李媛彬，陳 歆，邱愛珠，丘繼哲，袁湘蓮，陳 壯*

（湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)院，湖南 株洲 412012）

0 前言

心肌缺血再灌注（I/R）損傷引起的心肌細(xì)胞死亡是臨床再灌注治療中并發(fā)癥發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素[1]。因此，如何有效地減少心肌I/R中的細(xì)胞死亡是一個(gè)亟待解決的問題。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作為胞質(zhì)信號網(wǎng)絡(luò)的整合者，與氧化應(yīng)激、泛素蛋白酶體途徑和炎癥反應(yīng)相關(guān)，參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[2]。

研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可引起再灌注后心肌的自噬，細(xì)胞自噬可降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中無功能的錯誤折疊蛋白，以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬可能與缺血的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度有關(guān)。在輕度缺血時(shí)誘發(fā)細(xì)胞自噬導(dǎo)致ATP增加保證細(xì)胞的能量供應(yīng)，而在重度缺血時(shí)伴發(fā)自噬流受損而造成細(xì)胞死亡。換句話說，適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬對心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，但過度或強(qiáng)烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會阻礙自噬流引起心肌細(xì)胞死亡。因此，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與心臟自噬的潛在關(guān)系及機(jī)制具有重要意義。

干擾素基因刺激因子（STING）通常位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，可被病毒感染、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、游離細(xì)胞質(zhì)DNA等因素激活[4]。STING參與了各種疾病中的炎癥和免疫反應(yīng)。Petrasek J[5]等發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可激活STING-IRF3信號通路，導(dǎo)致酒精性肝病肝細(xì)胞死亡。下調(diào)STING蛋白水平后，可以有效抑制IRF3磷酸化和肝臟損傷。最近的研究表明，STING參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6]介導(dǎo)的病理性心肌肥厚和纖維化。但STING-IRF3通路是否參與I/R后過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對心肌自噬流的抑制作用尚未明確。

在本研究中，我們試圖研究干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后對心肌I/R損傷后心肌自噬流及STING-IRF3信號通路的體內(nèi)外影響，并進(jìn)一步探討這些過程的潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

野生型C57BL/6（10-12周齡）小鼠購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物公司；H9c2細(xì)胞購于上海Sciencell公司；STING、磷酸化TBK1（p-TBK1）、TBK1、磷酸化IRF3（p-IRF3）、IRF3和p62兔單克隆抗體以及羊抗兔抗體購自美國CST公司；Real time PCR試劑盒購于Promega公司；Rubicon引物由上海生工公司合成；4-PBA（CAS:1821-12-1）購自美國Sigma公司。

1.2 心肌I/R模型的建立

雄性野生型C57BL/6（10-12周齡）小鼠用2%異氟醚麻醉后，留置針氣管插管（經(jīng)口），外置呼吸支持系統(tǒng)。在胸骨左緣第四肋間隙暴露心臟，用7-0縫線結(jié)扎左冠狀動脈左前降支30min。PowerLab系統(tǒng)顯示ST段抬高，作為結(jié)扎成功的標(biāo)志。結(jié)扎30min后，解除結(jié)扎，心臟顏色恢復(fù)紅色時(shí)，關(guān)閉皮膚切口。所有小鼠均飼養(yǎng)在特定的無病原體動物房中，并按照實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會準(zhǔn)則進(jìn)行處理。

1.3 超聲心動圖評估心臟功能

小鼠麻醉后，使用經(jīng)胸二維超聲心動圖，在胸骨旁左室長軸視圖上測量左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）和左室收縮末期內(nèi)徑（LVISd），接著采用Vevo Analysis軟件（version3.0.0）分析左室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）和左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）的百分比。

1.4 染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

將按實(shí)驗(yàn)方案處理后的H9c2細(xì)胞與1%甲醛室溫交聯(lián)20分鐘。接著把細(xì)胞與甘氨酸（最終濃度為0.125 mol/L）孵育5分鐘終止交聯(lián)。細(xì)胞DNA通過超聲波破碎。用IRF3抗體免疫沉淀蛋白-DNA復(fù)合物，然后用PCR檢測IRF3/Rubicon啟動子復(fù)合物。IgG作為陰性對照。Rubicon擴(kuò)增引物為：F5'-GTCCCCTGACATATCGTAGACT-3'，R5'-TGAAGAAGGCATTGGGTGGA-3'。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及H/R模型

H9c2細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)24-36小時(shí)，轉(zhuǎn)移至三氣培養(yǎng)箱（含5%二氧化碳和95%N2）在37°C培養(yǎng)6h后,在含5%CO2和95%O2，10%胎牛血清的DMEM條件下復(fù)氧18h，復(fù)制缺氧/復(fù)氧（H/R）模型 。

1.6 免疫印跡

心肌組織或細(xì)胞在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中勻漿，然后蛋白質(zhì)樣品通過10%SDS -聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上（美國Millipore）。用5%脫脂奶粉封閉，與STING、p-IRF3、IRF3（1:3,000）4℃孵育過夜，用含0.1%吐溫-20的TBST沖洗膜3次（每次10分鐘）后，再與HRP交聯(lián)的二抗室溫孵育2h。TBST沖洗膜3次后，使用ECL（Thermo Fisher Scientific,32106）觀察免疫反應(yīng)蛋白條帶，并用Alpha Imager 2200進(jìn)行定量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對多組采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕心肌I/R損傷

