董新燕，張玉蘭，劉發(fā)強(qiáng)，王曉麗，徐保紅，高偉利，郭玉梅

弓形桿菌屬為革蘭陰性、螺旋狀、有運(yùn)動(dòng)性的細(xì)菌，屬于變形菌綱，該屬的細(xì)菌在環(huán)境中廣泛存在，其中的幾個(gè)種是新發(fā)的食源性人獸共患病原體，能夠通過(guò)受污染的食物或水傳播，引起人的急性腸炎等癥狀。弓形桿菌屬(Arcobacter)自1991年從彎曲菌屬中分離出來(lái)[1]，與彎曲菌屬的細(xì)菌相比，弓形桿菌屬的最適生長(zhǎng)溫度較低，生長(zhǎng)的氣體環(huán)境要求也更為寬松，其中，布氏弓形桿菌在需氧、厭氧、微需氧的氣體環(huán)境下均能夠生長(zhǎng)[2-3]。截至2021年9月，原核生物標(biāo)準(zhǔn)命名列表(LPSN)中在弓形桿菌屬下共收錄32種，其中，布氏弓形桿菌(A.butzleri)、嗜低溫弓形桿菌(A.cryaerophilus)、斯氏弓形桿菌(A.skirrowii)被認(rèn)為是人獸共患的新發(fā)病原體，人一般通過(guò)進(jìn)食受污染的生食或未煮熟的動(dòng)物源性食物以及受污染的水而感染，可能引起急性和慢性腸胃炎和敗血癥等疾病[4]。

目前，弓形桿菌的致病機(jī)制尚不清晰，對(duì)其毒力基因的研究能夠幫助闡釋其致病機(jī)制，研究者M(jìn)iller等2007年首次鑒定了布氏弓形桿菌(Arcobacterbutzleristrain RM4018)的毒力基因，其中，cadF(黏附蛋白)、cjl349(黏附蛋白)、ciaB(入侵蛋白)、mviN(肽聚糖合成蛋白)、pldA(磷脂酶A)和tlyA(溶血素蛋白)均是與彎曲桿菌屬同源的毒力基因[5]。除此之外，irgA(鐵調(diào)控外膜蛋白)、iroE(鐵載體酯酶)、hecA(絲狀血凝素)和hecB(溶血素激活蛋白)也是在布氏弓形桿菌中常見(jiàn)的毒力基因[6]。

本研究成功從腹瀉病人糞便中分離了12株弓形桿菌并進(jìn)行了全基因組測(cè)序，重點(diǎn)對(duì)12株弓形桿菌的毒力基因和耐藥基因進(jìn)行了分析，利用相關(guān)的生物信息學(xué)技術(shù)獲得本次分離株的遺傳特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株來(lái)源 收集在2018—2019年在石家莊市兩所哨點(diǎn)醫(yī)院感染科就診的急性腹瀉患者糞便樣本，患者要求有可疑飲食暴露史且有消化道癥狀，并排除病毒性、常見(jiàn)細(xì)菌性、化學(xué)性和脂肪性病例。病例定義是指由食品或者懷疑由食品引起的，以腹瀉為主訴的就診病例。腹瀉次數(shù)要求≥3次/d，腹瀉性狀包括水樣便、粘液便、稀便和膿血便。

1.1.2 儀器與試劑 三氣培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder)，MOLDI-TOF質(zhì)譜儀(德國(guó)布魯克)，弓形桿菌檢測(cè)試劑盒(青島中創(chuàng)匯科)、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根，DP302-02)，引物合成及PCR相關(guān)試劑購(gòu)自大連寶生物，測(cè)序由北京諾禾致源測(cè)序公司完成。

1.2 方 法

1.2.1 菌株分離與基因組提取 取棉拭子蘸取少量糞便標(biāo)本，放入弓形桿菌增菌液，37 ℃微需氧培養(yǎng)24 h，用0.45 μm濾膜過(guò)濾到至雙孔板上，37 ℃微需氧培養(yǎng)48 h，挑選可疑菌落轉(zhuǎn)至哥倫比亞血平板微需氧37 ℃培養(yǎng)48 h純培養(yǎng)，用MALDI-TOF進(jìn)行菌株鑒定。細(xì)菌基因組DNA提取采用Promega細(xì)菌基因組提取試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.2 全基因組全測(cè)序 Qubit進(jìn)行定量，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合DNA 樣品，條帶前后沿比較清晰，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象的樣品進(jìn)行 Illumina NovaSeq PE150測(cè)序。

