樊 杰，郝祥蕊，吳小珍，李 慧，張紅艷，馮鎮(zhèn)泰

(上海農(nóng)樂生物制品股份有限公司，上海 201419）

桑葉在我國種植面積十分廣闊，其具有非常高的營養(yǎng)與應(yīng)用價(jià)值。經(jīng)權(quán)威機(jī)構(gòu)檢測，新鮮的桑枝葉蛋白質(zhì)含量在12.8%～28%之間，干桑葉粉中粗蛋白質(zhì)的含量也在10.6%以上，且氨基酸種類齊全，維生素含量也十分豐富，同時(shí)還含有許多生物活性成分。國內(nèi)外學(xué)者對桑葉飼用的研究十分廣泛。發(fā)酵后的桑葉貯藏時(shí)間明顯加長且營養(yǎng)物質(zhì)顯著增加，而有毒物質(zhì)被大量消除，提升了飼料品質(zhì)和口感。研究發(fā)現(xiàn)，采用菌種協(xié)同發(fā)酵處理，可以提高植物飼料的蛋白含量和營養(yǎng)品質(zhì)。桑葉經(jīng)發(fā)酵后，粗纖維等難以吸收的大分子物質(zhì)含量顯著降低，利于動(dòng)物吸收的小分子營養(yǎng)物質(zhì)等顯著升高，同時(shí)，桑葉中的生物活性物質(zhì)的含量及組成也得到了修飾和優(yōu)化，極大地改善了動(dòng)物的適口性。目前市面上蛋白桑發(fā)酵劑品種很多，從功用上分為乳酸菌發(fā)酵劑和復(fù)合發(fā)酵劑。復(fù)合發(fā)酵劑含有多種益生霉菌（米曲霉、黑典霉)、軟酸菌(植物乳酸菌、干酪乳酸菌、嗜酸乳酸菌等)和酵母菌，可產(chǎn)生多種消化酶，降低桑葉中的粗纖維含量，從而增加了桑葉飼料中的粗蛋白質(zhì)含量。徐丹等發(fā)現(xiàn)，混合發(fā)酵桑葉粗蛋白含量有明顯提升，增加了23.26%。葉添梅等采用固態(tài)發(fā)酵桑葉粉的方法，發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量達(dá)到27.22%。

Plackett-Burman 是一種基于非完全平衡塊原理的近飽和的兩水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。通過N 次試驗(yàn)最多可以考察N-1 個(gè)因素，用最少試驗(yàn)次數(shù)可以從眾多因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)主效因子，響應(yīng)面分析是利用統(tǒng)計(jì)學(xué)和數(shù)學(xué)模型的方法對需要優(yōu)化的多因素系統(tǒng)進(jìn)行建模和分析，Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)是其中擬合模型之一，目前常被用于生物發(fā)酵過程培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化。由于多種菌混合培養(yǎng)，易出現(xiàn)污染、混菌比例難控制等問題，而枯草芽孢桿菌被允許用于動(dòng)物養(yǎng)殖，應(yīng)用其進(jìn)行試驗(yàn)可以避免這些問題因擾。因此，本研究選擇實(shí)驗(yàn)室已鑒定出的枯草芽孢桿菌發(fā)酵桑葉，利用響應(yīng)面法摸索發(fā)酵工藝和發(fā)酵條件，提高蛋白含量，為飼料桑產(chǎn)業(yè)的后續(xù)開發(fā)，桑蛋白的利用提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及主要試劑

1.1.1 桑葉 2021 年8 月在上海農(nóng)樂生物制品股份有限公司試驗(yàn)桑園采摘桑葉（品種為‘ 豐馳?！?。挑選大小勻稱、無明顯病蟲害的葉片，用清水沖洗干凈，自然晾干表面水分后去除葉柄，在55 ℃下干燥24 h，利用粉碎機(jī)粉碎后過80 目篩，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試菌株 枯草芽孢桿菌hij158(Bacillus subtilis)，由本實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

1.1.3 種子液培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3.0 g，骨蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，加蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH 值至7.0～7.2)。

1.2 發(fā)酵種子液的制備

選取直徑約為3 mm 的菌落進(jìn)行平板劃線，28 ℃過夜培養(yǎng)，選擇單菌落挑取1 環(huán)至裝有50 mL 培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL）中，200 r·min，培養(yǎng)18 h，制成菌株種子液，測定其菌落形成單位（CFU），該種子液CFU 為5×10個(gè)·mL。

1.3 桑葉發(fā)酵的基礎(chǔ)方法

在100 mL 三角瓶中加入20 g 粉碎后的桑葉粉，將不同的營養(yǎng)成分加入蒸餾水中進(jìn)行溶解，然后將桑葉粉與上述溶液進(jìn)行混合，混合比例根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求進(jìn)行，121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后，接入適量的種子液，攪拌混勻后進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵條件及各成分比例根據(jù)試驗(yàn)要求進(jìn)行設(shè)計(jì)。