與假手術(shù)組小鼠相比，I/R組小鼠的血清肌酸激酶（CK）水平明顯升高；與I/R組小鼠相比，4-PBA預(yù)處理組小鼠血清CK水平顯著降低，見圖1。此外，超聲心動圖檢查顯示，與假手術(shù)組小鼠相比，I/R組小鼠的LVFS和LVEF值顯著降低；而4-PBA處理改善了小鼠I/R后的心功能，心室FS、EF均提高，見圖1。這些結(jié)果表明，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能在心肌I/R損傷后心臟功能的維持中發(fā)揮了重要作用。

圖1 心肌組織中p62、Rubicon表達(dá)水平

表1 各組小鼠血清 CK-MB含量和心功能指標(biāo)變化

2.2 抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加心肌I/R損傷后自噬流

進(jìn)一步探討抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善心肌功能的可能機(jī)制是否與心肌I/R損傷后細(xì)胞自噬增加有關(guān)。如圖1所示，I/R組小鼠心肌組織中p62和Rubicon表達(dá)水平升高，用4-PBA預(yù)處理后，p62和Rubicon的表達(dá)明顯發(fā)生逆轉(zhuǎn)。

2.3 抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下調(diào)心肌I/R損傷后STING-IRF3通路介導(dǎo)的自噬負(fù)調(diào)控分子的表達(dá)

接著檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否為STING-IRF3信號通路激活的潛在機(jī)制。結(jié)果顯示，STING、p-TBK1和p-IRF3的蛋白水平在再灌注12h后顯著升高，而與I/R組相比，4-PBA處理降低了STING、p-TBK1和p-IRF3的蛋白水平，見圖2（P287）。我們的研究結(jié)果表明，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下調(diào)了I/R誘導(dǎo)的心肌組織中STING-IRF3信號的激活。

圖2 心肌組織中STING、p-TBK1、p-IRF3表達(dá)水平

ChIP-PCR結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，H/R處理增加了IRF3對Rubicon啟動子的結(jié)合，而4-PBA則降低了這種相互作用，見圖3?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明STING-IRF3信號通路通過與Rubicon結(jié)合阻斷自噬流。

圖3 ChIP-PCR檢測H9c2細(xì)胞中IRF3與Rubicon啟動子的結(jié)合Ctrl：正常組，H/R：缺氧復(fù)氧組

3 討論

在本研究中，我們證實(shí)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的STINGIRF3信號通路參與了心肌I/R損傷發(fā)病過程的新作用。我們觀察到小鼠心肌再灌注損傷后STING、p-TBK1和p-IRF3的表達(dá)顯著升高。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA能夠促進(jìn)心肌自噬，降低血清CK-MB水平，改善心肌收縮功能。此外，4-PBA預(yù)處理可以抑制心肌I/R后的STING-IRF3信號活化，從而減輕心肌損傷。體外分析進(jìn)一步證實(shí)了STING-IRF3信號通路和自噬分子之間的相互作用。這些結(jié)果提示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與心肌I/R中自噬障礙之間存在潛在的相關(guān)性，但具體的機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

眾所周知，自噬有利于心肌細(xì)胞存活，自噬的激活可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活化后在再灌注損傷發(fā)展過程中的相關(guān)代償機(jī)制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活后，自噬活性增加，參與折疊或錯誤折疊蛋白的降解和去除。然而，I/R損傷時(shí)自噬小體清除障礙，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，參與自噬流受損相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激可能是導(dǎo)致心肌I/R損傷的機(jī)制之一。那么內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是如何調(diào)節(jié)自噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡的機(jī)制尚不清楚。

Rubicon是自噬小體/核內(nèi)體成熟的負(fù)調(diào)控因子[7]。Rubicon缺乏可增強(qiáng)心臟自噬，保護(hù)小鼠免受LPS誘導(dǎo)的損傷[8]。我們的結(jié)果證實(shí)I/R損傷上調(diào)心肌組織中STINGIRF3信號通路，STING-IRF3通路是否直接參與心肌I/R誘導(dǎo)的自噬流障礙還不得而知。在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的STING-IRF3信號通路通過IRF3結(jié)合Rubicon，促進(jìn)Rubicon的表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞自噬流。這些數(shù)據(jù)再次表明，自噬受損與心肌I/R損傷中的STING-IRF3信號通路活化相關(guān)。

近來研究發(fā)現(xiàn)，miR-24-3p通過調(diào)控STING的表達(dá)，在肝臟I/R[9]過程中抑制炎癥，緩解細(xì)胞凋亡。在小膠質(zhì)細(xì)胞中，HDAC3-p65-cGAS-sting通路參與了I/R誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，缺失小膠質(zhì)細(xì)胞cGAS或HDAC3可減輕I/R誘導(dǎo)的腦損傷和神經(jīng)炎癥[10]。與上述結(jié)果一致，我們的數(shù)據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是激活STING的上游因子，4-PBA通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的STING- IRF3信號通路，在I/R過程中發(fā)揮心臟保護(hù)作用。因此，這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了干預(yù)這一通路是防治心肌細(xì)胞死亡以及再灌注后心律失常和心力衰竭并發(fā)癥的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，我們明確了STING-IRF3是心肌I/R損傷病理過程中的關(guān)鍵信號通路，其通過與Rubicon結(jié)合抑制心肌自噬流；4-PBA通過降低STING-IRF3活化和促進(jìn)自噬流在I/R期間發(fā)揮心臟保護(hù)作用。