1.2.3 種鑒定 對(duì)全測(cè)序結(jié)果的種鑒定采用DDH(http://ggdc.dsmz.de/)的方法， 布氏弓形桿菌選擇的參考株為GCA_003730245.1，嗜低溫弓形桿菌選擇的參考株為GCF_001572845.1。DDH 采納Formula2結(jié)果，大于70%認(rèn)為同種[7]。

1.2.4 耐藥基因與毒力基因分析 使用CARD數(shù)據(jù)庫(kù)提供的Resistance Gene Identifier (RGI)軟件將目標(biāo)物種的氨基酸序列與CARD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)(RGI內(nèi)置blastp，默認(rèn)evalue≤1×10-30)，根據(jù)RGI的比對(duì)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)注釋到數(shù)據(jù)庫(kù)的抗性基因信息。

VFDB(Virulence Factors of Pathogenic Bacteria)數(shù)據(jù)庫(kù)是用于專門研究致病細(xì)菌、衣原體和支原體致病因子的數(shù)據(jù)庫(kù)，除收錄毒力基因的物種信息、基本特征描述外，還提供毒力基因功能和致病機(jī)制的詳細(xì)描述，將氨基酸序列，與VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，把目標(biāo)物種的基因和其相對(duì)應(yīng)的毒力因子功能注釋信息結(jié)合起來(lái)，得到注釋結(jié)果。

1.2.5 MLST與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 以組裝好的菌株序列進(jìn)行MLST分型，參考pubmlst(https://pubmlst.org/organisms)網(wǎng)站。使用snippy進(jìn)行變異檢測(cè)及一致性序列的輸出，使用MEGAX構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，方法為NJ，設(shè)定Bootstrap 1000，選擇布氏弓形桿菌NC_017187.1作為參考株。

2 結(jié) 果

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果及臨床特征 2018-2019年共收集429例腹瀉病人糞便樣本，經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)共檢出5株嗜低溫弓形桿菌、7株布氏弓形桿菌，分離陽(yáng)性率為3.03%(12/429)。弓形桿菌陽(yáng)性病例均為成人，各癥狀比例為腹痛76.92%(10/13)、惡心46.15%(6/13)、嘔吐46.15%(6/13)，糞便性狀分別為粘液便7.69%(1/13)、水樣便(3次/d)38.46%(5/13)、水樣便(4～6次/d)30.77%(4/13)、水樣便(>10次/d)15.38%(2/13)。

2.2 測(cè)序組裝及種鑒定結(jié)果 截至2021年9月，NCBI中共收錄51株布氏弓形桿菌的全基因組序列，除1株基因組長(zhǎng)度1.59 Mb，GC 30.3%以外，其余GC含量為26.7%～27.3%，基因組長(zhǎng)度2.07～2.47 Mb。收錄嗜低溫弓形桿菌30株，GC含量為27.0%～28.2%，基因組長(zhǎng)度1.85～2.37 Mb。本次12株弓形桿菌中，5株為嗜低溫弓形桿菌，7株為布氏弓形桿菌，基因組組裝信息如表1所示，基因組長(zhǎng)度與GC含量符合預(yù)期。

表1 12株弓形桿菌鑒定結(jié)果及組裝信息Tab.1 Identification and assembly information for 12 strains of Arcobacter

2.3 毒力基因 VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋結(jié)果顯示12株弓形桿菌均包含LPS、鞭毛、莢膜、LOS (lipooligosaccharide)、黏附相關(guān)的MOMP (major outer membrane protein)等毒力因子。但目前VFDB并未收錄弓形桿菌的毒力基因，因此參考文獻(xiàn)中提到的10個(gè)弓形桿菌常見(jiàn)的毒力基因運(yùn)用blastn進(jìn)行同源性檢測(cè)，以序列相似度作熱圖，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。5株嗜低溫弓形桿菌和7株布氏弓形桿菌均含有毒力基因cadF、ciab、cj1349、mviN、pldA、tlyA，5株嗜低溫弓形桿菌均不含有hecA、hecB、irgA和iroE基因，SJZAB-1不含有iroE基因，SJZAB-2不含有hecB基因。

