于保青

(上海曉明檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司理化分析室，上海 201612)

硝磺草酮是由先正達(dá)公司于2001年研發(fā)上市的三酮類除草劑，其通過(guò)抑制雜草的羥基苯基丙酮酸酯雙氧化酶(HPPD)的活性而殺滅雜草，應(yīng)用于玉米、水稻、甘蔗等作物防除闊葉和禾本科雜草。硝磺草酮高效、殺草譜廣，是當(dāng)前應(yīng)用非常廣泛的一個(gè)除草劑品種[1]。硝基呫噸酮(圖1)是合成硝磺草酮過(guò)程中可能產(chǎn)生的1個(gè)雜質(zhì)，因該物質(zhì)的Ames試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，其對(duì)人類的健康有潛在的風(fēng)險(xiǎn)，所 以EFSA將其定為相關(guān)雜質(zhì)，規(guī)定在硝磺草酮原藥中限量最大值為2 mg/kg[2]。

圖1 硝基呫噸酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

關(guān)于硝磺草酮原藥中的硝基呫噸酮定量分析，王英等開(kāi)發(fā)了HPLC分析方法，其最低定量限(LOQ)較高為1.5 mg/kg，且該方法對(duì)基線要求較高[3]。李東等開(kāi)發(fā)的LCMS外標(biāo)定量法，根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，定量范圍約為2~50 mg/kg，LOQ等于EFSA規(guī)定的限量值[4]。硝磺草酮原藥的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(編號(hào)：GB29382—2012)[5]中描述的硝基呫噸酮用LCMS單點(diǎn)外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，方法中描述的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10 mg/kg，濃度高于EFSA規(guī)定的限量值，且如果樣品溶液中濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度相比差別較大時(shí)，則不能保證定量的準(zhǔn)確性。為確保產(chǎn)品生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定合格，生產(chǎn)企業(yè)在監(jiān)測(cè)生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性時(shí)，往往需要對(duì)遠(yuǎn)低于EFSA規(guī)定的限量值的濃度進(jìn)行定量。

根據(jù)生產(chǎn)企業(yè)的需要，本研究對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 29382—2012中的硝基呫噸酮的分析方法進(jìn)行了改進(jìn)，包括離子源類型、掃描模式、掃描離子對(duì)、流動(dòng)相中鹽的濃度、流速和定量方法，以期提高方法的靈敏度、擴(kuò)大定量范圍、提高分析效率，為生產(chǎn)企業(yè)檢測(cè)該雜質(zhì)提供方法參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Secix QTRAP 4500液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)AB Secix公司)；MS205DU電子分析天平(0.000 1 g，梅特勒-托利多)；BT25S電子分析天平(0.000 01 g，賽多利斯)和SK3300H超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；Milli-Q Direct8純水-超純水一體機(jī)(美國(guó)密理博公司)。

乙腈(色譜純，美國(guó)TEDIA公司)；乙酸銨(色譜純，上海麥克林生化科技有限公司)；超純水(純水-超純水一體機(jī)自制)。

硝基呫噸酮標(biāo)樣：含量為99.5%，購(gòu)于國(guó)家農(nóng)藥質(zhì)檢中心(沈陽(yáng))；硝磺草酮原藥樣品A：不含硝基呫噸酮，由上海泰禾化工有限公司技術(shù)研發(fā)中心提供；硝磺草酮原藥樣品B：含硝基呫噸酮，由上海泰禾化工有限公司技術(shù)研發(fā)中心提供。

1.2 樣品制備

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取0.005 g (精確至0.000 01 g)硝基呫噸酮標(biāo)樣于25 mL容量瓶中，加入少量乙腈后超聲，使標(biāo)樣充分溶解，冷卻至室溫，用乙腈定容至刻度，搖勻，命名為儲(chǔ)備液A；移取0.25 mL儲(chǔ)備液A至50 mL容量瓶，用乙腈稀釋定容得濃度為1 mg/L溶液，命名為儲(chǔ)備液B。用乙腈逐級(jí)稀釋儲(chǔ)備液B，得到濃度為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5 mg/L的硝基呫噸酮溶液。

