辛凌翔，馮 宇，徐 磊，任小俠，孫浩杰，丁家波，毛開榮，李曉寧，李俊平，王 楠

布魯氏菌是一種革蘭氏陰性的兼性胞內(nèi)寄生菌，主要寄生于巨噬細(xì)胞和胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞[1]。布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種人獸共患傳染病，可導(dǎo)致多器官慢性損傷，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，嚴(yán)重威脅人類食品安全和公共衛(wèi)生安全[2]。預(yù)防控制布魯氏菌病對畜牧業(yè)生產(chǎn)發(fā)展和人類健康至關(guān)重要[3]，為減輕布魯氏菌病對人類和動物種群的影響，提出并制定可預(yù)防的策略十分關(guān)鍵[4]。到目前為止，疫苗免疫仍是防控該病的重要手段[5]，目前主要應(yīng)用的疫苗為光滑型疫苗，雖然具有良好的免疫效果，但安全性不高，并且容易產(chǎn)生陽性血清干擾診斷，無法區(qū)分免疫牛和自然感染牛[6]。由于粗糙型布魯氏菌毒力較弱，且能提供對光滑型布魯氏菌的免疫保護(hù)，不會干擾臨床檢測，因此，開發(fā)適宜的粗糙型疫苗具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)室前期以布魯氏菌A19為親本株，利用op誘導(dǎo)劑成功誘導(dǎo)出布魯氏菌弱毒株，命名為誘導(dǎo)株RB71。由于wboA基因編碼光滑型布魯氏菌脂多糖O側(cè)鏈合成相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶，wboA基因的不完整性對布魯氏菌光滑表型存在重要影響[7]。通過結(jié)晶紫染色鑒定、熱凝集試驗(yàn)、脂多糖完整性鑒定試驗(yàn)等方法，結(jié)合測序等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)株缺失的基因中含有wboA基因，誘導(dǎo)株連續(xù)培養(yǎng)30代基因組未發(fā)生突變，說明誘導(dǎo)株RB71為具有遺傳穩(wěn)定性的粗糙型布魯氏菌。為進(jìn)一步驗(yàn)證其安全性、免疫力與毒力，本實(shí)驗(yàn)利用布魯氏菌病的小鼠感染模型[8]，模擬布魯氏菌的感染，通過分離確認(rèn)感染等指標(biāo)[9]，探究粗糙型布魯氏菌誘導(dǎo)株RB71的生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和試驗(yàn)動物 牛種布魯氏菌誘導(dǎo)株RB71，由本實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)制備[10]；牛種布魯氏菌疫苗株A19，檢驗(yàn)用布魯氏菌強(qiáng)毒株M28[11]，來自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心；SPF級5～7周齡雌性BALB/c小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，購買后飼養(yǎng)于生物安全三級實(shí)驗(yàn)室的獨(dú)立送風(fēng)負(fù)壓飼養(yǎng)系統(tǒng)。涉及布魯氏菌活菌的試驗(yàn)操作及動物試驗(yàn)均在中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所BSL-3、ABSL-3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)購自BD公司；胰蛋白胨、酵母浸出膏購自Sigma公司。

1.1.3 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱，游標(biāo)卡尺。

1.2 藥敏試驗(yàn) 藥敏紙片擴(kuò)散法：將親本株A19和誘導(dǎo)株RB71分別以109CFU/mL涂布TSA平板，并在平板中央放置藥敏紙片，β-內(nèi)酰胺類抗生素包括青霉素(penicillin)、氨芐青霉素(ampicillin)、羧芐青霉素(carbenicillin)；非β-內(nèi)酰胺類抗生素包括環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)、鏈霉素(streptomycin)、四環(huán)素(tetracycline)、多粘菌素(polymyxin)、利福平(rifampin)，37 ℃孵育72 h后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈大小。

1.3 最小免疫劑量測定試驗(yàn) 用TSA培養(yǎng)基復(fù)蘇保存于-80 ℃冰箱的誘導(dǎo)菌株RB71，并擴(kuò)大培養(yǎng)至對數(shù)生長期，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，用生理鹽水稀釋至1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011CFU/只的免疫劑量。將60只5～7周齡BALB/c雌性小鼠，隨機(jī)分成6個(gè)免疫組，10只/組，同時(shí)設(shè)立PBS對照組。免疫45 d后，對6組小鼠進(jìn)行布魯氏菌強(qiáng)毒株腹腔注射攻毒，攻毒后45 d剖殺小鼠，無菌采取脾臟，研磨，10倍比稀釋勻漿液，每只小鼠均取100 μL稀釋菌液涂抹到TSA平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，確定誘導(dǎo)株的最小免疫劑量。