1.4 粗蛋白質(zhì)的測定

參照GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定凱氏定氮法》測定氮含量，相關(guān)結(jié)果乘以蛋白質(zhì)折算系數(shù)6.25，計(jì)算粗蛋白含量。

1.5 桑葉發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化試驗(yàn)

1.5.1 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，利用PB 設(shè)計(jì)對影響桑葉發(fā)酵后粗蛋白含量的11 個(gè)因素進(jìn)行篩選，包括蔗糖（A）、檸檬酸鈉（B）、硫酸銨（C）、磷酸氫二鉀（D）、磷酸二氫鉀（E）、硫酸鎂（F）、發(fā)酵時(shí)間（G）、發(fā)酵溫度（H）、pH 值（I）、接種量（J）、料水比（K）。各因素設(shè)置高（+1）和低（-1）2 個(gè)水平。共設(shè)計(jì)12 組測試，每組3 個(gè)重復(fù)，響應(yīng)值為發(fā)酵后測得的粗蛋白含量。根據(jù)各因素的貢獻(xiàn)率大小進(jìn)行顯著因素篩選，選擇效果更顯著的因素進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.5.2 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)PB 試驗(yàn)篩選出的因素，以各因素的正負(fù)效應(yīng)、大小進(jìn)行爬坡試驗(yàn)，確定中心點(diǎn)，得到最大響應(yīng)值。

1.5.3 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 最陡爬坡試驗(yàn)所得最佳響應(yīng)區(qū)域作為Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，各因素取3 個(gè)水平，以（-1，0，1）表示，設(shè)計(jì)包括了5 個(gè)中心點(diǎn)（0，0，0），共17 個(gè)組合的響應(yīng)面試驗(yàn)。各處理3 次重復(fù)。

1.6 結(jié)果驗(yàn)證和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行方差分析，并擬合線性回歸方程，檢驗(yàn)擬合方程的符合程度；利用擬合方程獲得最佳培養(yǎng)條件，并在最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。數(shù)據(jù)處理和作圖使用Excel 2016，統(tǒng)計(jì)分析使用Design Experts 10 和IBMSPSS 22。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)

在Plackett-Burman 設(shè)計(jì)試驗(yàn)中，12 個(gè)組的粗蛋白含量在183.1～226.8 mg·g，通過統(tǒng)計(jì)軟件分析確定最優(yōu)配方組合及條件為組合2，此時(shí)發(fā)酵條件為蔗糖8%、檸檬酸鈉1%、硫酸銨1%、磷酸二氫鉀0.1%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、發(fā)酵時(shí)間10 d、發(fā)酵溫度28 ℃、初始pH 值為8、接種量為15%、桑葉粉與混合溶液質(zhì)量體積比為1∶0.5(W/V)，在此條件下發(fā)酵得到的粗蛋白含量為226.8 mg·g（表1）。

表1 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)各因素得編碼值及試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可以看出，硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、發(fā)酵時(shí)間、接種量對提高桑葉發(fā)酵后粗蛋白含量具有正效應(yīng)，蔗糖、檸檬酸鈉、硫酸鎂、溫度、pH值、料水比具有負(fù)效應(yīng)。影響因素最大的分別為溫度、硫酸銨和蔗糖。發(fā)酵溫度顯著影響菌種的生長速度，提供充足的碳源和氮源能顯著促進(jìn)菌株的生長。

表2 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平表

由表3 可以看出，根據(jù)9 個(gè)因素（分別為蔗糖質(zhì)量濃度、檸檬酸鈉質(zhì)量濃度、硫酸銨質(zhì)量濃度、硫酸鎂質(zhì)量濃度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、料水比）預(yù)測的線性模型具有極顯著性（P＜0.01），表明該模型擬合度較高，可信度大于99%。其中相關(guān)系數(shù)R為0.9989，校正決定系數(shù)R為0.994 0，說該模型能解釋99.89%出現(xiàn)的變化。根據(jù)Plackett-Burman 設(shè)計(jì)以及顯著性方差分析得出，在11 個(gè)因素中發(fā)酵溫度、硫酸銨濃度和蔗糖濃度對桑葉發(fā)酵結(jié)束后粗蛋白含量影響最大，因此選擇這3 個(gè)因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

