劉亞倩，許海燕，王 珊，任曉東

(1.陜西國際商貿學院醫(yī)藥學院，陜西 西安 712046；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710061)

鼠尾藻(Sargassumthunbergii)為褐藻門馬尾藻科的一種植物，主要分布在我國遼寧、山東、江浙一帶[1-2]。鼠尾藻營養(yǎng)豐富，藥用與保健價值較高，是優(yōu)質的天然餌料，在醫(yī)藥、化工、廢水處理等領域都有廣泛應用[3-6]。鼠尾藻多糖具有降血糖、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用[7-8]。鼠尾藻多糖的提取多采用超聲提取法或微波提取法[9-10]，而超聲-微波聯用技術具有溶劑用量少、提取時間短、提取率高等特點，應用于中藥有效成分提取具有更大的優(yōu)勢[11-12]。鑒于此，作者采用超聲-微波聯用技術提取鼠尾藻多糖，通過單因素實驗及響應面實驗優(yōu)化提取工藝，并通過測定鼠尾藻多糖對DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力，評價其抗氧化活性，擬為鼠尾藻的開發(fā)應用提供依據。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

鼠尾藻(100目)，山東省長島鴻利餌料有限公司。

D-葡萄糖標準品、維生素C(VC)標準品、ABTS、DPPH，上海源葉生物科技有限公司。

TU-1950型雙光束紫外分析儀，北京普析通用儀器有限公司；XH-300A型電腦微波超聲波組合合成萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；LGJ-12D型冷凍干燥機，北京四環(huán)起航科技有限公司。

1.2 鼠尾藻多糖的提取[13]

稱取適量100目鼠尾藻粉末，按液料比8∶1(mL∶g,下同)加入95%乙醇，于70 ℃下連續(xù)回流提取4 h；過濾，將濾渣低溫干燥，去除脂類及色素等雜質后用萬能粉碎機粉碎，置于具塞錐形瓶中，加入適量純化水，置于電腦微波超聲波組合合成萃取儀內，設置時間、溫度、超聲功率、微波功率等參數進行提??；提取液經抽濾后，采用Sevage法去除蛋白[14]；按體積比2∶1向提取液中加入氯仿-正丁醇(5∶1，體積比)混合液，混合后振搖30 min，4 000 r·min-1離心5 min，上清液即為鼠尾藻多糖提取液。

1.3 鼠尾藻多糖提取率的測定

1.3.1 D-葡萄糖標準曲線的繪制

精密稱取D-葡萄糖標準品0.010 8 g，加純化水溶解后移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，得濃度為0.108 mg·mL—1的D-葡萄糖標準溶液。參照文獻[15]分別精密移取D-葡萄糖標準溶液0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL置于25 mL容量瓶中，加入純化水至2 mL，混勻；加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻；快速滴加濃硫酸5 mL，充分搖勻；靜置10 min后，于40 ℃水浴保溫20 min，冷卻至室溫，測定490 nm處吸光度。以2 mL純化水加入相應的試劑作為空白。以D-葡萄糖濃度(c)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線，擬合得線性回歸方程為：A=0.0545c+0.2303，R2=0.9996。表明D-葡萄糖濃度在1.35～20.25 μg·mL—1范圍內與吸光度線性關系良好。

1.3.2 鼠尾藻多糖提取率的計算

稱取鼠尾藻粉末1.000 0 g，按1.2方法制備鼠尾藻多糖提取液；精密量取2 mL提取液于100 mL容量瓶中，加純化水定容至刻度，即得鼠尾藻多糖樣品溶液。取樣品溶液，按1.3.1方法測定吸光度，按式(1)計算鼠尾藻多糖提取率：

(1)

式中：c為經標準曲線方程計算得到的多糖濃度，μg·mL—1；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數；m為鼠尾藻粉末質量，g。

1.4 超聲-微波聯用提取工藝優(yōu)化

1.4.1 單因素實驗[16-17]

分別考察提取時間(15 min、30 min、45 min、60 min、75 min)、微波功率(150 W、250 W、350 W、450 W、550 W)、超聲功率(200 W、250 W、300 W、350 W、400 W)、液料比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1)對鼠尾藻多糖提取率的影響。

1.4.2 響應面實驗

在單因素實驗的基礎上，以鼠尾藻多糖提取率為響應值，采用Design-Expert軟件，通過Box-Behnken設計4因素3水平響應面實驗，進一步優(yōu)化鼠尾藻多糖的超聲-微波聯用提取工藝。

