閻 晨,劉 濤,宣 斐

(新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 麻醉與圍手術期醫(yī)學中心，新疆 烏魯木齊 830000)

隨著生命醫(yī)學和科學技術的進步，越來越多疾病有機會通過全身麻醉后手術進行修復。然而，無論嚙齒類還是靈長類動物，多數(shù)臨床前實驗都已證明，全身麻醉會造成認知功能損傷[1]。七氟烷是一種臨床常用麻醉劑，其優(yōu)勢包括起效快、效能高、可控性強及血流動力學穩(wěn)定[2]?；仡櫺匝芯糠治鲲@示，幼齡兒童接受七氟烷全身麻醉會增加其成年后讀寫功能損害的風險[3]。此外，在成年患者中，七氟烷麻醉也會造成短期或長期的認知功能損傷[4]。而在老齡患者中，全身麻醉手術則是老年癡呆發(fā)病的獨立危險因素之一[5]。大腦海馬組織是機體認知與學習中心，神經(jīng)元樹突是信息儲存記憶的生理基礎。α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)是廣泛存在于海馬神經(jīng)元中突觸蛋白，當α-Syn過量表達時會異常聚集，形成神經(jīng)毒性，造成神經(jīng)元樹突棘可塑性降低，導致學習認知功能降低[6]?，F(xiàn)階段，已有不少研究討論七氟烷對患者學習認知功能的影響機制[7]，但針對α-Syn介導的樹突棘可塑性降低鮮有報道。因此，本研究擬從體內(nèi)和體外兩個方面探討七氟烷對小鼠樹突棘結構與學習記憶功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 16只野生型(Wild-type,WT)C57BL/6J 雄性小鼠與16只α-synuclein基因敲除(α-syn knockout,KO)C57BL/6J 雄性小鼠，由南京大學模式動物研究所提供。所有動物體質量為23～28 g，年齡8～10周，飼養(yǎng)于SPF動物房中，室內(nèi)溫度控制23～25 ℃，濕度控制為60%～70%，12 h/12 h晝夜節(jié)律。

1.2 實驗試劑與儀器 七氟烷(上海艾伯維公司)；HT22細胞株(上海賽百慷生物技術公司)；高爾基染色試劑盒(美國HitoBiotec公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(內(nèi)蒙古金源康生物公司)；外源性腦源性生長因子(Brain-derived neurotrophic factor，美國Sigma公司)；MTT噻唑藍粉末(Thiazolyl blue tetrazolium bromide，北京索萊寶生物公司)；Morris水迷宮(北京眾實迪創(chuàng)公司)；ZH-MZJ型小動物麻醉機(安徽正華生物儀器公司)；Duo Link 鄰位連接檢測試劑盒(美國Sigma公司)；兔源Anti-synuclein抗體(美國abcam公司)；鼠源Anti-TrkB(美國abcam公司)；兔源Anti-p-TrkB(沈陽萬類生物公司)；兔源Anti-TrkB(沈陽萬類生物公司)；鼠源Anti-β-actin(沈陽萬類生物公司)。

1.3 動物分組與模型構建 所有動物適應實驗室環(huán)境喂養(yǎng)1周后，隨機分為WT對照組(WT Control)，KO對照組(KO Control)，WT+七氟烷(WT+Sev)組，KO+七氟烷(KO+Sev)組，每組8只。自制一個60 cm×30 cm×25 cm的透明麻醉盒，兩側設有進氣口與出氣口。將WT+Sev組與KO+Sev組小鼠放入麻醉盒中，進氣口與麻醉機相連，出氣口連接氣體檢測儀。通過麻醉機將空氣混合3%七氟烷自進氣口輸入至麻醉盒中，麻醉過程中控制溫度為37 ℃，持續(xù)6 h。WT Control組與KO Control組小鼠吸入空氣。次日，待所有小鼠蘇醒后進行水迷宮訓練。

