王雪容，葉宇恒，廣怡靜，何小強(qiáng)，張 莉

（寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

固原烏雞是采用現(xiàn)代家禽育種技術(shù)選擇培育而成，同時(shí)兼有固原土種烏雞與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品種烏雞優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)良品種。它適合在固原市乃至整個(gè)北方地區(qū)自然條件下飼養(yǎng)。固原烏雞具有耐寒、耐潮濕、耐粗飼料、適應(yīng)力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)，是集食用、藥用、觀賞為一體的白、黑、麻3個(gè)羽色的固原新的烏雞類群[1]。烏骨雞的雞肉所含膽固醇水平低、游離脂肪酸高、微量元素豐富，同時(shí)還含有大量人體所必需的氨基酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、觀賞價(jià)值與醫(yī)療價(jià)值很高[2]。烏骨雞雞肉中還含有很多具有一定抗氧化能力和較強(qiáng)清除羥自由基能力的活性肽[3]。烏骨雞雞蛋中含有較多的花生四烯酸，其蛋黃干比例與蛋黃物質(zhì)比例高于普通雞蛋[4]。除此之外，大量黑色素存在于固原烏雞體內(nèi)。已有試驗(yàn)表明，在動(dòng)物體內(nèi)黑色素具有很多重要功能，例如抗氧化、抑制病毒增殖、保護(hù)DNA和線粒體、體溫調(diào)節(jié)、射線保護(hù)等[5]。因此，現(xiàn)階段認(rèn)為烏骨雞發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是黑色素。

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，其對(duì)食物的要求也隨之提高，綠色健康食品成為首選，具有藥用、蛋用、肉用三位一體效用的烏骨雞能夠滿足市場(chǎng)需求?，F(xiàn)階段對(duì)固原烏雞的研究多集中在營(yíng)養(yǎng)和形態(tài)方面，而對(duì)固原烏雞腸道內(nèi)黑色素的形態(tài)結(jié)構(gòu)和分布規(guī)律等方面的研究較少。本研究旨在通過分析固原烏雞腸道黑色素顆粒的位置與特征，為豐富烏骨雞黑色素沉積原理提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

安樂死后快速解剖6只健康白羽固原烏雞，依次取出十二指腸、空腸、回腸、盲腸，腸內(nèi)容物用0.9%生理鹽水清洗，用10%甲醛溶液固定小塊組織樣本。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 制作石蠟切片 從固定液中取出腸道組織樣本，分級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟浸泡，石蠟包裹，切割石蠟（YD-1508，浙江益迪），5 μm厚。將切片放入42 ℃溫水中進(jìn)行水浴使之展開，再用載玻片將切片撈出，在37 ℃溫箱中干燥以備后期使用。

1.2.2 蘇木精-伊紅（HE）染色 用二甲苯將切片進(jìn)行脫蠟，蘇木精溶液中染色10～20 min，自來水沖洗1～3 min，鹽酸酒精分化5～10 s，自來水沖洗1～3 min，放入50 ℃溫水中或弱堿水溶液中返藍(lán)，直到出現(xiàn)藍(lán)色為止，自來水沖洗1～3 min，放入85%的酒精3～5 min，伊紅染色3～5 min，水洗3～5 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.3 Masson-Fontana組織化學(xué)染色法 把腸道組織切片置于二甲苯中脫石蠟，用梯度乙醇使切片重新恢復(fù)成有水分的狀態(tài)，氨-銀染色（氨銀液：100 g/L硝酸銀水溶液+280 g/L氨水）24 h；用蒸餾水沖洗，然后把切片置于5%硫代硫酸鈉水溶液處理2 min；用蒸餾水沖洗，1%中性紅染2 min；再用蒸餾水沖洗，分級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠密封切片，使用BM2000型光學(xué)顯微鏡（日本尼康）進(jìn)行觀察，最后以照片形式記錄。

2 結(jié)果

2.1 固原烏雞十二指腸顯微結(jié)構(gòu)

