林佩瑤， 宋 英， 秦東旭， 盧棟澤， 范徐麗

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院， 杭州 310014)

動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1, DRP1)在線粒體破裂的過程中起主導(dǎo)作用，表現(xiàn)為DRP1在線粒體受損時(shí)聚集于外膜，最終細(xì)胞凋亡[7]。依達(dá)拉奉(edaravone , ED)是臨床上常用的自由基清除劑，其對(duì)腦神經(jīng)的保護(hù)作用已得到證實(shí)[8]，但ED如何通過DRP1改善毒死蜱導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡仍少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過皮下注射毒死蜱建立腦損傷模型，用依達(dá)拉奉進(jìn)行治療，探討依達(dá)拉奉緩解毒死蜱蓄積導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷與DRP1蛋白的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

毒死蜱 (Chlorpyrifos, 上海阿拉丁), 依達(dá)拉奉 (Edaravone, Mitsubishi Chemical Corporation, Janpanse), RIPA裂解液，ATP檢測(cè)試劑盒 (ATP Assay Kit, 碧云天), ATP酶試劑盒(Adenosinetriphosphatase Assay Kit, 南京建成), GAPDH抗體、DRP1抗體(Abcam, USA)、phospho-DRP1(Ser637) 抗體 (Affinity Biosciences, China), 酶標(biāo)儀 (型號(hào): speetramaxMZe, MoleeularDevices , USA), 透射電子顯微鏡 (型號(hào): H7650, HITACHI, Janpanse) 等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)

體重在220～250 g之間的成年健康雄性SD(Sprague Dawley)大鼠，清潔級(jí)，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SCXK-2019-0002)。所有動(dòng)物在RT 25℃，濕度50%，保持12 h光明和黑暗交替的環(huán)境下飼養(yǎng)1周。本研究經(jīng)浙江工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.3 毒死蜱腦損傷模型的建立

通過隨機(jī)分組，將大鼠分為對(duì)照組(Control), 毒死蜱組(Model)，依達(dá)拉奉組(ED)。橄欖油溶解毒死蜱后，連續(xù)28 d以18 mg/kg的劑量將其皮下注射于大鼠頸部[9,10]。在28 d內(nèi)，依達(dá)拉奉組在注射毒死蜱1 h后，通過腹腔注射純度為99%的依達(dá)拉奉(10 mg/kg)[11]予以治療。

1.4 行為學(xué)檢測(cè)

1.4.1 曠場(chǎng)試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行28 d后，在黑色不透明鋼板制成的干凈無味箱子 (大小為45 cm×45 cm×50 cm) 中進(jìn)行試驗(yàn)。每次將大鼠沿箱壁放入，并允許自由探索3 min，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程的動(dòng)物行為記錄在ANY-maze分析系統(tǒng)中。

1.4.2 Morris水迷宮 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠置于直徑1.2 m，高0.5 m的圓形黑色水池中，水溫保持在23℃左右。設(shè)置四個(gè)象限，每個(gè)象限各有一個(gè)參照物。水上逃生平臺(tái)直徑0.14 m，高0.3 m，低于液面1 cm左右，置于第Ⅱ象限。攝像頭置于水池上方，實(shí)時(shí)錄像。每次從四個(gè)象限內(nèi)背對(duì)實(shí)驗(yàn)者拋入，訓(xùn)練其2 min內(nèi)找到逃生平臺(tái)，訓(xùn)練4 d后，通過ANY-maze系統(tǒng)分析評(píng)判大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

1.5 HE染色

用生理鹽水和4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注，取腦組織浸入石蠟，4 μm切片。HE染色光鏡下觀察病理損傷。

1.6 透射電鏡觀察神經(jīng)元細(xì)胞

同上，取腦組織用2.5%(0.025 g/ml)戊二醛固定，4℃過夜，次日按標(biāo)準(zhǔn)程序包埋并超薄切片，在透射電鏡下觀察細(xì)胞凋亡和線粒體形態(tài)。

企業(yè)在實(shí)際發(fā)展中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)用戶或是顧客對(duì)商家不滿意或是滿意客戶不忠誠的情況，這一問題也有效表明顧客滿意度對(duì)其忠誠度并不能產(chǎn)生直接影響，受到各種因素的影響也比較顯著。比如顧客滿意度如果能保持在合理水平上，顧客忠誠度也會(huì)受到轉(zhuǎn)換成本的影響和限制。

1.7 線粒體損傷相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)

