張利捷， 操焱焱， 李 卿， 張 鑫， 洪 偉， 鄭傳勝， 梁 斌

經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）聯(lián)合免疫治療是當(dāng)前肝癌治療的熱點(diǎn)，其具體聯(lián)合作用機(jī)制尚未明確［1-3］。我國肝癌患者大多伴隨炎癥-硬化-腫瘤的演變［4］。腫瘤可發(fā)生免疫逃逸，使得機(jī)體免疫系統(tǒng)無法發(fā)揮監(jiān)視及殺傷作用［5］，因此建立可模仿人類肝癌免疫學(xué)背景的動(dòng)物模型尤為重要。 TACE 治療常用動(dòng)物模型主要包括兔VX2 移植瘤肝癌模型、肝炎病毒誘導(dǎo)的土撥鼠肝癌模型及二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN） 誘導(dǎo)的大鼠原位肝癌模型，各有優(yōu)劣［2］。 兔VX2 肝癌模型是由乳頭瘤病毒誘導(dǎo)的間變性鱗癌，并不具備人類肝癌典型生物學(xué)特征［6］；土撥鼠肝癌模型適合作為免疫學(xué)研究且適合TACE 操作，但成瘤時(shí)間往往需要數(shù)年，該類動(dòng)物也較難獲得［7］；DEN 誘導(dǎo)的大鼠原位肝癌模型不僅具備人類肝癌損傷的病理改變，成瘤時(shí)間也相對(duì)較短，是較為理想的模型［8-9］。 但目前的研究尚缺乏該模型建造的系統(tǒng)性變化，如長(zhǎng)時(shí)間、連續(xù)性影像和病理評(píng)估，無法滿足TACE 治療時(shí)機(jī)選擇及療效評(píng)價(jià)。 基于以上現(xiàn)狀，本研究采取口服DEN 誘導(dǎo)大鼠原位肝癌模型，結(jié)合影像與病理檢查，探索肝癌成瘤過程以及在該動(dòng)物模型中進(jìn)行TACE 操作的可行性，為開展進(jìn)一步TACE 聯(lián)合免疫治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供有效的肝癌動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和模型建立

取雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60 只（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）， 體質(zhì)量160～180 g，分為腫瘤模型組（n=40）和TACE 應(yīng)用組（n=20）。采用口服DEN 方法建立大鼠原位肝癌模型：將0.01%濃度DEN 加入大鼠飲水瓶，供其自由飲用［10］。

1.2 影像學(xué)檢查

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均行肝臟MRI 及肺部CT 檢查。 采用2%戊巴比妥鈉腹腔注射（0.3 mL/100 g）麻醉。 MRI掃描采用大鼠專用線圈， 掃描范圍為膈頂至肝下緣，掃描序列及參數(shù)見表1。 肺部CT 掃描范圍從胸骨入口至肋膈角，掃描參數(shù)：80 kVp， 400 mA，層厚0.67 mm，束寬40 mm，螺距1.048，旋轉(zhuǎn)時(shí)間0.4 s。

表1 MRI 序列及參數(shù)

1.3 病理學(xué)檢測(cè)

頸椎脫臼法處死大鼠， 取肝臟組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗，濾紙吸去水分。 選取肝臟肉眼變化明顯的肝葉作為檢測(cè)標(biāo)本。標(biāo)本固定于4%多聚甲醛，乙醇脫水，制作石蠟切片。 蘇木精-伊紅（HE）及Masson 染色操作參照文獻(xiàn)［10］。 采集不同倍數(shù)圖片加以分析。

1.4 荷瘤動(dòng)物生存

排除誘導(dǎo)過程中死亡及處死的實(shí)驗(yàn)鼠后，余荷瘤大鼠以普通飲用水飼養(yǎng)，記錄死亡情況，觀察生存時(shí)間。

1.5 介入操作及評(píng)價(jià)

