張曉天，付祎瑋，焦文莉，樸靜子，李洋，李自博，周如軍

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)，110866）

花生瘡痂病是花生產(chǎn)業(yè)中重要病害之一，在我國(guó)各主要花生產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生危害，植物發(fā)病葉片、葉柄和莖稈等產(chǎn)生大量褐色、圓形或卵圓形病斑，病斑中部稍凹陷，呈“火山口”狀，可導(dǎo)致發(fā)病部位扭曲畸形，植株矮化，一般田間發(fā)病率10%～30%，損失嚴(yán)重[1]。花生瘡痂病菌（Elsino? arachidis）可產(chǎn)生一種具有光敏活性的苝醌類真菌毒素—痂囊腔菌素（Elsinchrome，ESC），在光照條件下產(chǎn)生大量活性氧，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過氧化、電解質(zhì)泄漏、膜通透性降低，最終細(xì)胞死亡，是花生瘡痂病菌關(guān)鍵的致病因子，在病菌侵染和病斑擴(kuò)展過程中發(fā)揮著重要作用[2～4]

植物病原真菌毒素致病作用、生物合成途徑及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究對(duì)于揭示病菌的侵染機(jī)制、致病機(jī)理和病原寄主互作具有重要意義。前期研究表明，毒素的生物合成一般由編碼聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）的基因所在的基因簇進(jìn)行調(diào)控[5]。如涉及尾孢菌素（Cercosporin）、黑粉菌素（Ustilaginoidins）和伏馬菌素（Fumonisin）生物合成的CTB、Ugs 和FUM基因簇等，當(dāng)PKS基因被靶向敲除或沉默時(shí)，毒素生物合成途徑受到阻滯，毒素生物合成受到抑制[6～8]。目前ESC的生物合成途徑及調(diào)控機(jī)制研究尚處于初始階段，僅在柑橘瘡痂病菌（Elsino? fawcettii）中初步闡明了聚酮合酶EfPKS1基因是毒素生物合成的關(guān)鍵基因[9,10]，鋅指轉(zhuǎn)錄因子EfSTE12基因缺失，毒素積累減少，果膠酶和蛋白水解酶活性升高[11]，而基因簇中其他基因功能尚不清晰，生物合成途徑和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未解析，需進(jìn)一步研究揭示。

近年來，全基因組測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，可以便捷地從基因組中挖掘特定功能基因或基因簇，研究其生物功能，在基因水平為植物病原真菌遺傳、次生代謝、生物合成途徑及病原寄主互作科學(xué)問題提供可靠的分子證據(jù)[12,13]。前期研究發(fā)現(xiàn)花生瘡痂病菌ESC 的積累量與致病性呈顯著性正相關(guān)，是病菌重要的毒力因子[14]，項(xiàng)目組對(duì)病菌進(jìn)行了全基因組測(cè)序，大小為33.18 Mb[15]。本文在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展了E.arachidis次生代謝相關(guān)PKS 基因簇挖掘、毒素生物合成相關(guān)基因ESCB1克隆和生物信息學(xué)分析，旨在為解析ESC 生物合成途徑、構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和闡明病菌致病機(jī)制提供前期理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：花生瘡痂病菌（E.arachidisLN-JHC01），分離自遼寧錦州花生種植基地。

1.2 PKS基因簇的挖掘

利用antiSMASH 在線網(wǎng)站（https://bitbucket.org/antismash/antiSMASH5.0/）預(yù)測(cè)和分析次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇，通過NRPS-PKS knowledgebase（http://www.nii.ac.in/～pksdb/sbspks/master.html）對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證后，篩選出PKS基因簇。

1.3 PKS基因簇的功能預(yù)測(cè)

根據(jù)antiSMASH 搜索已知功能的同源基因簇，并預(yù)測(cè)基因簇中合成基因?qū)?yīng)產(chǎn)物的核心結(jié)構(gòu)，初步判斷基因簇代謝產(chǎn)物，利用NCBI BLAST（https://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi）對(duì)基因簇所有同源序列進(jìn)行同源比對(duì)，初步確定基因功能。

1.4 ESCB1基因的克隆

根據(jù)ESCB1基因組序列，利用Primer5.0 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物ESCB1-F（TCGATTGCTTTCCCTGGAA）/ ESCB1R （CCTTGATGCTCCTCTTGATA），以DNA 為模板PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程公司測(cè)序。