每20 mg大鼠腦組織樣品加入100～200 μl裂解液進(jìn)行裂解勻漿，把勻漿組織液轉(zhuǎn)移至離心機(jī)后，4℃、12,000 g 離心 5 min，取上清液。根據(jù)試劑盒說明書步驟得到ATP含量和Na+-K+-ATP酶活力。用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。

1.8 Western blot檢測(cè)

提取部分大鼠腦組織蛋白，變性后，電泳分離，轉(zhuǎn)膜封閉，4℃下孵育兔抗DRP1多克隆抗體(1∶ 1 000)、兔抗phospho-DRP1(Ser637) 多克隆抗體(1∶1 000)，過夜。次日，室溫下孵育山羊抗兔二抗(1∶5 000)2 h，顯影。

1.9 免疫組織化學(xué)

將大鼠腦組織石蠟切片水化，檸檬酸抗原修復(fù)，BSA封閉，滴加一抗和二抗。DAB顯色，HE再染后，光鏡觀察。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 依達(dá)拉奉對(duì)毒死蜱損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的影響

如圖1和表1所示，曠場(chǎng)試驗(yàn)中，與Control組比，Model組運(yùn)動(dòng)軌跡較短，在曠場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)總距離縮短(P<0.01)，平均速度下降(P<0.01)。而經(jīng)依達(dá)拉奉給藥后，ED組大鼠活動(dòng)更頻繁，運(yùn)動(dòng)距離與平均速度有顯著改善 (P<0.05)。

Fig. 1 Edaravone improves the ability of learning and memory in rats

Tab. 1 The total movement distance and average speed of the rats in each group in the open field test n=6)

如圖2和表2所示，水迷宮試驗(yàn)中，與Control組比較，Model組活動(dòng)軌跡較復(fù)雜且逃避潛伏期增長(zhǎng)(P<0.01)，1 min內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.01)。經(jīng)依達(dá)拉奉治療后，大鼠活動(dòng)軌跡簡(jiǎn)單，逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加(P<0.01)。

Fig. 2 Edaravone improves the ability of learning and memory in rats

Tab. 2 The crossing-target number and the escape latency of rats in each group crossed the platform in the water maze n=6)

2.2 依達(dá)拉奉對(duì)毒死蜱誘導(dǎo)的大鼠腦組織病理損傷的影響

如圖3所示，Control組海馬CA1、CA3、DG區(qū)神經(jīng)元分布整齊、密集，神經(jīng)元細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)清晰可見，胞漿淺染。與對(duì)照組相比，毒死蜱損傷組海馬區(qū)域的正常細(xì)胞含量減少，且分布不規(guī)則，主要表現(xiàn)為細(xì)胞邊界不清、胞漿減少或消失，可見CA3區(qū)損傷。依達(dá)拉奉給藥后，與Model組相比，ED組大鼠CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷程度明顯減輕，神經(jīng)細(xì)胞分布較為整齊，胞漿淺染增多。

Fig. 3 Edaravone protected against Chlopyrifos induced hippocampal injury in SD rats (n=3)

2.3 依達(dá)拉奉對(duì)毒死蜱誘導(dǎo)大鼠腦細(xì)胞損傷的影響

如圖4所示，Control組細(xì)胞核核膜正常，線粒體內(nèi)嵴完整。Model組核膜破裂，染色質(zhì)斷裂凝集，核固縮；且線粒體內(nèi)嵴斷裂。經(jīng)ED給藥后，大鼠腦組織中細(xì)胞核膜相對(duì)完整，正常線粒體的數(shù)量增加，線粒體膜破裂與嵴斷裂的現(xiàn)象也明顯減少。

Fig. 4 Determination of mitochondrial and cell nucleus damage levels (n=3)

2.4 依達(dá)拉奉對(duì)毒死蜱誘導(dǎo)腦損傷大鼠的Na+-K+-ATP酶活性與ATP含量的影響

通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Na+-K+-ATP酶活性和ATP含量來評(píng)價(jià)線粒體供能狀況。如表3所示，與Control相比，反復(fù)暴露于毒死蜱的大鼠腦組織中Na+-K+-ATP酶活性與ATP含量明顯降低(P<0.01，P< 0.05)。而經(jīng)ED給藥治療后，鈉鉀ATP酶活性恢復(fù)(P<0.01)，三磷酸腺苷含量也明顯升高(P< 0.05)。提示ED對(duì)于CPF導(dǎo)致的線粒體功能障礙具有顯著的治療作用。

