楊景滟，陳 靜，王利瓊

(1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院 檢驗科，四川 南充 637000；2.四川大學華西醫(yī)院廣安醫(yī)院 消化內科，四川 廣安 638500)

食管癌是全球常見的一種腫瘤疾病，死亡率較高，2014年全球新發(fā)食管癌患者約45.6萬例，因食管癌死亡者約40萬例，在惡性腫瘤中發(fā)病率位居第8位，死亡率位居第6位[1]。2015年我國新發(fā)食管癌病例超過24萬，因食管癌死亡患者超過18萬[2]，總體預后欠佳。為了盡早對食管癌進行診療，改善患者預后，探索與之相關的靶標基因很有必要。研究表明微小核糖核酸(MicroRNA，miRNA)參與了細胞增殖、凋亡、侵襲、分化等過程，它與腫瘤疾病密切相關，可通過不同途徑發(fā)揮抑癌或促癌作用[3]。有學者指出miR-106b參與了腫瘤疾病發(fā)生與進展過程，它在子宮內膜癌組織中呈高表達，且其過表達與癌細胞遷移、組織分化程度有關[4]。楊林聲等[5]研究提示視網(wǎng)膜母細胞瘤患者的癌組織中miR-106b表達上調，其能增強這類癌細胞增殖能力。而李元梅等[6]則發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌組織中miR-106b表達較癌旁組織降低，其過表達能促進癌細胞凋亡。這表明miR-106b在腫瘤中的作用機制比較復雜，在不同腫瘤中可能發(fā)揮不同生物學功能?；诖?，本研究選取139例食管癌患者進行研究，分析miR-106b在這類癌組織中的表達情況，并探討其對預后的影響，以便提高食管癌診療的及時性與有效性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2016年5月至2019年5月收治的139例食管癌患者為研究對象。本次納入樣本通過優(yōu)效性檢驗樣本量予以計算，參考相關文獻[7]報道及前期工作基礎，本次至少需要120例樣本，故納入160例患者，因受納入以及排除標準限制，最終有139例符合要求。納入標準：經(jīng)病理診斷證實為食管癌患者，且年齡≥18歲；近6個月內無大手術史者；既往無放療、化療、免疫治療史者；首診患者；完全知曉研究內容，并簽署同意書者。排除標準：復發(fā)性食管癌者；患嚴重腦血管、心血管等其他危及生命的疾病者；就診時有慢性或急性感染者；患其它原發(fā)性腫瘤者；有自身免疫性病史者。在139例患者中，男76例，女63例，年齡32～74歲，平均(58.32±10.45)歲；臨床分期：I期38例，II期52例，III期49例；腫瘤直徑：≥5 cm 61例，<5 cm 78例；分化程度：低分化59例，中高分化80例；淋巴結轉移：有43例，無96例；大體分型：潰瘍型53例，膨出型25例，髓質型33例，其它28例。研究方案獲本院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 miR-106b檢測 采用實時逆轉錄聚合酶鏈反應法(Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測食管癌、癌旁組織(距癌邊緣3cm)中miR-106b表達水平，主要儀器包括超低溫冰箱(海爾集團，BCD-176TS型)、高速離心機(湘儀集團，TG16-WS型)、凝膠圖像分析系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司，WD-9413B型)、實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司，7500型)。主要試劑為Trizol試劑、逆轉錄試劑、異丙醇、瓊脂糖，購自北京全式金生物公司。具體如下：(1)提取總RNA：待獲取組織樣本后，置于凍存管內，并放置在液氮環(huán)境下備用。取出樣本，置于無菌EP管內，取1 mL Trizol試劑加入，混勻，室溫下反應5 min。取200 μL氯仿加入，混勻，室溫下反應10 min，4 ℃下離心15 min(12 000 rpm)。吸取上層水相，并移至新EP管內，做好標記。取500 μL異丙醇置于新EP管內，混勻，在室溫下反應10 min，4 ℃下離心15 min(12 000 rpm)，棄上清。取500 μL 70%乙醇加入，4℃下離心8 min(8 000 rpm)，棄上清。取DEPC水40 μL加入促進溶解，存放至-80 ℃環(huán)境下備用，并留取少量樣本檢測RNA濃度與純度。(2)逆轉錄與PCR檢測：經(jīng)反轉錄試劑對總RNA行逆轉錄，合成cDNA，并行PCR檢測，反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，95 ℃退火5 s，60 ℃延伸31 s，40個循環(huán)。上、下游引物序列：①miR-106b分別為5′-TGCGGCAACACCAGTCGATGG-3′、5′-CCAGTGCAGGGTC CGAGGT-3′；②內參引物U6：5′-TGCGGGTGCTCG CTTCGGCAGC-3′、5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。經(jīng)2-△△CT表示miR-106b表達水平。