1.2.2 樣品溶液的制備

稱取硝磺草酮樣品約0.5 g (精確到0.000 01 g)于10 mL刻度試管內(nèi)，加入適量乙腈溶解并稀釋至5 mL，混勻，過(guò)微孔濾膜待用。

1.3 儀器分析條件

1.3.1 液相色譜條件

液相色譜柱：GL Sciences Inert Sustain 150 mm× 4.6 mm，5 μm；柱溫：40 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：5.0 μL；流動(dòng)相：乙腈:1 mM/L乙酸銨水溶液=50∶50 (體積比)；運(yùn)行時(shí)間：6 min；硝基呫噸酮保留時(shí)間約為4.8 min。典型色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 硝基呫噸酮的MRM (345.0/235.1)提取離子色譜圖

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離源模式：ESI離子源；掃描方式：MRM 正離子；離子源電壓：5 500 V；離子源溫度：500 ℃；Curtain Gas：40 Psi；Gas 1：50 Psi；Gas 2：50 Psi；轉(zhuǎn)換閥：0~4 min(進(jìn)入廢液)，4~6 min(進(jìn)入質(zhì)譜)。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.4 測(cè)定

在上述1.3節(jié)操作條件下，待儀器穩(wěn)定后先進(jìn)一針空白溶劑(乙腈)，再按照濃度從低到高的順序測(cè)定標(biāo)樣溶液，然后進(jìn)一針或更多空白溶劑(乙腈)以檢查液相及質(zhì)譜體系內(nèi)有無(wú)殘留干擾，而后進(jìn)空白樣品(樣品A)，最后測(cè)定精密度樣品溶液以及回收率樣品溶液。

1.5 計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

將精密度樣品溶液以及回收率樣品溶液的峰面積代入回歸方程，計(jì)算得到樣品的硝基呫噸酮濃度。試樣中硝基呫噸酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按下式計(jì)算： 式中：X為硝基呫噸酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；C為回收率/精密度樣品溶液中硝基呫噸酮的濃度，mg/L；V為回收率/精密度樣品溶液的體積，mL；m為回收率/精密度樣品的稱樣量，g；10-6為單位轉(zhuǎn)換系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器操作條件的改進(jìn)

在國(guó)標(biāo)GB29382—2012方法基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)行了以下條件改進(jìn)：⑴ ESI源代替了APCI源，因?yàn)閷?duì)于液質(zhì)聯(lián)用儀來(lái)說(shuō)，ESI源比APCI源使用頻度更高，更通用，可減少離子源的更換操作。⑵ 用正離子掃描模式代替國(guó)標(biāo)中的負(fù)離子掃描模式，因?yàn)橄趸鶇銍嵧谡x子模式下信號(hào)響應(yīng)明顯高于負(fù)離子模式。試驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法的LOQ為0.1 mg/kg，與文獻(xiàn)的1.5 mg/kg相比，靈敏度提高了15倍比。⑶ 選擇了2個(gè)掃描離子對(duì)，1個(gè)用于定量，2個(gè)用于定性。與國(guó)標(biāo)方法只有1個(gè)離子對(duì)進(jìn)行定性定量相比，2個(gè)離子定性可更多地排除干擾物質(zhì)，使方法的特異性更好。⑷ 將國(guó)標(biāo)規(guī)定的流動(dòng)相中乙酸銨水溶液濃度由5 mM/L下調(diào)到1 mM/L，原因是流動(dòng)相中的乙酸銨有助于硝基呫噸酮與硝磺草酮在色譜柱上進(jìn)行很好的分離，從而將樣品中大量的硝磺草酮切到廢液中而避免其進(jìn)入質(zhì)譜產(chǎn)生系統(tǒng)污染的風(fēng)險(xiǎn)。但是流動(dòng)相溶液中較高濃度的乙酸銨在正離子模式下對(duì)信號(hào)會(huì)有顯著的抑制作用。在綜合考慮下，本方法采用乙酸銨水溶液的濃度為1 mM/L。⑸ 將國(guó)標(biāo)中的0.5 mL/min流速調(diào)到1.0 mL/min。流速提高有助于縮短分析時(shí)間。國(guó)標(biāo)中的分析時(shí)間為10 min，目標(biāo)物出峰時(shí)間為7.2 min；本研究的分析時(shí)間為6 min，目標(biāo)物出峰時(shí)間為4.8 min。分析時(shí)間節(jié)省了4 min。⑹ 采用標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)定量法代替國(guó)標(biāo)中的單點(diǎn)外標(biāo)定量。考慮到標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距通常不為零，一般樣品溶液與標(biāo)樣溶液的濃度相比偏差超出±20%時(shí)，單點(diǎn)外標(biāo)定量法不再適應(yīng)。本研究標(biāo)準(zhǔn)曲線的高低濃度范圍是200倍，比單點(diǎn)的范圍更寬。當(dāng)樣品中目標(biāo)物的濃度未知時(shí)，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量更適合。