1.4 Morris水迷宮訓練與測試Morris 水迷宮測試裝置主體是一個圓柱體水箱，直徑120 cm，高50 cm。水箱中注入約40 cm深水，設置水溫條件為恒溫24 ℃，并使用白色淀粉鋪滿水底，水箱中固定一個水面以下1.5 cm的逃生平臺，水箱周圍固定一些幾何圖形，幫助小鼠確認方向。水箱上裝有一個攝像機記錄小鼠游泳圖像并將數(shù)據(jù)傳輸?shù)接嬎銠C上進行軌跡分析。計算機將水面分為四個象限，設置存在逃生平臺的象限為第一象限，順時針設為第二現(xiàn)象，第三象限和第四象限。將小鼠從任意象限放到水池中，讓它們自由游泳直到登上平臺，設置自由尋找時間為90 s，90 s內(nèi)未登上平臺則引導至平臺停留10 s。每天重復4次，訓練4 d。分析小鼠潛伏期，平均速率和平均距離。結束訓練后2 d，將小鼠自第三象限丟入水中，撤去逃生平臺，記錄小鼠逃避潛伏期，穿越平臺次數(shù)與在第一象限中停留時間(靶象限)。

1.5 電生理場電位記錄 將小鼠的大腦小心地取出放置在冷卻的人工腦脊髓液緩沖液中，緩沖液包括124 mM NaCl，3 mM KCl，26 mM NaHCO3、2 mM CaCl2、1 mM MgSO4、1.25 mM KH2PO4和10 mM D-葡萄糖，通入95%O2和5%CO2。冰凍后將腦組織切成300 nm厚的切片，并在人工腦脊液緩沖液中孵育2 h。用金屬探針將腦切片固定在8×8陣列微電極室中，并使用MED64 Mobius微電極陣列系統(tǒng)(Microelectrode array system,MEA)記錄長期增強(Long-term potentiation,LTP)。測試刺激強度位于DG區(qū)域，并根據(jù)I / O(輸入/輸出)曲線設置為引起最大場興奮性突觸后電位(Field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)響應的30%(或50%)。20 min后，記錄基線，并通過重復3次的100 Hz高頻刺激誘導LTP，并在另外60 min內(nèi)記錄fEPSP斜率變化，記為長時程電位(Long-term potentiation,LTP)。

1.6 高爾基染色與計數(shù) 按照HitoBiotec公司生產(chǎn)的Hito Golgi-Cox Optimstain Kit 高爾基染色試劑盒中說明書步驟進行處理。取小鼠腦組織，浸沒于試劑盒中溶液1與溶液2混合液中(提前24 h配置)，次日跟換混合液，室溫避光保存2周。取組織洗去混合液，浸入溶液3中，避光儲存24 h，更換溶液再放置4 d。取組織放入預冷的異戊烷中冷凝成塊，擦去表面異戊烷。使用冰凍切片及切成約100 μm切片，載玻片貼片后避光陰干。玻片置入溶液4與溶液5混合液中反應，結束后蒸餾水沖洗，切片放入梯度乙醇中脫水，每次60 s，再以二甲苯溶液透化組織，每次2 min。最后使用中性樹脂封片，顯微鏡下觀察捕獲圖像，以神經(jīng)元樹突棘密度反映神經(jīng)元形態(tài)結構變化。

1.7 Western blot實驗 取小鼠海馬組織大腦，放于冰盒上，全程維持低溫環(huán)境，稱重后根據(jù)重量加入RIPA裂解液。使用勻漿機充分勻漿10 min，結束后冰浴充分裂解30 min，離心機預冷4 ℃，調(diào)至12 000 rpm，離心30 min，精確記錄體積，檢測蛋白濃度，加入溴酚藍上樣緩沖液。將樣品放入100 ℃金屬浴中煮沸5 min，待冷卻后冰箱冷凍保存。配置SDS-PAGE凝膠進行電泳，每一泳道上樣50 μg，設置電泳條件60 V，30 min，90 V，100 min，待溴酚藍到達分離膠底部時，停止電泳，根據(jù)分子標記物切取所需蛋白范圍的凝膠，剪取與凝膠大小相似的PVDF膜，選擇濕轉轉膜法，設置條件恒流300 mA，60 min。取出PVDF膜，4%脫脂牛奶中，室溫孵育1 h。洗凈牛奶后，將PVDF膜放入對應一抗溶液中，4 ℃條件下孵育過夜。次日取出條帶漂洗，加入HRP標記的二抗稀釋液，搖床上避光孵育1 h。PBST漂洗條帶后，加入配好的ECL發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)下顯影，保存圖像，最終使用Image J軟件進行分析。

