李健 曲植 張立鑫 李銘江 陸江岳

1 西安理工大學 省部共建西北旱區(qū)生態(tài)水利國家重點實驗室,西安,710048 2 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境化學與生態(tài)毒理學國家重點實驗室,北京,100085

0 引言

水稻是我國第一大糧食作物，其產量約占全國糧食產量的1/3，截止2022年，我國栽培面積達到2 900萬hm2[1].為提高作物產量，自20世紀70年代以來，我國農業(yè)生產中的氮肥施用量迅速增加.根據FAO的統(tǒng)計資料，平均每年增加約7.8×105t.2008年耕地面積僅占世界7%的中國，消耗了3.3×107t氮肥，占全球當年氮肥消耗量9.2×107t的36%，有預測表明，我國的氮肥施用量還可能繼續(xù)增加[2-3].目前，中國稻田的氮素平均利用率僅在30%～40%之間，而造成稻田氮素利用率低下的一個主要原因是稻田中發(fā)生反硝化作用導致氮素以氣態(tài)形式流失[4-6].

反硝化作用作為土壤中參與氮循環(huán)的重要一環(huán)，是農業(yè)上N2O排放的主要來源.反硝化作用是指反硝化微生物在厭氧條件下，將硝酸鹽、亞硝酸鹽逐步還原，最終將氮以一氧化氮(NO)、氧化亞氮(N2O)或分子態(tài)氮(N2)的形式釋放的過程[7-8]，它提高了農田生態(tài)系統(tǒng)中氮素流失的風險，并導致了嚴重的經濟損失.

反硝化過程是由微生物驅動的酶促反應過程，其反映速率和產物組成顯著受到多種環(huán)境因素直接或間接的影響，如溫度、pH、Eh、水分、含氧量、碳源類型、氮源類型、碳氮比、土壤質地、耕作方式及土地利用類型等.近年來，國內外眾多學者圍繞環(huán)境因子對反硝化作用的影響開展了一系列深入的研究.Tang等[9]通過向亞熱帶和溫帶森林土壤中添加N、P，發(fā)現(xiàn)pH值是反硝化微生物活性的主要控制因子；Tao等[10]通過有無施用有機肥對農田土壤反硝化微生物群落結構及N2O排放的試驗中發(fā)現(xiàn)施加有機肥可顯著提高土壤反硝化酶活性，增加反硝化過程相關功能基因的數(shù)量，并減少N2O排放量；王麗麗等[11]研究發(fā)現(xiàn)，生物反硝化系統(tǒng)中最好的電子供體是易于生物降解的有機物，其不僅可提高反硝化速率，還能夠提升生物處理裝置的能力和效率；王海濤等[12]、鄭蘭香等[13]發(fā)現(xiàn)土壤中C/N比越高，反硝化速率越強.Shan等[14]、Ryden等[15]、Bhandral等[16]研究也表明有機碳含量越高，其反硝化潛勢也越大.這是由于反硝化作用是微生物在厭氧條件下進行的硝酸鹽、亞硝酸鹽的異養(yǎng)還原過程，需要碳源作為電子供體參與反應[17].淹水條件下微生物利用碳源厭氧發(fā)酵過程中產生的有機酸[18-19]、氫離子[20]、CO2等物質會降低土壤pH[21]，而土壤pH是影響反硝化作用最主要也是最復雜的因素之一，可直接影響參加反硝化作用的反硝化的微生物群落結構和氮氧化物還原酶的活性[22-24].因此碳源是影響反硝化作用的關鍵因素之一，但是目前關于外加碳源的研究多見于對工農業(yè)污水脫氮處理，其對農業(yè)土壤尤其是稻田土壤中反硝化作用的影響機理研究較少，碳源添加對反硝化過程的影響機制研究鮮有報道.