2.2 專屬性試驗(yàn)

在1.3節(jié)分析條件下，分別進(jìn)樣溶劑(乙腈)、空白樣品(樣品A)、硝基呫噸酮標(biāo)樣和樣品B，以檢查在目標(biāo)峰保留時(shí)間及其附近是否有干擾峰出現(xiàn)。結(jié)果以上樣品在目標(biāo)峰的保留時(shí)間及其附近均無(wú)干擾峰出現(xiàn)。

2.3 線性試驗(yàn)

以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：硝基呫噸酮質(zhì)量濃度為0.005~1 mg/L時(shí)，線性回歸方程為y=322 219x+ 1 454.3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。符合r>0.99的要求[6]。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3。

圖3 硝基呫噸酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

稱取約0.5 g不含硝基呫噸酮的硝磺草酮原藥(樣品A)，加入適量乙腈溶解，加入一定量的硝基呫噸酮標(biāo)準(zhǔn)品，使其添加濃度分別為0.1、2、5 mg/kg，稀釋至5 mL，每個(gè)濃度配置2個(gè)平行樣品。在上述1.3色譜條件下測(cè)定其含量，計(jì)算硝基呫噸酮的回收率平均值為86%~100%。根據(jù)準(zhǔn)則要求，當(dāng)雜質(zhì)含量<0.1%時(shí)，回收率應(yīng)為75%~125%[6]。根據(jù)測(cè)試結(jié)果，添加回收率滿足準(zhǔn)則要求。回收率數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 硝基呫噸酮回收率測(cè)定結(jié)果

2.5 精密度試驗(yàn)

對(duì)硝磺草酮樣品B中的硝基呫噸酮進(jìn)行6次平行測(cè)定，測(cè)得硝基呫噸酮含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.022，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.30%。根據(jù)霍維茨方程相對(duì)偏差應(yīng)小于11.36% (%RSDr=2(1-0.5log0.00000068)×0.67=11.36)[6]。由測(cè)定結(jié)果可知，精密度滿足準(zhǔn)則要求。精密度數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3 硝基呫噸酮精密度測(cè)定結(jié)果

2.6 最低定量限(LOQ)

10 μg/L的硝基呫噸酮的標(biāo)樣的信噪比為11，大于10倍信噪比[6]。其濃度折合到硝磺草中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 mg/kg，且該濃度的回收率符合要求。因此0.1 mg/kg濃度適合作為該方法的LOQ。

3 結(jié) 論

本方法在綜合文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上對(duì)國(guó)標(biāo)GB 29382—2012中的硝基呫噸酮的分析方法進(jìn)行了改進(jìn)，包括采用的離子源類型、掃描的極性、掃描的離子對(duì)、流動(dòng)相中乙酸銨的濃度、流速以及將單點(diǎn)外標(biāo)定量改為標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)定量。

改進(jìn)后的方法擴(kuò)大了定量范圍，縮短了分析時(shí)間，提高了分析效率。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，該方法專屬性良好，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度高，線性范圍廣，適合用于硝磺草酮中硝基呫噸酮的定量分析。該方法可為生產(chǎn)企業(yè)檢測(cè)該雜質(zhì)提供方法參考。