1.8 細胞培養(yǎng)與活率 檢測小鼠海馬神經(jīng)元細胞HT22細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加100 μg/mL鏈霉素與100 U/mL盤林西林，培養(yǎng)條件為37 ℃培養(yǎng)箱中通入5% CO2。待細胞生長至90%融合，胰酶消化細胞，等量接種于96孔板中，設組為對照組(Control)，七氟烷組(Sev)，80 ng/mL腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子組(BDNF 80 ng/mL)，七氟烷+40 ng/mL腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子組(Sev+BDNF 40 ng/mL)，七氟烷+80 ng/mL腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子組(Sev+BDNF 80 ng/mL)。七氟烷組暴露于含2%七氟烷環(huán)境中2 h，隨后添加BDNF，在正常培養(yǎng)環(huán)境中孵育24 h。次日取出96孔板，棄去上清，每孔添加50 μL 5 mg/mL MTT溶液，培養(yǎng)箱中孵育2 h。取出96孔板，每孔添加100 μL DMSO溶液，充分震蕩10 min使甲臜充分溶解，在570 nm激發(fā)波長處測定其吸光度值。

1.9 α-synuclein與TrkB的鄰位 連接(Proximity Ligation Assay,PLA)檢測根據(jù)DuoLink廠家提供說明書進行細胞處理操作。將步驟1.8中培養(yǎng)于96孔板中的細胞PBS漂洗后加入兔源Anti-α-Synuclein與鼠源Anti-TrkB抗體孵育2 h。PBS漂洗樣本后加入正鏈PLA探針識別鼠源抗體和負鏈標記的PLA探針識別兔源抗體，共同孵育1 h。PBS漂洗樣品并加入連接酶，孵育1 h，DAPI染色液37 ℃避光孵育15 min。PBS漂洗樣品，加入擴增緩沖液，使用熒光顯微鏡對每個細胞中紅色點信號進行記錄，最后使用Duolink成像工具對結果進行定量。

2 結果

2.1 七氟烷對小鼠認知功能的影響 為了探究在α-synuclein存在情況下，七氟烷對小鼠學習記憶功能的影響，本研究測試了Morris實驗中小鼠的空間參考記憶。如圖1、表1所示，訓練期間，WT Control組與KO Control組在逃避潛伏期沒有顯著性差異(P>0.05)。與此同時，如表2所示，測試期間，WT Control組與KO Control組在逃避潛伏期，穿越平臺次數(shù)和靶象限停留時間之間都不存在統(tǒng)計學差異(P>0.05)。然而，與Control組相比，七氟烷吸入麻醉的小鼠訓練期間逃避潛伏期顯著增加(P<0.05)，在測試中，穿越平臺次數(shù)顯著減少(P<0.05)，靶象限停留時間顯著增加(P<0.05)。此外，KO+Sev組小鼠Morris水迷宮各項指標優(yōu)于WT+Sev組小鼠，且測試中逃避潛伏期兩組數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 訓練期間小鼠逃避潛伏期