當(dāng)MRI 證實(shí)大鼠肝腫瘤長(zhǎng)徑達(dá)到約0.5 cm后， 無菌條件下行開腹經(jīng)胃十二指腸動(dòng)脈逆行插管。 化療藥為阿霉素（浙江海正藥業(yè)公司），劑量為1.6 mg/只（根據(jù)大鼠與人體藥量換算得出）。 栓塞劑為聚乙烯醇栓塞微球（100～300 μm，蘇州恒瑞醫(yī)療器械公司），麻醉方式同前。 介入操作方法：大鼠開腹經(jīng)胃十二指腸動(dòng)脈逆行插管， 以劍突為界向下3～4 cm 行利多卡因局部麻醉， 沿腹部白線正中切口剪開，固定十二指腸，分離肝總動(dòng)脈、肝固有動(dòng)脈及胃十二指腸動(dòng)脈（圖1①）；在分離后的胃十二指腸動(dòng)脈遠(yuǎn)端剪一斜口并引入導(dǎo)管（內(nèi)徑0.3 mm×外徑0.6 mm，重慶思睿醫(yī)療儀器公司）（圖1②）；將動(dòng)物轉(zhuǎn)移至DSA 臺(tái)，行經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈造影，對(duì)比劑注入量約為0.5 mL，流率為0.3 mL/s，壓力為100 psi，總對(duì)比劑體積為2.0 mL/kg，圖像采集速度設(shè)定為7.5 幀/s，持續(xù)24 s；全程在DSA 監(jiān)視下緩慢注入化療藥物和栓塞劑，栓塞終點(diǎn)為腫瘤前向血管近乎淤滯，復(fù)查造影示腫瘤染色消失；栓塞后退出導(dǎo)管，逐層關(guān)腹。 觀察大鼠肝癌模型的動(dòng)脈造影改變，記錄介入技術(shù)成功率及圍手術(shù)期動(dòng)物死亡情況。

圖1 TACE 操作示意圖

TACE 成功定義為導(dǎo)管成功插入動(dòng)脈， 打入足夠藥量的阿霉素，并經(jīng)DSA 造影顯示腫瘤血管栓塞完全。 TACE 術(shù)后3 d、7 d 分別處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行病理大體觀及HE 染色，檢測(cè)腫瘤壞死。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7.0 版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及繪圖。 數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差、中位數(shù)和范圍、率的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤模型組

2.1.1 腫瘤模型影像表現(xiàn) 經(jīng)MRI 和病理檢測(cè)確認(rèn)腫瘤造模成功后， 即停止用藥。 第6 周行首次MRI 掃描時(shí)未觀察到大鼠肝臟出現(xiàn)0.2 cm 結(jié)節(jié)；第7 周MRI 掃描時(shí)首次觀察到12 只大鼠肝臟出現(xiàn)長(zhǎng)T1 長(zhǎng)T2 的結(jié)節(jié)信號(hào)影，邊緣清晰，最長(zhǎng)徑均已達(dá)到0.2 cm，直徑為（0.23±0.03） cm，腫瘤個(gè)數(shù)多為2（1，3）個(gè)，余肝臟部分信號(hào)不均一，呈硬化改變；第8 周時(shí)成瘤大鼠逐步增多，結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)增多、直徑增大，直徑為（0.30±0.08）cm；第9、第10、第11、第12 周時(shí)結(jié)節(jié)直徑分別為（0.39±0.09） cm、（0.45±0.16） cm、（0.52±0.21） cm、（0.60±0.23） cm；最后一次掃描時(shí)間為第17 周，腫瘤直徑為（0.99±0.30） cm（圖2①）。

2.1.2 成瘤率 當(dāng)MRI 顯示腫瘤直徑達(dá)到0.2 cm時(shí)，誘導(dǎo)過程中4 只大鼠死亡，余36 只大鼠存活。相應(yīng)中位時(shí)間為8（7，10）周。 成瘤率方面，第6 周MRI 掃描未見明顯結(jié)節(jié)信號(hào)影；第7 周可見部分大鼠肝臟出現(xiàn)0.2 cm 腫瘤，共計(jì)12 只（33.3%，12/36）；第8 周可見大量大鼠肝臟出現(xiàn)結(jié)節(jié)， 共計(jì)20 只（55.6%，20/36）；第9 周成瘤大鼠26 只（72.2%，26/36）； 第10 周所有大鼠肝臟均可見0.2 cm 結(jié)節(jié)影（100%，36/36）（圖2②）。

圖2 誘導(dǎo)成瘤圖

2.1.3 腫瘤模型病理表現(xiàn) MRI 顯示肝腫瘤直徑達(dá)0.2 cm 時(shí)處死5 只大鼠行病理檢查，大體觀肝臟體積略增大，表面光滑，質(zhì)地柔軟，可見灰白色微小結(jié)節(jié)；HE 染色顯示肝細(xì)胞水腫、液滴沉積，肝小葉內(nèi)可見嗜酸性小體和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)清晰，細(xì)胞核肥大深染，經(jīng)病理科醫(yī)生確認(rèn)為肝癌結(jié)節(jié)；Masson 染色結(jié)果顯示深藍(lán)色的膠原纖維增多，膠原主要沉積在肝小葉周邊，提示肝臟呈纖維化改變（圖3①～④）。 MRI 顯示肝腫瘤直徑達(dá)0.5 cm 時(shí)另處死5 只大鼠，大體觀肝臟體積略縮小，質(zhì)地較硬，表面分布大量灰白色結(jié)節(jié)；HE 染色可見假小葉形成，正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，周圍包繞的纖維間隔內(nèi)可見少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，假小葉內(nèi)肝細(xì)胞走行和排列紊亂，中央靜脈缺如，可見大量深染、多核的腫瘤細(xì)胞；Masson 染色顯示膠原纖維染色進(jìn)一步加深，肝臟纖維化程度加重，可見出血性壞死，纖維化組織周圍伴隨淋巴單核細(xì)胞浸潤(rùn)灶（圖3⑤～⑧）。