1.5 抗氧化活性評價

1.5.1 DPPH自由基清除率的測定

參照文獻[18]配制0.2 mmol·L—1的DPPH自由基溶液。取2 mL不同濃度的鼠尾藻多糖提取液，加入2 mL DPPH自由基溶液，混勻，置于暗室充分反應30 min，測定517 nm處吸光度，重復測定3次，取平均值；以VC為陽性對照。按式(2)計算DPPH自由基清除率，再通過SPSS軟件計算半數清除率(IC50)。

(2)

式中：A0為2 mL DPPH自由基溶液+2 mL無水乙醇的吸光度；A1為2 mL鼠尾藻多糖提取液+2 mL無水乙醇的吸光度；A2為2 mL DPPH自由基溶液+2 mL鼠尾藻多糖提取液的吸光度。

1.5.2 ABTS自由基清除率的測定

參照文獻[19]配制7 mmol·L—1的ABTS自由基溶液及140 mmol·L—1的過硫酸鉀溶液。將5 mL 7 mmol·L—1ABTS自由基溶液與88 μL 140 mmol·L—1過硫酸鉀溶液混勻，避光放置14 h，使用前加水稀釋至734 nm處吸光度為0.7左右，即得ABTS自由基工作液。

參照文獻[20]，取3 mL ABTS自由基工作液與1 mL無水乙醇混勻，振蕩10 s后靜置30 min，作為對照組；將1 mL不同濃度的鼠尾藻多糖提取液與3 mL ABTS自由基工作液混勻，振蕩10 s后靜置6 min，測定734 nm處吸光度，重復測定3次，取平均值；以VC為陽性對照。按式(3)計算ABTS自由基清除率，再通過SPSS軟件計算IC50。

(3)

式中：A0為3 mL ABTS自由基工作液+1 mL無水乙醇的吸光度；A1為3 mL ABTS自由基工作液+1 mL鼠尾藻多糖提取液的吸光度。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取時間對鼠尾藻多糖提取率的影響(圖1)

由圖1可知，隨著提取時間的延長，鼠尾藻多糖提取率逐漸升高，當提取時間為30 min時，多糖提取率達到最高；繼續(xù)延長提取時間，由于超聲空化和機械力作用，多糖提取率反而降低。因此，選擇30 min為響應面實驗提取時間的中心點。

圖1 提取時間對鼠尾藻多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides from Sargassum thunbergii

2.1.2 微波功率對鼠尾藻多糖提取率的影響(圖2)

由圖2可知，隨著微波功率的增大，鼠尾藻多糖提取率逐漸升高，當微波功率為350 W時，多糖提取率達到最高；繼續(xù)增大微波功率，多糖提取率逐漸下降。這是由于，微波作用下鼠尾藻細胞破裂，多糖溶出，多糖提取率升高；當微波功率超過350 W后，由于高溫和高壓的作用，鼠尾藻內部出現凝固，抑制多糖溶出，多糖提取率反而降低。因此，選擇350 W為響應面實驗微波功率的中心點。

圖2 微波功率對鼠尾藻多糖提取率的影響Fig.2 Effect of microwave power on extraction rate of polysaccharides from Sargassum thunbergii

2.1.3 超聲功率對鼠尾藻多糖提取率的影響(圖3)

由圖3可知，隨著超聲功率的增大，鼠尾藻多糖提取率逐漸升高，當超聲功率為300 W時，多糖提取率達到最高；繼續(xù)增大超聲功率，多糖提取率逐漸下降。這是由于，隨著超聲功率的增大，超聲波機械作用力增強，細胞破壁加速，多糖溶出增多，多糖提取率相應升高；但超聲功率超過300 W后，多糖發(fā)生降解，多糖提取率反而下降。因此，選擇300 W為響應面實驗超聲功率的中心點。

圖3 超聲功率對鼠尾藻多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction rate of polysaccharides from Sargassum thunbergii

2.1.4 液料比對鼠尾藻多糖提取率的影響(圖4)

由圖4可知，隨著液料比的增大，即提取溶劑用量的增加，鼠尾藻多糖提取率逐漸升高，當液料比為25∶1時，多糖提取率達到最高；繼續(xù)增加提取溶劑用量，多糖提取率逐漸降低?？赡苁怯捎冢崛∪軇┯昧窟^多時，超聲波受到水的阻力及物質平衡原理抑制多糖溶出。因此，選擇25∶1為響應面實驗液料比的中心點。

圖4 液料比對鼠尾藻多糖提取率的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of polysaccharides from Sargassum thunbergii