本研究通過室內水稻土泥漿厭氧培養(yǎng)試驗，在不同本底pH水稻土中添加碳源培養(yǎng)，監(jiān)測培養(yǎng)過程中土壤pH和無機氮濃度的變化，并基于DNA和RNA水平分別分析反硝化微生物編碼亞硝酸鹽還原酶的nirK/S和編碼氧化亞氮還原酶的nosZ等功能基因豐度變化，旨在探究添加碳源對不同本底pH水稻土反硝化過程的調控機理，為提高氮素利用效率、溫室氣體減排提供理論支撐.

1 材料方法

1.1 樣品采集

供試水稻土分別采自天津市寶坻區(qū)王卜莊鎮(zhèn)后張司馬村(117.55°E,39.65°N)和廣東省廣州市蘿崗區(qū)九龍鎮(zhèn)洋田村(106.71°E,26.49°N).前者為多年種植單季稻土壤，以字母BD表示；后者為多年種植雙季稻土壤，以字母GZ表示.在水稻落干期，采集稻田耕層0～20 cm的土壤，揀去植物殘體，自然風干，磨細，過1 mm篩，避光保存，備用.供試土壤的理化性質如表1所示.

表1 供試水稻土的理化性狀

1.2 培養(yǎng)試驗

1.2.1 風干土預培養(yǎng)

分別取BD、GZ風干水稻土各1 kg，調節(jié)其質量含水率至15%，于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中好氧培養(yǎng)7 d以恢復土壤微生物活性.

1.2.2 泥漿厭氧培養(yǎng)試驗

試驗設置：本試驗選取兩個因子，即土壤樣品本底pH和外源添加有機碳(葡萄糖)濃度，其中土壤樣品為酸性的GZ土壤和堿性的BD土壤；葡萄糖濃度設置3個水平，分別為0、25和100 mmol·L-1，依次標記為CK、L和H(表2).

表2 試驗設置

淹水處理：取預培養(yǎng)土樣3 g置于10 mL玻璃培養(yǎng)瓶中，加入1.5 mL KNO3溶液作為氮源，再根據處理添加1.5 mL相應濃度的葡萄糖溶液作為碳源，最終制成水土比為1∶1的泥漿.

厭氧培養(yǎng)：淹水處理后，培養(yǎng)瓶加橡膠塞封口，以60 mL·min-1的流速充入高純氮氣使瓶中N2交換循環(huán)至少20次，以去除瓶中的O2使其達到厭氧環(huán)境，后加鋁蓋密封，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng).

1.2.3 樣品采集與保存

分別于培養(yǎng)開始后的第0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、9和11天采集土壤樣品，直接用于土壤pH的測定；分別于培養(yǎng)開始后的第0小時、3小時、6小時、0.5天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、9天、11天，采集土壤樣品置于2 mL凍存管中，液氮冷凍后，-80 ℃保存，供提取土壤DNA和RNA使用；同時采集樣品置于-20 ℃冰箱保存，以供土壤無機氮的測定.采集樣品時先將培養(yǎng)瓶置于冰上預冷10 min.

1.3 土壤pH測定

取泥漿樣品搖勻后，采用pH計(MT-5000)依次對不同處理樣品進行測定.

1.4 土壤無機氮素含量測定

1.5 土壤總DNA的提取

取0.5 g-80 ℃冷凍保存的樣品，使用DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.? Soil DNA Kit，Omega Bio-tek)按照試劑盒說明書步驟提取土壤總DNA，提取的DNA樣品分裝后保存在-80 ℃(長期)低溫冰箱中.

1.6 土壤總RNA的提取和反轉錄

取0.5 g-80 ℃冷凍保存的樣品，使用RNA提取試劑盒(E.Z.N.A.? Soil RNA Kit，Omega Bio-tek)按照試劑盒說明書步驟提取土壤總RNA，提取的RNA樣品在確保沒有gDNA后，使用RNA-cDNA反轉錄試劑盒(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，TaKaRa)將RNA反轉錄為cDNA，分裝后保存在-80 ℃(長期)低溫冰箱中.