1.5 ESCB1基因生物信息學(xué)分析

利用ORF Finder（http://www. bioinformatics. org/sms2/orf_find.html）、ProtParam（https://web.expasy.org/protparam）、NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu. dk/services/NetPhos/）、InterPro（http://www. ebi.ac. uk/interpro/scan. html）、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)網(wǎng)站（https://npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin）、蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)網(wǎng)站（https://www. swissmodel. expasy. org）等在線軟件獲得開放閱讀框、外顯子、內(nèi)含子信息，預(yù)測(cè)編碼蛋白的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域等。通過MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。為了可視化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域架構(gòu)，使用軟件DOG 2.0 繪制ESCB1基因結(jié)構(gòu)域。

1.6 ESC毒素的提取及含量測(cè)定

ESC毒素的提取及含量測(cè)量參考劉璐方法[16]。

1.7 ESCB1的表達(dá)分析

菌懸液涂布于PDA 培養(yǎng)基中黑暗培養(yǎng)14 d 后光照培養(yǎng)2 d，刮取菌絲，利用Eastep Super 總RNA提取試劑盒（普洛麥格生物技術(shù)有限公司）提取總RNA，HiFiScript cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（康為世紀(jì)公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以Actin基因?yàn)閮?nèi)參，以黑暗培養(yǎng)16 d 為對(duì)照，qPCR 測(cè)定ESCB1表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組中PKS基因簇預(yù)測(cè)分析與篩選

通過antiSMASH5.0 預(yù)測(cè)和NRPS-PKS knowledgebase 驗(yàn)證，E.arachidis基因組中共發(fā)現(xiàn)次級(jí)代謝基因簇22 條，其中t1PKS 基因簇5 條，PKS-NRPS基因簇1條，結(jié)果如表1所示。

表1 PKS基因簇信息表Table 1 PKS sequence information

基因簇中所含有的編碼基因數(shù)量及分布各不相同。繪制PKS基因結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)PKS的保守結(jié)構(gòu)域包括?；D(zhuǎn)移酶（acyltransferase，AT）、酮基合酶（ketosynthase，KS）、脫水酶（dehydratase，DH）、甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase，MeT）、?；d體蛋白（acylcarier protein，ACP）和具有還原活性的烯脂酰還原酶（enoylreductase，ER）、酮體還原酶（ketoreductase，KR）等結(jié)構(gòu)域（圖1）。根據(jù)其結(jié)構(gòu)域類別不同劃分為 非 還 原 型（EVM0004732、EVM0003759、EVM0005880） 和 還 原 型 （EVM0005988、EVM0002563、EVM0006869）兩類。根據(jù)基因簇產(chǎn)物類型，大小和結(jié)構(gòu)組成，編號(hào)為3.3 的基因簇為ESC 生物合成關(guān)鍵基因簇，命名為ESCB 基因簇，核心PKS基因EVM0003759命名為ESCB1。

圖1 聚酮合酶結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Analysis of Elsino? arachidis polyketide synthases(PKS)proteins domains

2.2 ESCB基因簇功能分析

該基因簇位于基因組的3 516 380～3 563 171 bp位置，長(zhǎng)度約為47 kb，含有12 個(gè)編碼基因，分別命名為ESCB1～ESCB12（圖2）。以PKS 編碼基因?yàn)楹诵腫17～19]，包括超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（major facilitator superfamily transporter，MFS）編碼基因[6]，鋅指轉(zhuǎn)錄因子（zinc finger transcription factor）編碼基因[11]，細(xì)胞色素P450（cytochrome P450）編碼基因[20]，O-甲基轉(zhuǎn)移酶（o-methyltransferase）編碼基因[21]和單加氧酶編碼（monooxygenase）基因[22]等生物合成相關(guān)基因。

圖2 ESCB基因簇分布圖Fig.2 Distribution of the ESCB gene cluster

2.3 ESCB1基因克隆

以DNA 為模板，使用全長(zhǎng)引物ESCB1F/ ESCB1R 和長(zhǎng)鏈高保真酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳（圖3），獲得的清晰明亮PCR 條帶，測(cè)序分析后確定ESCB1基因全長(zhǎng)為6636 bp。