表1 訓練期間小鼠逃避潛伏期統(tǒng)計

表2 測試期間小鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)與靶象限停留時間統(tǒng)計

2.2 七氟烷對小鼠海馬 CA3-CA1途徑長時程電位與樹突棘狀態(tài)的影響如圖2、3所示，腦組織電生理檢測中興奮性突觸后電位(fEPSP)斜率常作為觀察LTP變化的指標。WT Control組小鼠與KO Control組小鼠海馬組織CA1-CA3途徑中LTP沒有差異(P>0.05)。與對照組相比，七氟烷造成小鼠fEPSP斜率顯著降低(P<0.05)，此外，與WT+Sev組相比，KO+Sev組小鼠fEPSP斜率降低，且存在顯著性差異(P<0.05)。高爾基染色樹突棘密度能夠反映樹突棘的可塑性，與LTP結果一致，WT Control組與KO Control組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度較高且沒有顯著差異，但七氟烷吸入麻醉造成小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度降低。

#：與Control組比較， P<0.05；*：與WT+Sev組比較， P<0.05。

2.3 七氟烷對小鼠海馬組織中α-synuclein、BDNF與p-TrkB的影響 如圖4所示，本研究中使用小鼠為WT小鼠與KO小鼠，因此，α-synuclein KO小鼠基本不表達α-synuclein，WT Control組小鼠正常表達α-synuclein。七氟烷吸入則顯著增加了小鼠腦組織中α-synuclein表達(P<0.05)。此外，本研究中，與Control組相比，七氟烷給藥顯著降低了小鼠海馬中BDNF表達(P<0.05)，降低了TrkB磷酸化水平(P<0.05)。與此同時，與WT+Sev組相比，KO+Sev組小鼠腦組織中BDNF與TrkB表達顯著增加(P<0.05)。

#：與Control組比較， P<0.05。

#：與Control組比較， P<0.05；*：與WT+Sev組比較， P<0.05。

2.4 外源性BDNF對七氟烷干預的HT22細胞活率的影響 如圖5所示，與對照組相比，七氟烷造成HT22細胞活力顯著降低(P<0.05)，而外源性BDNF干預則促進了HT22細胞的生長(P<0.05)。與此同時，細胞體系中添加外源性BDNF能夠顯著提高HT22細胞活率(P<0.05)，且具有劑量依賴性。

#：與Control組比較， P<0.05；*：與Sev組比較， P<0.05。

2.5 外源性BDNF對HT22細胞中α-Syn與TrkB鄰位結合的影響 如圖6所示，對照組與BDNF(80 ng/mL)組HT22細胞中幾乎檢測不到α-Syn與TrkB的鄰位結合。與對照組相比，七氟烷造成HT22細胞中α-Syn與TrkB鄰位結合較多，然而，外源性BDNF干預則顯著減少了α-Syn與TrkB結合，且結果呈劑量依賴性。

A：Control組；B：Sev組；C：BDNF(80 ng/mL)組；D：Sev+BDNF(40 ng/mL)組；E：Sev+BDNF(80 ng/mL)組；紅色點表示α-Syn與TrkB結合；#：與Control組比較， P<0.05；*：與Sev組比較， P<0.05。

3 討論

本研究重點論證了小鼠吸入七氟烷麻醉會提高海馬組織中α-synuclein(α-Syn)表達，降低BDNF表達，且α-Syn會與BDNF競爭TrkB受體，干擾TrkB信號傳導，造成長時程電位(Long-term potentiation,LTP)抑制與樹突棘可塑性損傷，導致小鼠學習和記憶功能障礙。

Morris水迷宮訓練與測試是研究嚙齒類動物空間學習功能的首要實驗方法[8]。本研究中，WT Control組與KO Control組中兩種不同表型小鼠在空間記憶方面表現(xiàn)相似，沒有差異。然而，七氟烷吸入麻醉卻會造成WT小鼠與KO 小鼠在空間記憶與獲取信息方面，與對照組相比，表現(xiàn)變差。因此，七氟烷麻醉是造成小鼠學習與記憶能力損傷的原因。與此同時，水迷宮訓練與測試中，部分結果顯示KO+Sev組小鼠優(yōu)于WT+Sev組小鼠，提示敲除α-synuclein在一定程度上能夠緩解七氟烷造成的小鼠學習記憶損傷。