表3 采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)篩選影響粗蛋白含量的重要顯著因素

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)確定因素水平

由Plackett-Burman 設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，蔗糖、硫酸銨、溫度對桑葉發(fā)酵影響最顯著，故選取這3 個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，將其他因素固定在最佳水平，采用最陡爬坡試驗(yàn)的方法，對蔗糖（A）、硫酸銨（C）、溫度（H）3 個(gè)因素在各自合適的方向上進(jìn)行最陡爬坡，以獲得這3 個(gè)因素的最佳中心點(diǎn)。根據(jù)這3 個(gè)因素的效應(yīng)大小比較設(shè)定它們的變化方向和步長，由表4 可知，當(dāng)蔗糖添加量為6%、硫酸銨1.5%、溫度為30 ℃時(shí)，粗蛋白含量最高為241.3 mg·g。故Box-Behnken design 試驗(yàn)選擇以第3 組的條件作為中心點(diǎn)。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果

2.3 Box-Behnkendesign試驗(yàn)篩選主要因素的最優(yōu)水平

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)Box-Behnken design 試驗(yàn)的因素和水平。蔗糖濃度分別設(shè)置7%，6%，5%作為高、中、低水平；硫酸銨濃度分別設(shè)置2%，1.5%，1%作為高、中、低水平；溫度分別設(shè)置33，30，28℃作為高、中、低水平，具體設(shè)計(jì)情況見表5。根據(jù)Box-Behnken design 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可以分為2 類：一是析因點(diǎn)；二是零點(diǎn)。零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5 次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。由表5 可知，Box-Behnken design 設(shè)計(jì)的17 組試驗(yàn)中，粗蛋白含量的變化范圍為206.8～257.5 mg·g；零點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)中，粗蛋白含量值范圍為255.8～257.5 mg·g；第1 組試驗(yàn)檢測到最大值257.5 mg·g，此時(shí)蔗糖濃度為6%，硫酸銨濃度為1.5%，溫度為30 ℃。經(jīng)回歸擬合后，試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響可以用以下回歸方程表示：

式中，Y 表示預(yù)測的粗蛋白含量；A、C、H 分別代表蔗糖濃度、硫酸銨濃度和發(fā)酵溫度的編碼值。結(jié)果顯示，不同處理的預(yù)測結(jié)果和測試結(jié)果有一定偏差，但相差不多，表明該預(yù)測模型較為準(zhǔn)確（表5）。

表5 Box-Behnken 設(shè)計(jì)中各變量水平及檢測值

以發(fā)酵后粗蛋白含量為響應(yīng)值，對該模型進(jìn)行顯著性方差分析。結(jié)果表明，該模型差異極顯著（P＜0.01），能夠?qū)阧ij158 發(fā)酵桑葉后粗蛋白含量進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測。R為0.974 8，校正決定系數(shù)R為0.940 4，兩者間誤差較小。3 個(gè)因素對響應(yīng)值的影響順序?yàn)椋簻囟龋玖蛩徜@＞蔗糖，且3 者對粗蛋白含量的影響均極顯著（表6）。

表6 根據(jù)響應(yīng)面二次模型對影響粗蛋白含量的因素進(jìn)行方差分析

三維響應(yīng)面因素和響應(yīng)值所構(gòu)成的曲面圖，直觀地展示出不同因素交互作用對響應(yīng)值的影響和變化范圍。利用回歸方程繪制粗蛋白含量隨各因素變化的二維等高線圖和三維響應(yīng)面圖（圖1）。三維響應(yīng)面和二維等高線圖可以看出溫度對粗蛋白含量的影響要大于蔗糖和硫酸銨，但兩因素之間不存在明顯的相互作用，即其中一個(gè)因素對粗蛋白含量的影響作用并不會(huì)隨著另一個(gè)因素的變化而變化。

圖1 雙因素互作對粗蛋白含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.4 優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)試驗(yàn)?zāi)Ｐ图皟?yōu)化結(jié)果的可靠性，對預(yù)測的優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)過3 次重復(fù)測試，每次設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，粗蛋白含量均值為246.8 mg·g，與預(yù)測值256.6 mg·g接近，較優(yōu)化前157.5 mg·g提高了1.57 倍。此時(shí)最佳發(fā)酵條件為：蔗糖6%、檸檬酸鈉0.5%、硫酸銨1.5%、磷酸二氫鉀0.2%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.05%、發(fā)酵時(shí)間10d、發(fā)酵溫度30℃、初始pH 值為8、接種量為15%、桑葉粉與混合溶液質(zhì)量體積比為1∶0.5(W/V)。綜上所述，回歸方程能夠在一定范圍內(nèi)反映各因素對菌株hij158 發(fā)酵桑葉后粗蛋白含量的影響，應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基以提高桑葉發(fā)酵后粗蛋白含量的方案切實(shí)可行，使用的模型能夠準(zhǔn)確預(yù)測發(fā)酵最終粗蛋白含量。