圖3 ESCB1基因PCR電泳圖Fig.3 PCR electrophoresis result of ESCB1 gene

2.4 ESCB1生物信息學(xué)分析

2.4.1 系統(tǒng)進(jìn)化分析 將ESCB1基因編碼蛋白與柑橘瘡痂病菌（Elsino? australis）、柳樹瘡痂病菌（Sphaceloma murrayae）、竹黃菌（Shiraiasp.）等真菌編碼的聚酮合酶編碼蛋白進(jìn)行相似性分析。結(jié)果顯示，ESCB1 蛋白與E.australis的Eapks 蛋白及S.murrayae的CQ-2017a 蛋白親緣關(guān)系最近（圖4），相似性為91%（圖5）。Eapks 和CQ-2017a 均參與ESC生物合成，因此，初步認(rèn)為ESCB1基因參與花生瘡痂病菌ESC的生物合成。

圖4 ESCB1系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree of ESCB1

圖5 ESCB1基因編碼蛋白與其他蛋白序列對(duì)比分析Fig.5 Amino acid sequences of ESCB1 and other protein

2.4.2 開放閱讀框、外顯子和內(nèi)含子分析 利用ORF Finder 對(duì)ESCB1基因進(jìn)行分析，ESCB1基因具有一個(gè)完整的開放閱讀框（圖6）。該基因編碼長(zhǎng)度為2212 個(gè)氨基酸的蛋白序列。利用在線分析工具Softberry 對(duì)ESCB1基因全長(zhǎng)的外顯子和內(nèi)含子進(jìn)行預(yù)測(cè)，并與cDNA 進(jìn)行序列對(duì)比。結(jié)果顯示，ESCB1基因包含4個(gè)外顯子區(qū)域及3個(gè)內(nèi)含子區(qū)域。

圖6 ESCB1基因ORF分析Fig.6 ORF analysis of ESCB1

2.4.3 編碼蛋白結(jié)構(gòu)域分析 利用IntroPro 在線分析網(wǎng)站對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，ESCB1基因編碼蛋白包括長(zhǎng)度為240 個(gè)氨基酸的啟動(dòng)單元（SAT），434 個(gè)氨基酸的KS，301 個(gè)氨基酸的AT，316個(gè)氨基酸的DH，長(zhǎng)度分別為77 個(gè)氨基酸和75 個(gè)氨基酸的ACP以及253個(gè)氨基酸的TE（圖1）。

2.4.4 蛋白理化性質(zhì)分析及親疏水性 利用Prot-Param 對(duì)ESCB1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，編碼蛋白包含2212 個(gè)氨基酸，分子量為238.84 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）5.65。推測(cè)該蛋白分子式為C10594H16718N2890O3240S76，原子總數(shù)為33 518。該蛋白脂溶性系數(shù)為86.92，不穩(wěn)定系數(shù)（Ⅱ）為41.44，親水性系數(shù)（GRAVY）為-0.144。親疏水性結(jié)果分析表明（圖7），ESCB1編碼蛋白在643 位的I 有最大值為2.333，在2015 位的E 有最小值為-2.789，親水性最強(qiáng)，多肽鏈表現(xiàn)出親水性。

圖7 ESCB1基因編碼蛋白親疏水性Fig.7 Hydrophilicity of ESCB1 protein

2.4.5 編碼蛋白磷酸化位點(diǎn)分析及亞細(xì)胞定位利用NetPhos 3.1 Server 在線工具軟件對(duì)ESCB1基因編碼蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該蛋白含有多個(gè)可被磷酸化氨基酸殘基，說明該蛋白可被激酶磷酸化后發(fā)揮作用（圖8）。利用亞細(xì)胞定位在線分析工具分析，ESCB1 蛋白定位在細(xì)胞葉綠體中。

圖8 ESCB1蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.8 prediction of ESCB1 protein phosphorylation sites

2.4.6 編碼蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu) 根據(jù)分析結(jié)果可知ESCB1基因編碼蛋白含有的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋和無規(guī)卷曲是蛋白酶中的主要結(jié)構(gòu)元件占總蛋白的73.72%，而β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈則散布于整個(gè)蛋白中（圖9A）。利用在線Swiss-model 分析工具發(fā)現(xiàn)ESCB1基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與Cercosporin合成相關(guān)基因CTB1基因編碼的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)覆蓋率為56.68%。以該蛋白晶體結(jié)構(gòu)作為模板，構(gòu)建了三維結(jié)構(gòu)模型如圖9B所示。

圖9 ESCB1基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（A）和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（B）Fig.9 Secondary structure(A)and tertiary structure(B)prediction of ESCB1 coding protein