1.7 實時定量PCR擴增

使用1.5小節(jié)和1.6小節(jié)中提取的DNA和cDNA為模板分別選取反硝化微生物亞硝酸鹽還原酶(nirK/S)基因和氧化亞氮還原酶(nosZ)基因的對應引物對(表3)進行實時熒光定量PCR擴增，與已知濃度的含有各基因的標準質粒擴增結果比對，得到各樣品中對應基因表達量.

表3 使用的PCR擴增引物

1.8 數(shù)據分析

數(shù)據方差分析和相關性分析用SPSS 20.0軟件完成，采用單因素方差分析法區(qū)分樣品間的顯著性差異(One Way ANOVE，LSD檢驗)；使用Origin 2021軟件繪圖.

2 結果與分析

2.1 葡萄糖添加對水稻土pH的影響

BD(寶坻水稻土)在未添加葡萄糖的情況下，其pH幾乎沒有發(fā)生變化；而在添加葡萄糖后的2 d內土壤pH值顯著下降，后趨于穩(wěn)定，并呈現(xiàn)外源添加葡萄糖濃度越高，pH降低幅度越大的特點.在低葡萄糖處理條件下，土壤pH值在2 d內由7.78下降至6.24；而在高葡萄糖處理條件下，土壤pH值在2 d內由7.77下降至6.08，之后仍存在緩慢降低，3 d后基本穩(wěn)定(圖1a).GZ(廣州水稻土)在未添加葡萄糖的情況下，其pH值隨培養(yǎng)時間延長而緩慢上升，在整個培養(yǎng)期間由初始的4.51上升至6.42，增幅達1.91個單位.其中低葡萄糖添加處理，pH隨培養(yǎng)時間呈現(xiàn)先升高后降低再升高的緩慢變化趨勢，培養(yǎng)結束時pH上升1個單位；而高葡萄糖添加處理，pH隨培養(yǎng)時間呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，其中培養(yǎng)5 d后pH最高為5.23，培養(yǎng)結束時pH上升0.22個單位，說明添加外源葡萄糖可減小土壤pH上升幅度，尤其是在高濃度葡萄糖處理條件下更為顯著(圖1b).

圖1 土壤pH變化

2.2 葡萄糖添加對水稻土無機氮含量的影響

圖2 無機氮濃度變化

2.3 葡萄糖添加對土壤中反硝化功能基因數(shù)量的影響

BD水稻土在未添加葡萄糖的培養(yǎng)過程中nirK基因拷貝數(shù)幾乎沒有變化，而添加葡萄糖處理使得nirK基因拷貝數(shù)發(fā)生顯著變化，其中在低葡萄糖處理下，nirK基因拷貝數(shù)整體上隨時間呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，分別于培養(yǎng)3 d和7 d時達到峰值，最大值為6.46×107copies/g(soil)；而在高葡萄糖處理下，nirK基因拷貝數(shù)變化幅度更大，分別于第4 d和6 d時達到峰值，其最大值為1.17×108copies/g(soil)；之后nirK基因拷貝數(shù)均下降至初始水平(圖3a).GZ水稻土在不同濃度葡萄糖添加下整體上均呈現(xiàn)下降趨勢，其中無葡萄糖添加處理的降幅最大，為53.82%，低葡萄糖添加處理和高葡萄糖添加處理分別下降23.54%、41.89%(圖3b).

BD水稻土在未添加葡萄糖的培養(yǎng)過程中nirS基因拷貝數(shù)在第6 d達到最低值，于第9 d達到峰值，整體上呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢.在葡萄糖添加下，nirS基因拷貝數(shù)變化顯著，其中低葡萄糖添加使得nirS基因拷貝數(shù)于第3～7天均處于較高水平，7天時存在最大值為1.77×109copies/g(soil)，隨后nirS基因拷貝數(shù)迅速下降，9 d后達到最低，為2.08×108copies/g(soil)；而高葡萄糖添加使得在第5 d后存在明顯峰值，為1.59×109copies/g(soil)，其余階段nirS基因拷貝數(shù)均與培養(yǎng)初期水平相當(圖3c).GZ水稻土在高葡萄糖添加下nirS基因拷貝數(shù)整體水平較其他兩個處理稍高，其余各處理nirS基因拷貝數(shù)在整體上均呈現(xiàn)下降趨勢，其中無葡萄糖添加處理的降幅最大，為50.36%，低葡萄糖添加處理和高葡萄糖添加處理分別下降42.86%、38.93%(圖3d).

