的頂端刷狀緣膜表達(dá)，也在腸上皮細(xì)胞中高度表達(dá)，在腎臟和腎外尿酸排泄中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)ABCG2在腸道尿酸排泄和高尿酸血癥的發(fā)病機(jī)制中起著尤為重要的作用。LIU等更是指出，血尿酸水平之所以存在性別差異是因?yàn)榇贫伎梢源龠M(jìn)腸道ABCG2的表達(dá)，從而促進(jìn)尿酸排泄。很多黃酮類(lèi)化合物即是通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶、促進(jìn)ABCG2基因表達(dá)等方式發(fā)揮降血尿酸作用。其他很多類(lèi)型ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在人體也廣泛分布，ABCB1編碼的蛋白就是該超家族的成員之一，可通過(guò)細(xì)胞外膜和細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)藥物等各種分子，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。本研究預(yù)測(cè)木犀草素能夠通過(guò)作用于ABCG2、ABCB1靶點(diǎn)治療痛風(fēng)，由此推測(cè)其還可通過(guò)降低尿酸等發(fā)揮抗痛風(fēng)作用。而且，經(jīng)GO富集分析和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)主要分子功能和關(guān)鍵信號(hào)通路均包含ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體及卵巢類(lèi)固醇合成途徑。

另外，痛風(fēng)時(shí)破骨細(xì)胞的分化和活化均明顯增強(qiáng)。SRC編碼的原癌基因酪氨酸蛋白激酶則能夠與PTK2B/PYK2一起在破骨細(xì)胞骨吸收中發(fā)揮重要作用，還可通過(guò)激活線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C氧化酶促進(jìn)破骨細(xì)胞的能量產(chǎn)生。木犀草素通過(guò)作用于該靶點(diǎn)，則可能發(fā)揮抑制痛風(fēng)骨破壞的作用。AKR1C3編碼醛酮還原酶1C3，該酶不僅參與體內(nèi)類(lèi)固醇激素的代謝，還可通過(guò)還原前列腺素D2為11β-前列腺素F2參與炎癥反應(yīng)。木犀草素等黃酮類(lèi)化合物均對(duì)AKR1C3存在抑制作用，可見(jiàn)它還可以通過(guò)該途徑抑制痛風(fēng)炎癥反應(yīng)。

本研究最后還對(duì)木犀草素與上述核心靶點(diǎn)進(jìn)行了分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)均有較好的結(jié)合活性，進(jìn)一步證實(shí)了木犀草素可通過(guò)這些靶點(diǎn)發(fā)揮治療痛風(fēng)的作用。其中，作用于PTGS2及AKR1C3靶點(diǎn)可能通過(guò)花生四烯酸代謝通路抑制痛風(fēng)急性發(fā)作時(shí)的炎癥反應(yīng)；作用于ABCG2及ABCB1靶點(diǎn)則可能通過(guò)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體通路增加尿酸的排泄；作用于SRC靶點(diǎn)則參與痛風(fēng)破骨細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)工具，系統(tǒng)闡釋了木犀草素治療痛風(fēng)的作用機(jī)制，并利用分子對(duì)接方法初步驗(yàn)證了木犀草素化合物與其治療痛風(fēng)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)生相互作用的分子基礎(chǔ)。雖然，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種研究中藥機(jī)制的新工具，可以幫助我們快速、有效地找到藥物治療疾病的靶點(diǎn)，能夠在一定程度上減少篩選實(shí)驗(yàn)，有利于節(jié)約成本，但它主要依賴(lài)于現(xiàn)有的生物信息數(shù)據(jù)及計(jì)算機(jī)模擬算法，故無(wú)法預(yù)測(cè)木犀草素其他潛在的抗痛風(fēng)作用，而且相應(yīng)結(jié)果缺乏體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，仍舊存在一定的研究局限性。因此，下一步可以考慮進(jìn)行上述靶點(diǎn)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室研究為木犀草素治療痛風(fēng)提供更多的科學(xué)依據(jù)。