2.4.7 蛋白信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用在線工具分析ESCB1 蛋白是否存在信號(hào)肽（SPI）及信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)（CS），結(jié)果顯示編碼蛋白不存在Sec/SPI結(jié)構(gòu)與CS，說明蛋白可能是非分泌蛋白，主要分布于細(xì)胞內(nèi)。使用在線工具預(yù)測(cè)ESCB1基因跨膜結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果可知，ESCB1基因編碼蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，該蛋白質(zhì)為非膜蛋白。

2.4.8ESCB1表達(dá)分析 前期光生物學(xué)研究證實(shí)E.arachidis中ESC的生物合成在光照和黑暗條件下具有顯著差異[23]，光照條件下菌落為紅色，周圍產(chǎn)生紅色暈圈，產(chǎn)毒量為54 nmol/plug，黑暗條件下菌落為淡黃色，未檢測(cè)到毒素的合成。為進(jìn)一步明確ESCB1是否參與ESC 的生物合成，分別檢測(cè)該基因在光照和黑暗條件下的mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果表明，光照條件下ESCB1的表達(dá)量為黑暗對(duì)照的3.24倍，且表達(dá)模式與毒素在光暗條件下的變化趨勢(shì)相同（圖10）。

3 結(jié)論與討論

基因組挖掘是以基因簇序列為指導(dǎo)預(yù)測(cè)次生代謝產(chǎn)物的一種新型生物信息學(xué)分析方法，同時(shí)還能直接將次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與合成途徑關(guān)聯(lián)，方便進(jìn)行生物合成和組合生物合成研究等[24,25]。AntiSMASH 是微生物次生代謝產(chǎn)物生物合成基因簇預(yù)測(cè)及組成結(jié)構(gòu)分析網(wǎng)站，可以在整個(gè)基因組范圍內(nèi)進(jìn)行PKS 及NRPS 基因簇篩選，對(duì)基因簇組成結(jié)構(gòu)和產(chǎn)物進(jìn)行初步分析和預(yù)測(cè)，為解析生物合成途徑提供理論基礎(chǔ)。真菌次生代謝產(chǎn)物生物合成基因一般在基因組中緊密成簇，稱為次生代謝產(chǎn)物生物合成基因簇[5]。如C.nicotianae和Ustilaginoidea virens等真菌中Cercosporin 和Ustilaginoidins 生物合成相關(guān)基因均成簇存在，組成CTB 基因簇和Ugs基因簇，大量研究解析了基因簇的組成及相關(guān)基因功能，極大促進(jìn)了病菌致病機(jī)制領(lǐng)域的研究進(jìn)展[7,20]。本研究在全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)E.arachidis基因組中含有6 條與次生代謝密切相關(guān)的PKS 和PKSNRPS 基因簇，通過生物信息學(xué)分析，挖掘出ESC 生物合成ESCB 基因簇。該基因簇上包含PKS 編碼基因，MFS 編碼基因，鋅指轉(zhuǎn)錄因子編碼基因等12 個(gè)預(yù)測(cè)功能基因，但基因簇中各基因的生物學(xué)功能尚需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

目前研究表明，ESC 毒素在E.fawcettii中經(jīng)由PKS 途徑生物合成，但基因簇中各編碼基因的功能尚未完全解析。本文通過基因克隆、同源聚類和生物信息學(xué)分析，E.arachidis中PKS 編碼基因ESCB1與Cercosporin 和Hypocrellin 生物合成PKS編碼基因CTB1和SbaPKS高度同源[18,19]，初步認(rèn)為ESCB1基因是花生瘡痂病菌中ESC 生物合成的關(guān)鍵編碼基因，并得到了ESCB1基因的序列全長(zhǎng)、結(jié)構(gòu)域和磷酸位點(diǎn)等大量分子信息，為該基因功能的深入研究提供了分子數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，本文進(jìn)一步開展了毒素含量與表達(dá)量相關(guān)性研究，結(jié)果表明，ESCB1表達(dá)量與ESC 含量趨勢(shì)基本相同，且受光照正向調(diào)控，調(diào)控模式與C.nicotianae相似[19]，但與Aspergillus nidulans光調(diào)控模式不同[26]，說明PKS 編碼基因在不同真菌中雖然生物功能類似，但調(diào)控表達(dá)模式差異較大，因此，為了明確花生瘡痂病菌毒素生物合成途徑及致病機(jī)制，應(yīng)進(jìn)一步開展ESCB1基因功能、基因簇解析及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究工作。