BD水稻土在未添加葡萄糖時，nosZ基因呈現(xiàn)出先增加隨后緩慢下降趨于穩(wěn)定的規(guī)律，其中于第2天達到峰值1.04×109copies/g(soil)；在低葡萄糖處理下，nosZ基因拷貝數(shù)變化顯著，于第4～7 d均維持在較高水平，最大值為1.58×109copies/g(soil)，之后迅速降低，第9天達到最低，為2.59×108copies/g(soil)；在高葡萄糖處理下，nosZ基因變化相對平緩，于第5天存在較小峰值，為9.59×108copies/g(soil)(圖3e).GZ水稻土在未添加葡萄糖的培養(yǎng)過程中nosZ基因拷貝數(shù)整體水平較其他兩個處理稍高，呈現(xiàn)先減后增的趨勢.葡萄糖添加使得nosZ基因拷貝數(shù)整體上均呈現(xiàn)下降趨勢，低葡萄糖添加處理和高葡萄糖添加處理分別下降68.46%、66.47%(圖3f).

圖3 功能基因拷貝數(shù)變化

2.4 葡萄糖添加對各功能基因轉錄本數(shù)量的影響

BD水稻土在不同濃度葡萄糖添加下，nirK基因轉錄本數(shù)量均出現(xiàn)明顯變動，并且均于培養(yǎng)第6天出現(xiàn)峰值，但低葡萄糖處理的峰值明顯要高.此外在整個培養(yǎng)過程中，低葡萄糖處理nirK基因轉錄本數(shù)量變動也更為明顯，于培養(yǎng)第3天后較先出現(xiàn)最高峰，其nirK基因轉錄本的最大值為2.95×105copies/g(soil)，顯著高于未添加葡萄糖處理的4.12×104copies/g(soil)和高葡萄糖添加處理的5.93×104copies/g(soil)(圖4a).GZ水稻土在無葡萄糖和低葡萄糖添加下，nirK基因轉錄本數(shù)量變動不大，且整體水平高于高葡萄糖添加處理.在高葡萄糖添加下，nirK基因轉錄本數(shù)量隨培養(yǎng)時間在緩慢下降，至培養(yǎng)結束nirK基因轉錄本數(shù)量減少1.10×104copies/g(soil)，同比降低71.21%(圖4b).

BD水稻土在未添加葡萄糖和低葡萄糖添加下，nirS基因轉錄本數(shù)量明顯高于高葡萄添加處理，并且均于培養(yǎng)第3天出現(xiàn)峰值，但低葡萄糖處理的峰值更高，而高葡萄糖添加下nirS基因轉錄本數(shù)量沒有明顯變化.此外低葡萄糖處理中nirS基因轉錄本數(shù)量于培養(yǎng)5天后出現(xiàn)第2個峰值，其nirS基因轉錄本的最大值為4.10×107copies/g(soil)，顯著高于無葡萄糖處理的2.51×107copies/g(soil)和高葡萄糖處理的8.32×106copies/g(soil)(圖4c).在GZ水稻土培養(yǎng)過程中，各個處理nirS基因轉錄本數(shù)量于培養(yǎng)前2 d內均出現(xiàn)不同程度的降低，其中高葡萄糖添加處理下降98.08%，顯著高于其余兩個處理.至培養(yǎng)結束時，葡萄糖的添加未使得nirS基因轉錄本數(shù)量發(fā)生明顯改變，而在未添加葡萄糖時，nirS基因轉錄本數(shù)量于培養(yǎng)第9天開始出現(xiàn)明顯上升的現(xiàn)象(圖4d).