通過觀察鏡下結(jié)構(gòu)可發(fā)現(xiàn)十二指腸腸壁組織結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)分為4層，即外膜、肌層、黏膜下層與黏膜（圖1），分層較為明顯。十二指腸腸絨毛較長(zhǎng)，黏膜層上皮細(xì)胞中杯狀細(xì)胞數(shù)量較多（圖1A），大量淋巴細(xì)胞見于固有層內(nèi)。十二指腸的肌層分為環(huán)行平滑肌層（位于內(nèi)側(cè)）和縱行平滑肌層（位于外側(cè)），其中黑色素主要分布在縱行平滑肌中，數(shù)量較少（圖1B）；漿膜中黑色素也有較少分布。Masson-Fontana染色結(jié)果顯示，十二指腸黑色素顆粒較少（圖1C），大多沉積在肌層與漿膜之間，少數(shù)散在分布于肌層的縱行平滑肌層內(nèi)。

圖1 固原烏雞十二指腸顯微鏡結(jié)構(gòu)

2.2 固原烏雞空腸顯微結(jié)構(gòu)

空腸腸壁組織結(jié)構(gòu)同樣分為4層（圖2），分層較為明顯，腸絨毛密集，黏膜上皮杯狀細(xì)胞較多（圖2D），固有層內(nèi)可見少量淋巴細(xì)胞?？漳c肌層中環(huán)行平滑肌和縱行平滑肌都未觀察到黑色素分布，漿膜中黑色素?cái)?shù)量分布中等（圖2E），主要靠近肌層。Masson-Fontana染色結(jié)果顯示：空腸黑色素顆粒也較多，主要沉積在漿膜中，肌層中未觀察到黑色顆粒（圖2F），與HE染色結(jié)果一致。

圖2 固原烏雞空腸顯微鏡結(jié)構(gòu)

2.3 固原烏雞回腸顯微結(jié)構(gòu)

回腸腸壁組織分為黏膜層、黏膜下層、肌層與外膜（圖3），分層較為明顯，腸絨毛較長(zhǎng)，黏膜層上皮細(xì)胞中杯狀細(xì)胞數(shù)量較少，固有層內(nèi)可見少量淋巴細(xì)胞?；啬c肌層可見大量黑色素分布，主要沉著在縱行平滑肌中，靠近大血管周圍和外膜的邊緣附近有黑色顆粒附著，漿膜內(nèi)可見少量黑色素沉積（圖3H）。Masson-Fontana染色結(jié)果顯示：回腸黑色素顆粒較多，大多沉積在肌層與外膜之間，少數(shù)分布于肌層與漿膜內(nèi)（圖3G）。

圖3 固原烏雞回腸顯微鏡結(jié)構(gòu)

2.4 固原烏雞盲腸顯微結(jié)構(gòu)

盲腸腸壁組織分為黏膜層、黏膜下層、肌層與外膜（圖4），分層較為明顯，腸腔變平坦，腸絨毛較短，有散在的淋巴結(jié)分布，肌層最發(fā)達(dá)（圖4K）。盲腸肌層中環(huán)行平滑肌中黑色素很少，可見零星分布，但縱行平滑肌中有大量黑色素沉著，很多黑色素細(xì)胞聚集成片狀分布，漿膜有較少的黑色素沉積（圖4N）。Masson-Fontana染色結(jié)果顯示：盲腸黑色素顆粒較多，肌層與外膜間有大量黑色素沉積，少數(shù)黑色素顆粒散在分布于肌層與漿膜內(nèi)（圖4O）。

圖4 固原烏雞盲腸顯微鏡結(jié)構(gòu)