1.4 小鼠體內(nèi)感染試驗(yàn) 利用小鼠感染模型，對RB71誘導(dǎo)株的毒力和免疫保護(hù)力進(jìn)行評價(jià)[12]。用TSB培養(yǎng)基將布魯氏菌A19株、RB71誘導(dǎo)株培養(yǎng)至穩(wěn)定期，細(xì)菌計(jì)數(shù)并用生理鹽水將細(xì)菌稀釋至1×109CFU/mL。將5～7周齡雌性BALB/c小鼠27只，分組、每組9只，其中一組設(shè)為PBS對照組，其余兩組分別為親本株A19組和誘導(dǎo)株組，對小鼠腹股溝皮下注射免疫，每只100 μL(108CFU/只)。在免疫后2周、5周和8周解剖小鼠，無菌采取小鼠脾臟，研磨脾臟組織，10倍比稀釋后，涂布TSA平板，置于37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，計(jì)算脾臟細(xì)菌載量[13]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Graphpad Prism 5軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤來表達(dá)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 為探究缺失基因是否影響細(xì)菌對抗生素的耐受程度，本實(shí)驗(yàn)通過藥敏紙片擴(kuò)散法，分別以相同濃度涂布TSA平板，孵育后測量抑菌圈大小，來測定親本株A19、誘導(dǎo)株RB71對β-內(nèi)酰胺類抗生素和非β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性。通過對包括青霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素、四環(huán)素、多粘菌素、利福平在內(nèi)的8種抗生素進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示，兩個(gè)菌株對8種抗生素的抑菌程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，誘導(dǎo)株RB71相關(guān)基因的突變并沒有改變細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素和非β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性。

2.2 誘導(dǎo)株RB71最小免疫劑量的測定試驗(yàn)結(jié)果 誘導(dǎo)株RB71以1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011CFU/只的劑量腹股溝注射免疫小鼠45 d后，用強(qiáng)毒株M28 以1×103CFU/只的劑量進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，45 d后，剖殺并無菌取脾臟，圖2為布魯氏菌誘導(dǎo)株RB71以不同劑量感染小鼠后脾臟的直觀圖。脾臟分菌結(jié)果如表1所示：對照組全部分離出細(xì)菌，保護(hù)率為0，對照成立；免疫試驗(yàn)組在免疫劑量為109CFU/只時(shí)，50%(5/10)小鼠脾臟分離不到活菌，保護(hù)率達(dá)50%；免疫劑量為1010CFU/只時(shí)，30%(3/10)小鼠脾臟分離不到活菌，免疫保護(hù)率開始下降；免疫劑量為1011CFU/只時(shí)，20%(2/10)小鼠脾臟分離不到活菌，保護(hù)率降至20%。脾臟分菌結(jié)果顯示，當(dāng)免疫劑量為1×109CFU/只時(shí)，免疫保護(hù)率最高，當(dāng)免疫劑量達(dá)1×1011CFU/只時(shí)，感染小鼠后免疫保護(hù)程度反而降至與1×108CFU/只組相同，僅有20%的感染小鼠得到保護(hù)。因此，確定誘導(dǎo)株RB71對小鼠的最小免疫劑量為1×109CFU/只。

表1 誘導(dǎo)株RB71對感染小鼠的保護(hù)情況及感染小鼠的脾臟分離的活菌數(shù)量Tab.1 The protective effect of induced strain RB71 on infected mice and the status of bacteria shedding of infected mice

2.3 誘導(dǎo)株RB71的毒力測定試驗(yàn)結(jié)果 為研究誘導(dǎo)株RB71在小鼠體內(nèi)的毒力是否發(fā)生改變，將親本株A19和誘導(dǎo)株RB71以1×108CFU/只的劑量腹股溝皮下注射5～7周齡SPF級BALB/c小鼠，并在感染后2周、5周和8周剖殺小鼠，通過脾臟稱重和載菌量的方法評價(jià)細(xì)菌毒力，試驗(yàn)結(jié)果如圖3和圖4所示。感染后2周、5周和8周，RB71感染組的小鼠脾臟重量均低于A19感染組，其中感染后2周和8周存在差異(P<0.05)，感染后5周存在差異(P<0.01)，A19感染組的小鼠脾臟主要表現(xiàn)為體積增大，RB71感染組與空白對照組小鼠脾臟大小無明顯差異(P>0.05)。感染后5周，33%(1/3)的RB71感染組小鼠體內(nèi)細(xì)菌已被清除，A19感染組的脾臟載菌量仍維持高位；感染后8周，RB71感染組小鼠體內(nèi)細(xì)菌已全部清除，A19感染組的脾臟載菌量仍保持較高水平。由此可知，誘導(dǎo)株RB71對小鼠的毒力較弱，且毒力顯著低于親本株A19。