圖3 腫瘤模型表現(xiàn)

2.1.4 肝外轉(zhuǎn)移情況 本批大鼠累計(jì)觀察到5 只發(fā)生肝外轉(zhuǎn)移（圖4），分別為肺轉(zhuǎn)移、腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、十二指腸種植轉(zhuǎn)移、腎上腺轉(zhuǎn)移及腎臟轉(zhuǎn)移。

圖4 誘導(dǎo)期間肝外轉(zhuǎn)移

2.1.5 荷瘤大鼠生存時(shí)間觀察 40 只大鼠誘導(dǎo)成瘤過程中死亡4 只，另處死10 只用于病理檢測(cè)，余26 只用于觀察生存。 經(jīng)MRI 及病理確定成瘤后，大鼠逐步出現(xiàn)死亡。 第8 周時(shí)死亡2 只，第9 周時(shí)死亡2 只，第10 周時(shí)死亡1 只，至誘導(dǎo)后的第20 周全部死亡（圖5）。

圖5 大鼠生存曲線

2.2 TACE 應(yīng)用組

2.2.1 腫瘤模型 本組20 只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在DEN 誘導(dǎo)至腫瘤達(dá)0.5 cm 過程中死亡4 只， 余下16 只接受TACE 治療。

2.2.2 技術(shù)成功率、DSA 表現(xiàn)及死亡率 1 只大鼠經(jīng)胃十二指腸動(dòng)脈逆行插管失敗，2 只TACE 途中導(dǎo)管意外脫出且再次插入失敗，1 只術(shù)中失血過量死亡，1 只因麻醉過量死亡，余11 只大鼠成功接受經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈造影及TACE 治療。TACE 技術(shù)成功為11/16，從皮膚切開到閉合的手術(shù)時(shí)間為（132±10）min。DSA證實(shí)該肝癌模型為富血供腫瘤，動(dòng)脈早期可見腫瘤血管增多、紊亂，實(shí)質(zhì)期可見結(jié)節(jié)狀腫瘤染色，未見明顯動(dòng)脈-門靜脈及動(dòng)脈-靜脈分流，栓塞后造影復(fù)查顯示腫瘤供血?jiǎng)用}阻斷，腫瘤染色消失（圖6）。 TACE術(shù)中2 只大鼠死亡，術(shù)后觀察期間1 只死亡（解剖發(fā)現(xiàn)大量腹水），TACE 相關(guān)死亡為3/16。

圖6 TACE 栓塞效果示意圖

2.2.3 腫瘤壞死 術(shù)后3 d 大鼠肝臟外觀可見多發(fā)點(diǎn)狀壞死，HE 染色顯示腫瘤壞死率為（48.16±2.65）%；術(shù)后7 d 可見壞死灶進(jìn)一步增多， 部分肝葉呈壞死改變，HE 染色顯示腫瘤壞死率為（50.36±2.92）%（圖7）。

3 討論

DEN 常被用于誘導(dǎo)大鼠原位肝癌模型。主要優(yōu)點(diǎn)在于誘導(dǎo)作用專一，常為肝細(xì)胞癌（約77%）［11-12］。通過P450 酶進(jìn)行代謝催化形成DEN-DNA 加合物，發(fā)揮致癌性［13-14］。 此外，DEN 誘導(dǎo)活性氧（ROS）發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致肝癌［15-16］。本研究中也體現(xiàn)出誘導(dǎo)早期肝細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，中期肝臟硬化以及晚期腫瘤形成的病理改變，相應(yīng)的時(shí)間變化節(jié)點(diǎn)與既往文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［11，17-18］。

本模型成瘤規(guī)律因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)不同略有區(qū)別。Liu等［19］采用濃度為100 mg/L DEN 水溶液誘導(dǎo)16 周，所有實(shí)驗(yàn)鼠均成功出現(xiàn)肝癌。 Krishnan 等［20］首周腹腔注射2 次DEN（200 mg/kg），后連續(xù)注射7 d 停藥，也在第14 周均造模成功。 但以上研究缺少造模過程動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，難以評(píng)判首次成瘤時(shí)間及不同階段成瘤大小，無法滿足介入操作要求。 本研究采取連續(xù)性肝臟MRI 掃描及病理檢查，動(dòng)態(tài)揭示模型成瘤全過程。在介入治療方面，Gade 等［10］曾采用口服DEN 連續(xù)誘導(dǎo)， 最大腫瘤直徑發(fā)展到0.5 cm 需至少3 個(gè)月。本研究發(fā)現(xiàn)， 腫瘤平均最大橫經(jīng)達(dá)到約0.5 cm 時(shí)雖為11～12 周，但此時(shí)大部分已超過0.5 cm，僅有個(gè)別仍為2～3 mm； 推測(cè)可能與其不均勻攝藥量有關(guān)［13］，這是該誘導(dǎo)方式不足之處。 因此，為達(dá)到最優(yōu)介入操作效果，應(yīng)早于12 周，最遲約在誘導(dǎo)后10 周左右行大鼠肝臟MRI 檢查，以免腫瘤負(fù)荷過大，產(chǎn)生自發(fā)性壞死，影響操作及療效評(píng)價(jià)。