3 結(jié)論與討論

桑樹是我國列入飼料目錄的作物，是一種開發(fā)前景十分廣闊的飼料，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，其粗蛋白含量較高，可用于填補(bǔ)我國蛋白飼料資源匱乏的缺口。因此，粗蛋白含量是評價(jià)飼料品質(zhì)和桑樹品種的重要指標(biāo)。丁佐龍對安徽的7 個(gè)桑樹品種進(jìn)行了桑葉粗蛋白測定，其含量分布在16.8%～23.02%；鄭莎等測定了45 個(gè)桑資源，其粗蛋白含量分布在13.61%～24.97%之間。粗蛋白含量除了與品種有關(guān)，還與季節(jié)、水肥管理、葉位相關(guān)，因此，本研究選用了樹齡相同，同時(shí)保證在相對一致的栽培條件下來評價(jià)發(fā)酵桑葉的粗蛋白含量。

利用微生物發(fā)酵技術(shù)，能顯著改善飼料的品質(zhì)，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫功能、促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)的微生態(tài)平衡，從而提高動(dòng)物抗病能力，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。桑葉經(jīng)過微生物發(fā)酵后，發(fā)酵菌種可以分泌豐富的酶類以及各種活性物質(zhì)，將一些難以消化分解的大分子物質(zhì)降解成易于消化的蛋白質(zhì)和游離氨基酸，一些微生物能通過不同的生理活動(dòng)將非蛋白氮化為菌體蛋白，提高真蛋白含量。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在玉米青貯飼料發(fā)酵過程中添加一定量枯草芽孢桿菌能夠顯著提高最終的粗蛋白含量。胡仁建等利用枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、啤酒酵母發(fā)酵桑葉，桑葉蛋白含量由14.7%提高至19.6%。任元元等利用植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、米曲霉按照1∶1∶1∶1 的添加比例進(jìn)行復(fù)合菌種發(fā)酵桑葉，桑葉蛋白含量由6.2%提高至17.2%。朱佳文等研究發(fā)現(xiàn)，添加枯草芽孢桿菌能夠使青貯桑葉中的粗蛋白含量顯著提高，而抗?fàn)I養(yǎng)因子、粗纖維和粗脂肪的含量有所下降，發(fā)酵品質(zhì)得到顯著改善?，F(xiàn)階段發(fā)酵桑葉使用的發(fā)酵菌種繁多，發(fā)酵工藝多樣，多種益生菌微生物復(fù)合發(fā)酵劑雖然比單菌劑有一定優(yōu)勢，但是多種菌混培養(yǎng)，易出現(xiàn)污染、混菌比例難控制等問題。如細(xì)菌的培養(yǎng)溫度一般為28～37 ℃、酵母菌的培養(yǎng)溫度為25～30 ℃、霉菌的培養(yǎng)溫度為25～28 ℃，不同菌的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間很難統(tǒng)一，微生物代謝過程很難做到精準(zhǔn)控制。選擇單一菌種發(fā)酵容易控制其生長曲線和代謝過程，芽孢桿菌是益生型細(xì)菌，具有良好的益生特性和熱穩(wěn)定性，在不良環(huán)境中具有非常強(qiáng)的抗逆性，許多研究表明，芽孢桿菌飼料添加劑對動(dòng)物生產(chǎn)具有有益的影響。利用芽孢桿菌發(fā)酵飼料的研究十分廣泛?？莶菅挎邨U菌能產(chǎn)生強(qiáng)抗逆性的孢子，具有耐熱、耐紫外、耐干燥的特性，無致病性，可以產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等多種酶類。我國農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的《飼料添加劑品種目錄（2013）》中寫明枯草芽孢桿菌可用于動(dòng)物飼料。

本研究選擇枯草芽孢桿菌進(jìn)行單菌種發(fā)酵，提高了發(fā)酵后桑蛋白含量，使用Design Experts 10 軟件結(jié)合Plackett-Burman 試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)以及Box-Behnken 試驗(yàn)優(yōu)化了桑葉發(fā)酵條件，測試的11個(gè)因素中，蔗糖質(zhì)量濃度、硫酸銨質(zhì)量濃度、發(fā)酵溫度顯著影響桑葉發(fā)酵后的蛋白含量（P＜0.05），影響大小順序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度＞硫酸銨質(zhì)量濃度＞蔗糖質(zhì)量濃度，確定最優(yōu)發(fā)酵條件為蔗糖質(zhì)量濃度為6%、硫酸銨1.5%、發(fā)酵溫度30 ℃，粗蛋白含量達(dá)到246.8 mg·g，較優(yōu)化前157.5 mg·g提高了1.57 倍。本研究對飼料桑產(chǎn)業(yè)的后續(xù)開發(fā)，桑蛋白的利用具有一定的借鑒意義。