3 討 論

布魯氏菌脂多糖(LPS)是否具有完整的O鏈?zhǔn)菂^(qū)分粗糙型布魯氏菌與光滑型布魯氏菌的依據(jù)，光滑型布魯氏菌具有完整的O鏈，粗糙型布魯氏菌沒有O鏈或O鏈不完整[14]。光滑型布魯氏菌和粗糙型布魯氏菌在血清學(xué)試驗(yàn)上無交叉反應(yīng)，但可具有免疫交叉保護(hù)性。目前我國對牛布魯氏菌病應(yīng)用的疫苗主要是A19疫苗，但由于A19疫苗株為光滑型布魯氏菌強(qiáng)毒株，使得免疫時(shí)易造成環(huán)境污染和人員感染，且無法用常規(guī)的血清學(xué)檢測方法鑒別診斷免疫動物和自然感染動物[15]。開發(fā)粗糙型布魯氏菌疫苗可有效解決光滑型疫苗免疫不能區(qū)分自然感染與疫苗免疫的問題。獲得粗糙型布魯氏菌突變體的方法主要包括，培養(yǎng)過程中自發(fā)變異、在不同培養(yǎng)基或體內(nèi)中連續(xù)傳代變異、利用分子遺傳學(xué)的方法誘變等[16]。本實(shí)驗(yàn)室前期以A19株為親本株，通過op誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的方法，已獲得了1株粗糙型的具有良好遺傳穩(wěn)定性的牛種布魯氏菌誘導(dǎo)株[10]。相對于抗生素抗性培養(yǎng)基篩選獲得的菌株，該方法誘導(dǎo)效率更為高效，還可以避免由于抗生素抗性基因的存在而導(dǎo)致的菌株對抗生素不敏感的問題，更好地保證生物安全性[17-18]。

為探究缺失基因是否會影響或改變細(xì)菌對抗生素的耐受程度，本研究通過藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，親本株A19與誘導(dǎo)株RB71對β-內(nèi)酰胺類抗生素和非β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性無顯著差異。為驗(yàn)證誘導(dǎo)株RB71作為疫苗候選株對動物的保護(hù)力，本研究通過動物試驗(yàn)測定了誘導(dǎo)株RB71免疫小鼠后的攻毒保護(hù)率，結(jié)果顯示其最佳免疫劑量為109CFU/只，保護(hù)率可以達(dá)到50%。誘導(dǎo)株RB71最小免疫劑量測定試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)免疫劑量高于1×109CFU/只時(shí)，免疫保護(hù)率逐漸下降，分析主要原因?yàn)檎T導(dǎo)株RB71雖為毒力弱的菌株，但是活菌在體內(nèi)仍具備繁殖能力及一定的致病性，當(dāng)誘導(dǎo)株RB71免疫劑量較小時(shí)，無法抵抗強(qiáng)毒株的感染，免疫保護(hù)率較低。但當(dāng)免疫劑量高于1×109CFU/只時(shí)，本實(shí)驗(yàn)中免疫后90 d，小鼠脾臟可能無法清除感染的菌株。究竟脾臟分離的菌株是感染的強(qiáng)毒株還是免疫的RB71株，或是兩種菌株共同存在，仍需通過進(jìn)一步毒力試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。通過測定感染小鼠脾臟的載菌數(shù)和脾臟大小來評價(jià)布魯氏菌誘導(dǎo)株RB71的毒力強(qiáng)弱[19]，證實(shí)誘導(dǎo)株RB71引起脾臟腫大程度遠(yuǎn)低于親本株A19，其感染機(jī)體后能被逐漸清除，即毒力減弱后仍能引起一定的免疫反應(yīng)，能對動物抗體產(chǎn)生一定保護(hù)力。通過對誘導(dǎo)株RB71的生物學(xué)特性研究，證明誘導(dǎo)株RB71對抗生素敏感、毒力小，具有良好的免疫原性。為研究制備一種低毒力、高安全性的布魯氏菌病疫苗株提供新的可能。

利益沖突：無

引用本文格式：辛凌翔，馮宇，徐磊，等. 1株粗糙型布魯氏菌誘導(dǎo)株RB71的生物學(xué)特性研究[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(8)：693-697. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.094