2.4 耐藥基因 12株弓形桿菌的耐藥基因的注釋結(jié)果顯示，外排泵系統(tǒng)是其耐藥機(jī)制預(yù)測(cè)中占比較大的一部分，外排泵能夠通過(guò)主動(dòng)外排將各種不同的有毒化合物移出細(xì)胞，例如抗生素、重金屬、有機(jī)污染物等。外排泵耐藥系統(tǒng)共分為5個(gè)家族，分別是MFS(major facilitator superfamily antibiotic efflux pump)、SMR(small multidrug resistance antibiotic efflux pump)、MATE(multidrug and toxic compound extrusion transporter)、ABC(ATP-binding cassette antibiotic efflux pump)、RND(resistance-nodulation-cell division antibiotic efflux pump)，而12株弓形桿菌耐藥基因預(yù)測(cè)中RND、MFS和ABC占比較大，尤其以RND占比最多，主要的耐藥基因?yàn)閍deG、adeC、mdtF。5株布氏弓形桿菌與2株嗜低溫弓形桿菌中包含耐藥基因OXA-368，屬于OXA-β內(nèi)酰胺酶家族，該類耐藥基因可能幫助細(xì)菌產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶從而導(dǎo)致其對(duì)β內(nèi)酰胺類藥物耐藥。

2.5 MLST分型 MLST分型參考pubmlst(https://pubmlst.org/organisms)網(wǎng)站，分型結(jié)果如表2所示，以全基因組SNP使用NJ法做系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)化樹(shù)如圖2所示。

表2 12株弓形桿菌MLST分型Tab.2 MLST of 12 strains of Arcobacter

3 討 論

布氏弓形桿菌和嗜低溫弓形桿菌均是人獸共患的新發(fā)病原體，本次分離到的布氏弓形桿菌除2株分別未含有iroE和hecB毒力基因外，其余5株均含有常見(jiàn)的10種毒力基因。cadF、ciaB、cj1349、mviN、pldA和tlyA是在禽肉中所分離到的布氏弓形桿菌常見(jiàn)的毒力基因[8]，毒力基因hecA、hecB、irgA則較為少見(jiàn)[8-9]。值得注意的是，研究者發(fā)現(xiàn)，布氏弓形桿菌的hecA基因具有高度變異性，因此在以PCR為實(shí)驗(yàn)手段的研究中可能會(huì)由于引物設(shè)計(jì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果[10]。本次分離到的嗜低溫弓形桿菌均不含hecA、hecB、irgA3個(gè)基因，這與其他研究者的研究結(jié)果一致[11]。hecA是絲狀血凝素FHA(filamentous hemagglutinin)家族的一員，而hecB編碼一種相關(guān)溶血素激活蛋白，F(xiàn)HA蛋白廣泛分布于植物和動(dòng)物病原體中，有助于細(xì)菌的附著和聚集，并參與表皮細(xì)胞的殺死[5]?；魜y弧菌的irgA基因編碼一個(gè)鐵調(diào)控的外膜蛋白，irgA同源物已被證實(shí)在致病性大腸桿菌感染尿路的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用[12-13]。

弓形桿菌對(duì)多種抗生素具有耐藥性已在大量研究中被證實(shí)[14]，外排泵系統(tǒng)是本次分離的弓形桿菌中耐藥機(jī)制預(yù)測(cè)中占比較大的一部分，RND、MFS和ABC占比較大，RND是革蘭氏陰性菌耐多藥的重要決定因素之一[15]，Mateus C等的研究發(fā)現(xiàn)，布氏弓形桿菌的外排系統(tǒng)RND在幾種抗菌物質(zhì)，如抗生素、膽鹽和生物殺菌劑的排出中發(fā)揮作用，同時(shí)，RND在生物膜形成、在人血清中存活的能力和粘附腸細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用[16]。但是RND相關(guān)基因的存在是否是弓形桿菌耐藥產(chǎn)生的原因仍然需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

目前國(guó)內(nèi)針對(duì)弓形桿菌的研究較少，尤其是腹瀉病人中弓形桿菌的分離率以及菌株特征方面的研究亟需進(jìn)一步的補(bǔ)充，作為新發(fā)的人獸共患病原體，了解其本地的菌株分離率、耐藥及毒力情況能夠給防控提供理論支持。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：董新燕，張玉蘭，劉發(fā)強(qiáng)，等. 12株腹瀉病人糞便樣本中弓形桿菌全基因組結(jié)果分析[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(8)：698-702. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.098