本模型死亡率因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)不同也有所區(qū)別。 李笑巖等［11］采用口服DEN 誘導(dǎo)，最終死亡率為17.8%（24/135）。 周陳杰等［21］采用腹腔注射DEN 誘導(dǎo)，最終死亡率為33.0%。 朱艷志等［22］采用間斷給予DEN方式誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)了極低的死亡率（2.1%，1/48），但首次成瘤在誘導(dǎo)12 周后。 本研究中在誘導(dǎo)成瘤過程及腫瘤直徑增大至0.5 cm 時(shí)累計(jì)死亡9 只，死亡率為22.5%（9/40），與以上研究相當(dāng)。 可適當(dāng)降低死亡率的方法如下：①保證大鼠飲水瓶足夠潔凈，減少大鼠發(fā)生感染概率。 ②定期更換大鼠墊料，減少氨氣濃度；維持飼養(yǎng)房通風(fēng)，保證光照。 ③如發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)期間大鼠死亡過多，可短暫停止誘導(dǎo)，更換普通水，給予大鼠恢復(fù)時(shí)間［23］。 本研究發(fā)現(xiàn)短暫（如2 周）停止誘導(dǎo)，不會(huì)影響最終成瘤情況。

本類模型肝外轉(zhuǎn)移的報(bào)道相對(duì)較少。 Liu 等［24］采用1% DEN 水溶液持續(xù)灌胃， 在第20 周時(shí)觀察到肺轉(zhuǎn)移1 只，腹腔轉(zhuǎn)移1 只（2/10）。朱艷志等［22］使用0.01% DEN 間斷口服誘導(dǎo)， 觀察到2 只肺轉(zhuǎn)移（2/36），3 只肝外腫瘤（3/36），但未記錄轉(zhuǎn)移出現(xiàn)時(shí)間。 本研究中觀察到肺轉(zhuǎn)移、十二指腸種植轉(zhuǎn)移、腹部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腎上腺轉(zhuǎn)移和腎轉(zhuǎn)移各1 例。 結(jié)合既往文獻(xiàn)及本研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)本模型肝外轉(zhuǎn)移發(fā)生率較低，且轉(zhuǎn)移部位及出現(xiàn)時(shí)間不固定。

本模型用于TACE 研究的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在：①口服DEN 誘導(dǎo)重現(xiàn)了人類肝細(xì)胞癌的肝細(xì)胞損傷-肝硬化惡性進(jìn)展的周期改變，實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)了類似病理損傷； ②DSA 顯示該模型腫瘤血管與人類肝細(xì)胞癌中所見腫瘤染色較為相似， 動(dòng)脈期血管增多、紊亂，實(shí)質(zhì)期結(jié)節(jié)染色；③TACE 操作引起的死亡率可隨著術(shù)者操作水平和熟練度提升逐步降低，提高操作大鼠的存活率，證明該模型TACE 操作是可重復(fù)、安全的介入操作，為研究介入治療效果動(dòng)物模型的構(gòu)建提供了更多選擇［25-26］；④TACE 操作實(shí)現(xiàn)了與既往報(bào)道［12］較為一致的腫瘤壞死率，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐步提升。

本研究存在局限性， 模型成瘤時(shí)間雖較早，但滿足介入治療所需要求仍需在成瘤基礎(chǔ)上等待腫瘤生長(zhǎng)2 周左右；腫瘤多為散發(fā)，較難實(shí)現(xiàn)靶向栓塞； 模型受到所有嚙齒動(dòng)物模型所固有的限制，涉及生物等效性的推斷和研究結(jié)果對(duì)人類肝細(xì)胞癌的適用性，仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究采用影像與病理相結(jié)合方式， 揭示了DEN 誘導(dǎo)大鼠原位肝癌模型的腫瘤形成、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移規(guī)律，以及肝臟背景損傷情況和動(dòng)物生存時(shí)間，同時(shí)證實(shí)了采用開腹經(jīng)胃十二指腸動(dòng)脈逆行插管方法進(jìn)行介入治療的可行性，為開展進(jìn)一步TACE 聯(lián)合免疫治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供有效的肝癌動(dòng)物模型。