圖4 基因轉錄本數(shù)量變化

BD水稻土在低葡萄糖添加下，nosZ基因轉錄本數(shù)量整體要高于其余兩個處理，而未添加葡萄糖時，nosZ基因轉錄本數(shù)無明顯變化；而添加葡萄糖處理中nosZ基因轉錄本數(shù)均于1 d后出現(xiàn)峰值，且低葡萄糖添加處理的峰值為4.36×107copies/g(soil)明顯高于高葡萄糖添加處理的2.04×107copies/g(soil)(圖4e).對于GZ水稻土而言，培養(yǎng)前期各個處理中nosZ基因轉錄本數(shù)量均無明顯變化.在未添加葡萄糖處理中，nosZ基因轉錄本數(shù)量于培養(yǎng)6 d后迅速上升，至培養(yǎng)結束時增長1.74倍；在低葡萄糖添加處理中，nosZ基因轉錄本數(shù)量于培養(yǎng)6 d后出現(xiàn)較小峰值；在高葡萄糖處理中，nosZ基因轉錄本數(shù)量整體變化不明顯(圖4f).

3 討論

圖5 nirS/nirK比值變化

nosZ基因編碼的氧化亞氮還原酶(N2OR)是目前已知的唯一能將N2O還原為N2的生物酶,當nosZ基因數(shù)量和表達量受到不利條件的抑制時，就會導致溫室氣體N2O的大量累積.在本試驗中，酸性土壤(GZ)經過碳源添加處理后，nosZ基因數(shù)量和表達量收到了抑制作用，且碳源濃度越高，抑制作用越強；堿性土壤(BD)經低葡萄糖處理后促進了nosZ基因數(shù)量和表達量，但是高葡萄糖處理下卻抑制了nosZ基因的表達，這主要是由于在酸性土壤中，由于本身pH很低，加入葡萄糖后使得土壤pH再次下降，從而出現(xiàn)nosZ基因的表達受抑制.這與朱永官等[27]、潘亞男等[32]、Qu等[33]研究結果一致，即從基因角度來說，相應編碼基因的表達更易受到土壤pH的影響,低pH會影響到生物體產生功能性N2O還原酶的能力，當土壤pH<7時反硝化酶nosZ活性逐漸減小；在堿性土壤中，低濃度葡萄糖作為碳源進入土壤中，激發(fā)了反硝化微生物的功能活性；而高濃度葡萄糖進入土壤所帶來的土壤酸化反而抑制了反硝化微生物的活性，這與封克等[28]的研究結果一致，即堿性旱地土壤在有碳源加入的情況下，最有利于N2O還原為N2的土壤pH為6.92，當添加高濃度葡萄糖時，土壤將低于這個最適pH，所以反而抑制了nosZ基因的表達.

4 結論

本研究揭示了反硝化微生物對碳源添加的敏感性，葡萄糖添加可以從提供碳源和降低土壤pH兩個方面，直接或間接的影響水稻土反硝化過程：1)高pH土壤上添加碳源增強了反硝化作用；低pH土壤上添加碳源對反硝化過程的促進作用不明顯.2)不同本底pH的土壤中nirK和nirS基因數(shù)量和表達量對加入碳源引起的pH變化的響應具有顯著差異，其中nirK基因數(shù)量和表達量對于外界環(huán)境變化的響應程度相對更高.3)在低pH土壤上，碳源添加對nosZ基因數(shù)量和表達量存在抑制作用，且碳源濃度越高抑制作用越強；在高pH土壤上，低葡萄糖處理下，碳源的刺激作用占主導地位；高葡萄糖處理下，碳源引起的pH變化的抑制作用占主導.本研究有助于理解稻田外源有機物輸入對土壤反硝化過程的影響機制，為稻田氧化亞氮減排措施的實施與評估提供理論依據.