本試驗(yàn)中腸道內(nèi)均可見不等量黑色素沉積，黑色素的分布和含量見表1，主要沉著于肌層和漿膜層，而黏膜和黏膜下層很少，回腸和盲腸含量較多，空腸較少。

表1 固原烏雞腸道黑色素的分布位置及含量

3 討論

Korakot Nganvongpanit等[6]通過研究泰國(guó)烏骨雞體內(nèi)黑色素在33個(gè)器官中的分布，發(fā)現(xiàn)性別對(duì)烏骨雞各器官的色素沉著沒有影響，部分雞的器官或組織樣本，如心臟、腎臟和腹部脂肪，未顯示出任何程度的色素沉著。Guo Hui等[7]采用lily染色、DOPA染色和透射電鏡觀察泰和烏骨雞皮膚黑素細(xì)胞的分布特征，發(fā)現(xiàn)成熟的黑素細(xì)胞主要分布在表皮基底層和毛囊鱗莖中，而無色黑素細(xì)胞主要分布在毛囊外根鞘中，在成熟的黑素細(xì)胞中，黑素小體分為I、II、Ⅲ、IV期，大部分屬于IV期。有研究表明，黑色素細(xì)胞于皮膚中發(fā)育成熟，成熟的黑色素細(xì)胞大多位于毛囊中，表皮層的基底部只有少數(shù)存在。黑色素小體是一種可以產(chǎn)生黑色素的細(xì)胞器，它存在于成熟的黑色素細(xì)胞中。黑色素合成后會(huì)運(yùn)輸?shù)焦潭▍^(qū)域沉積。烏骨雞胚胎發(fā)育5 d左右時(shí)，黑色素首先出現(xiàn)在雞胚的背部皮膚中，然后以背部為中心，分別向四周拓展。黑色素的沉積順序?yàn)槭紫仍诠悄ぜ∧ず推つw中，接著在肌間結(jié)締組織，最后在肌纖維組織[8]。

國(guó)外一項(xiàng)針對(duì)泰國(guó)烏骨雞的研究表明[6]，在一些器官中，組織樣本的所有結(jié)構(gòu)層中都發(fā)現(xiàn)了黑色素。但僅在氣管、泄殖腔、輸卵管等組織樣本的某些層中觀察到了黑色素，而在上皮層中未發(fā)現(xiàn)黑色素。食管組織中，僅在漿膜中有黑色素沉著。嗉囊、盲腸和空腸組織中黏膜和黏膜下層未發(fā)現(xiàn)黑色素，而黑色素主要沉積在肌層和漿膜中。國(guó)內(nèi)針對(duì)泰和烏骨雞腸道黑色素分布特征的研究結(jié)果表明，泰和烏骨雞腸道有黑色素分布，且多分布于肌層與漿膜間[9]。泰和烏骨雞的研究中，大多數(shù)黑色素細(xì)胞主要存在于血管附近和腸道的肌肉層和外膜中[10]。本次試驗(yàn)中，蘇木精-伊紅染色結(jié)果表明固原烏雞腸道組織結(jié)構(gòu)與普通品種雞基本相似。十二指腸、空腸、回腸與盲腸腸壁均分為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜，且分層較為明顯?？漳c、回腸和十二指腸腸絨毛較長(zhǎng)，黏膜上皮杯狀細(xì)胞較多，固有層內(nèi)可見有少量淋巴細(xì)胞；而盲腸的腸絨毛較短，大量淋巴細(xì)胞聚集于固有層內(nèi)。黑色素沉積于十二指腸、空腸、回腸和盲腸肌層結(jié)締組織及漿膜內(nèi)，且回腸、十二指腸和盲腸較多，空腸較少。Masson-Fontana組織化學(xué)染色法結(jié)果同樣顯示固原烏雞以上幾種腸道黑色素沉積于肌層結(jié)締組織及漿膜內(nèi)，且回腸、十二指腸和盲腸較多，空腸較少。本次試驗(yàn)通過形態(tài)學(xué)方法探索固原烏雞腸道分布特征及規(guī)律，旨在豐富烏雞黑色素研究理論，為進(jìn)一步研究黑色素的形成、分布、功能等提供更多依據(jù)。

固原烏雞黑色素分布于十二指腸、空腸、回腸與盲腸中，表明黑色素在這些腸道中可能具有一定的生理作用，如抗寄生蟲、抗病毒、抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化等[5]。因此，腸道肌層與漿膜內(nèi)的黑色素顆粒層可能對(duì)微生物或寄生蟲的侵入具有一定的免疫保護(hù)作用。而在固原烏雞中十二指腸、回腸與盲腸的黑色素較多，空腸黑色素較少的原因可能與不同腸道組織功能不同有一定關(guān)系，具體原因有待進(jìn)一步研究論證。