LTP的形成被認為是學習和記憶過程中潛在的細胞機制[9]。本研究結果顯示，正常情況下，敲除α-Syn不影響LTP。這可能是因為LTP主要是由于CA3-CA1途徑中突觸后電位機制引起的，但是α-Syn對突觸傳遞的影響主要是突觸前，因此，KO Control組小鼠海馬CA3-CA1途徑中LTP與WT Control組小鼠沒有差異。然而，α-Syn過量表達卻會造成神經(jīng)毒性。α-Syn廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元中，位于突觸小泡附近的突觸前末端。近期研究顯示，α-Syn在阿爾茲海默病研究中會增強Aβ蛋白分泌，上調(diào)淀粉樣前體蛋白表達的同時導致細胞死亡[10]。此外，α-Syn的表達增加，在細胞培養(yǎng)和動物模型中造成炎癥反應，從而抑制LTP的形成，導致小鼠空間記憶功能的退化[11]。因此，本研究中，與文獻報道相似，七氟烷造成α-Syn表達增加，造成小鼠海馬神經(jīng)元突觸可塑性降低，導致LTP抑制。然而，與WT+Sev組相比，KO+Sev組小鼠海馬神經(jīng)元LTP顯著升高，提示α-Syn表達升高是造成LTP抑制的重要原因。

與LTP密切相關的是神經(jīng)元突觸可塑性。神經(jīng)元是信息接納、加工與整合的基本單位。樹突棘是神經(jīng)元樹突上棘狀突起，與電信號接收和傳遞密切關聯(lián)，且樹突棘密度往往與信息傳遞速率相關[12]。與此同時，樹突棘的形成、脫落、擴張和萎縮與突觸可塑性相關，樹突棘的高度可塑性是腦內(nèi)神經(jīng)元發(fā)揮學習記憶功能的生理基礎[13]。因此，本研究中顯示的七氟烷介導的小鼠海馬CA1區(qū)樹突棘密度降低是導致小鼠Morris水迷宮中空間記憶能力衰退的重要原因。

海馬組織作為大腦長期學習與記憶核心區(qū)域，也是七氟烷吸入麻醉過程中最敏感的區(qū)域。海馬組織中BDNF是學習與記憶涉及的神經(jīng)生物學機制的關鍵分子[14]。通過檢測小鼠海馬組織中BDNF相關蛋白表達，結果顯示與對照組相比，七氟烷造成小鼠海馬組織中BDNF與p-TrkB表達顯著降低，且α-Syn敲除小鼠在七氟烷干預后，與WT+Sev組小鼠比較，BDNF與p-TrkB表達顯著升高。溯其原因是七氟烷造成BDNF表達降低，BDNF作用機理是通過原肌球蛋白激酶受體B(Tropomyosin kinase receptor B,TrkB)起作用。BDNF與TrkB的結合通過其胞內(nèi)域中酪氨酸殘基的構象變化發(fā)生磷酸化，激活有絲分裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)，磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)和磷脂酶C-γ1(Phospholipase C-γ1,PLC-γ1)觸發(fā)其二聚化信號通路，介導神經(jīng)元分化，提高神經(jīng)元存活和促進神經(jīng)發(fā)生[15]。此外，當α-Syn過度表達時，α-Syn會與BDNF選擇性競爭TrkB受體，從而抑制BDNF-TrkB信號通路，抑制神經(jīng)元分化并導致神經(jīng)元死亡[16]。本研究中，通過體外細胞實驗首先驗證了外源性BDNF能夠有效改善七氟烷造成的HT22細胞死亡。與此同時，本研究通過鄰位連接實驗證實了α-Syn與BDNF競爭性結合TrkB位點。

綜上所述，七氟烷會造成小鼠認知功能損傷，其機理是通過增加α-Syn表達，下調(diào)BDNF水平，減少TrkB磷酸化，從而降低海馬CA1區(qū)樹突棘可塑性，抑制長時程電位從而造成小鼠學習記憶功能損傷。