2.2 響應面實驗結果

2.2.1 響應面實驗設計及結果(表1)

表1 響應面實驗設計及結果

對表1數據進行擬合，得到回歸模型方程為：Y=9.18+0.088A+0.053B+0.036C+0.080D-0.075AB+0.018AD+0.010BC-0.055BD-0.043CD-0.48A2-0.15B2-0.34C2-0.11D2。

回歸模型的方差分析見表2。

表2 方差分析

2.2.2 響應面分析

各因素交互作用對鼠尾藻多糖提取率影響的響應面圖及等高線圖如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對鼠尾藻多糖提取率影響的響應面圖及等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour plots for effect of interaction between various factors on extraction rate of polysaccharides from Sargassum thunbergii

由圖5可知，提取時間與微波功率、微波功率與液料比的響應曲面陡峭，且等高線圖呈橢圓，顯示二者之間交互作用強，對鼠尾藻多糖提取率的影響顯著，且提取時間的影響大于微波功率、液料比。

2.2.3 最佳工藝的確定及工藝驗證

根據回歸模型得到超聲-微波聯用提取鼠尾藻多糖的最佳工藝條件為：提取時間31.37 min、微波功率359.24 W、超聲功率301.65 W、液料比26.73∶1?？紤]實際操作的可行性，將最佳工藝調整為：提取時間31 min、微波功率359 W、超聲功率302 W、液料比27∶1，在此條件下進行3次驗證實驗，得到鼠尾藻多糖平均提取率為9.19%，與預測值(9.20%)的相對誤差為0.11%，說明優(yōu)化的提取工藝切實可行。

2.3 不同提取方法的比較

分別采用微波、超聲、超聲-微波聯用方法提取鼠尾藻多糖，結果見表3。

表3 不同提取方法的比較(n=3)

由表3可知，采用超聲-微波聯用方法提取鼠尾藻多糖，多糖提取率達到9.19%，明顯高于單一微波提取和超聲提取，分別較微波提取和超聲提取提高了13.60%和25.03%。

2.4 抗氧化活性評價

2.4.1 DPPH自由基清除能力(圖6)

圖6 鼠尾藻多糖對DPPH自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability of DPPH free radicals of polysaccharides from Sargassum thunbergii

由圖6可知，鼠尾藻多糖對DPPH自由基有一定的清除能力，且清除率隨鼠尾藻多糖濃度的增加逐漸升高，在濃度為0.4 mg·mL-1時，清除率達到60%以上；繼續(xù)增加濃度，DPPH自由基清除率變化不大。VC對DPPH自由基的清除能力略高于鼠尾藻多糖，當濃度為0.4 mg·mL-1時，清除率達到90%以上。鼠尾藻多糖、VC對DPPH自由基的IC50值分別為0.311 mg·mL—1、0.001 mg·mL—1。

2.4.2 ABTS自由基清除能力(圖7)

圖7 鼠尾藻多糖對ABTS自由基的清除能力Fig.7 Scavenging ability of ABTS free radicals of polysaccharides from Sargassum thunbergii

由圖7可知，鼠尾藻多糖對ABTS自由基的清除率隨鼠尾藻多糖濃度的增加逐漸升高，當濃度為1.0 mg·mL-1時，清除率達到80%以上；繼續(xù)增加濃度，ABTS自由基清除率升幅趨緩。VC對ABTS自由基的清除能力略高于鼠尾藻多糖，在濃度為0.2 mg·mL-1時，清除率達到90%以上。鼠尾藻多糖、VC對ABTS自由基的IC50值分別為0.288 mg·mL—1、0.035 mg·mL—1。由此可見，鼠尾藻多糖在一定濃度范圍內對ABTS自由基有較強的清除能力，且優(yōu)于對DPPH自由基的清除能力。

3 結論

以鼠尾藻多糖提取率為評價指標，在單因素實驗的基礎上，采用響應面法優(yōu)化鼠尾藻多糖的超聲-微波聯用提取工藝，并通過測定鼠尾藻多糖對 DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力，評價其抗氧化活性。確定鼠尾藻多糖的最佳提取工藝為：提取時間31 min、微波功率359 W、超聲功率302 W、液料比27∶1(mL∶g)，在此條件下，鼠尾藻多糖提取率可達9.19%。鼠尾藻多糖具有一定的抗氧化活性，對ABTS自由基的清除能力(IC50=0.288 mg·mL—1)優(yōu)于對DPPH自由基的(IC50=0.311 mg·mL—1)。