1.2.2 隨訪分析 在患者術后隨訪24個月，隨訪方式根據(jù)患者實際情況而定，包括微信隨訪、電話隨訪、門診隨訪等，分析患者的2年累積生存率。累積生存情況即以患者術后第1天作為隨訪起始日，以隨訪結束為截止日，記錄該期間的累積生存人數(shù)，生存率即T時刻仍存活例數(shù)/總病例數(shù)。

2 結果

2.1 食管癌、癌旁組織中miR-106b表達量及其對食管癌的診斷價值 食管癌組織中miR-106b表達量為(56.74±12.32)，低于癌旁組織的(221.54±56.52)(t=33.588，P<0.05)，見圖1。miR-106b表達量診斷食管癌的AUC為0.758，(標準誤：0.029，P=0.000，95%CI：0.701～0.816)，最佳界值為138.080，敏感度為80.00%，特異度為60.90%，ROC曲線見圖2。

圖1 食管癌、癌旁組織中miR-106b的相對表達量

2.2 miR-106b表達與食管癌病理特征的關系 根據(jù)食管癌患者癌組織中miR-106b表達均值分成高表達組(n=75，≥均值)、低表達組(n=64，<均值)。miR-106b低表達組臨床分期III期、腫瘤直徑≥5 cm、腫瘤低分化、淋巴結轉移占比高于高表達組(P<0.05)，兩組性別、年齡、大體分型比較無差異(P>0.05)，見表1。

表1 miR-106b表達與食管癌病理特征的關系[n(%)]

2.3 食管癌患者生存、死亡情況及預后危險因素分析 通過隨訪24個月，提示139例患者生存107例，死亡32例。以表2中各變量作為自變量X，以預后為因變量Y(生存=0，死亡=1)，COX多因素回歸性分析提示臨床分期III期、腫瘤直徑≥5 cm、腫瘤低分化、淋巴結轉移、miR-106b低表達是預后危險因素，術后放/化療是預后保護因素(P<0.05，見表2)。

表2 食管癌患者預后的COX多元回歸性分析

2.4 不同miR-106b表達患者的2年累積生存情況分析 通過隨訪分析提示，miR-106b高表達組2年累積生存率為86.67%(65/75)，miR-106b低表達組2年累積生存率為65.63%(42/64)。miR-106b低表達組2年累積生存率低于高表達組(log-rankx2=8.628，P<0.05，見圖3)。

圖3 不同miR-106b表達患者2年累積生存函數(shù)

3 討論

食管癌發(fā)病原因復雜，包括吸煙史、飲食習慣、遺傳、生活習慣、免疫功能低下等，近年來，隨著食管癌診斷技術的進展，其檢出率逐年增高，但預后仍不夠理想[8]。研究表明miRNAs與腫瘤發(fā)生存在密切關聯(lián)，它參與了多種腫瘤疾病的調控，例如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、腸癌等，在這類疾病中具有促癌或抑癌基因作用，對癌癥早期診療有重要意義[9]。通過尋求與食管癌相關的miRNAs，可能為該病早期診斷與治療提供依據(jù)。目前，研究指出miR-106b與腫瘤發(fā)生有關，它介導的還原性磷酸酶與張力蛋白同源物可能通過調節(jié)磷脂酰肌醇3激酶/Akt通路，參與乳腺癌進展[10]。Xu等[11]發(fā)現(xiàn)miR-106b抑制劑能促進肝癌細胞凋亡，提高肝細胞癌治療的敏感性。Sun等[12]研究則提示miR-106b能通過靶向殘疾基因同源物，對肝癌細胞的侵襲、增殖與轉移進行調節(jié)。這表明miR-106b與多種惡性腫瘤發(fā)病、進展過程有關，基于此，臨床有必要進一步明確miR-106b與食管癌及其預后的關系，為該病診斷與治療提供可靠信息。

本次結果顯示，與癌旁組織相比，食管癌組織中miR-106b表達量下調，其對食管癌診斷有一定價值，表明miR-106b與食管癌發(fā)生可能有關聯(lián)。miR-106b是miR-106b-25基因簇的重要成員，既往研究發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤組織內呈過表達，與腫瘤新生血管形成、細胞增殖有關[13-14]。隨著臨床研究進展，有學者指出甲狀腺癌組織中miR-106b表達較癌旁組織下調[15]。這表明miR-106b的生物功能多樣化，可能在不同腫瘤中發(fā)揮的作用具有差異。Jiao等[16]發(fā)現(xiàn)miR-106b高表達能下調Zbtb7a，從而提高膽管癌患者5-氟尿嘧啶化療的敏感性，而低表達的miR-106b與膽管癌預后不良有關，表明miR-106b過表達可能發(fā)揮抑癌作用。上述均為本研究結論給予了支持，本次研究通過進一步分析顯示食管癌患者miR-106b表達與腫瘤分期、腫瘤直徑、分化程度、淋巴結轉移有關。miR-106在食管癌組織內表達降低，低表達的miR-106可導致其對癌細胞增殖、侵襲的抑制作用減弱，有利于腫瘤生長，提高惡化程度，增加淋巴結轉移風險。

食管癌早期缺乏典型癥狀，易被忽視，多數(shù)病人就診時已進展成中期或晚期，治療難度大，預后非常差[17]。宋春洋等[18]發(fā)現(xiàn)臨床分期、術后輔助治療等因素與食管癌手術患者的預后有關。本次結果提示食管癌患者預后與臨床分期、腫瘤直徑、分化程度、淋巴結轉移有關，這些因素在既往研究[19]中已基本得到證實。本次研究還發(fā)現(xiàn)miR-106b高表達是食管癌預后的危險因素之一，且其過表達能降低2年累積生存率。通過前面的分析已發(fā)現(xiàn)miR-106b在食管癌組織中呈低表達，低表達的miR-106b可能通過促進癌細胞增殖，導致腫瘤進一步惡化，加重病情，從而影響預后。Hoshino等[20]研究顯示食管鱗癌組織中miR-106b表達降低，與本次結論吻合，該研究認為食管鱗癌患者miR-106b表達降低的原因可能為miR-106b靶基因增高，促使組織內miR-106b消耗增加，導致其表達下調，但研究中尚未明確miR-106b與食管鱗癌病理特點及預后的具體關系，本研究則對此進行了闡述，且通過COX多元回歸分析與生存曲線證實miR-106b與食管癌預后有關。韓東等[21]則發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中miR-106b表達較癌旁組織增高，與本次結論相悖，原因可能比較復雜，也許與納入患者個體病情差異、免疫功能、既往病史等因素有關?？傊?，關于miR-106b在食管癌中的作用機制，臨床還有待更深入的探索。

綜上所述，食管癌組織中miR-106b表達下調，低表達的miR-106b可導致預后不良。本研究局限性為關于miR-106b與食管癌及其預后的關系還處于初步探索階段，未來還需延長隨訪時間，更進一步闡述其對食管癌預后的影響。