Tab. 3 Determination of mitochondrial damage levels (%， n=6)

2.5 依達(dá)拉奉對(duì)毒死蜱誘導(dǎo)腦損傷大鼠DRP1- Ser637位點(diǎn)的磷酸化表達(dá)及線粒體損傷的影響

采用免疫組化探究各組DRP1蛋白及其Ser637位點(diǎn)的磷酸化表達(dá)，結(jié)果如圖5和表4所示：線粒體分裂蛋白DRP1在各組大鼠腦組織中均有棕色顯色。DRP1的Ser637位點(diǎn)的磷酸化蛋白棕色顯色在Model組中明顯減少 (P<0.05)，但這種趨勢(shì)在經(jīng)ED給藥后得到顯著性逆轉(zhuǎn)(P<0.05)。

Fig. 5 The effects of ED on the expressions of DRP1 and p-DRP1-Ser637

Tab. 4 Mean optic density of DRP1 and p-DRP1 -Ser637 and the ratio of relative levels of p-DRP1-Ser637 and DRP1 of rat among different groups n=3)

采用免疫印跡法探究各組DRP1蛋白及其Ser637位點(diǎn)的磷酸化表達(dá)，結(jié)果如圖6和表4所示，以DRP1蛋白表達(dá)量為參照，p-DRP1-Ser637在Model組表達(dá)顯著減少(P<0.01)，依達(dá)拉奉組表達(dá)明顯增多(P<0.01)。

Fig. 6 The expressions and ratio of p-DRP1-Ser637 and DRP1 in each group

3 討論

在我國，毒死蜱作為廣譜殺蟲劑，被廣泛用在各種作物的種植。但長(zhǎng)期地暴露在低濃度的毒死蜱中，對(duì)人類的健康產(chǎn)生了影響。研究表明，毒死蜱作用孕鼠或新生小鼠會(huì)引發(fā)中樞神經(jīng)發(fā)育障礙，同時(shí)影響神經(jīng)軸突運(yùn)輸和神經(jīng)元功能[10]。除此之外，長(zhǎng)期暴露于毒死蜱將增加患帕金森和阿爾茲海默癥的風(fēng)險(xiǎn)[12]。我們之前的體外研究表明，200 μmol/L下的毒死蜱會(huì)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的凋亡[13]；徐等人發(fā)現(xiàn)，15 mg/kg 的毒死蜱會(huì)改變大鼠腦組織線粒體的超微結(jié)構(gòu)，降低線粒體電位，干擾細(xì)胞抗氧化能力，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期皮下注射毒死蜱，SD大鼠的學(xué)習(xí)記憶、運(yùn)動(dòng)能力明顯下降。正常生理情況下，海馬CA3區(qū)是控制大腦學(xué)習(xí)、記憶及運(yùn)動(dòng)的重要區(qū)域。動(dòng)物腦組織蘇木素染色顯示毒死蜱組海馬CA3區(qū)被破環(huán)，神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。這提示長(zhǎng)期暴露于毒死蜱會(huì)導(dǎo)致大腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷。

線粒體是生成ATP的主要場(chǎng)所，能量產(chǎn)生需要氧化磷酸化，而線粒體發(fā)生氧化磷酸化是依靠正常的形態(tài)和生物活性。在本研究中，我們?cè)陔婄R下觀察到毒死蜱組線粒體損傷，伴隨著ATP含量和Na+-K+-ATP酶活性下降。

DRP1是一種胞漿動(dòng)力蛋白樣GTP酶[15]，是調(diào)控線粒體裂變的主要蛋白，同時(shí)也介導(dǎo)線粒體依賴性細(xì)胞凋亡：在氧化應(yīng)激刺激下，它被募集到線粒體上，引起線粒體腫脹和外膜上通透性轉(zhuǎn)換孔的大量開放，繼而提高線粒體膜通透性并引起細(xì)胞色素酶C的大量釋放。Cyt C作用于凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1)、催化天冬氨酸蛋白水解酶-9，激活天冬氨酸蛋白水解酶-3，最終細(xì)胞凋亡[16]。但DRP1的活性受蛋白翻譯后修飾的調(diào)節(jié)，其Ser637位點(diǎn)被磷酸化后，可抑制DRP1向線粒體膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，減少線粒體碎片化從而保護(hù)細(xì)胞[17]。我們通過電鏡觀察到毒死蜱組細(xì)胞核和線粒體形態(tài)明顯改變；進(jìn)一步用免疫組化及免疫印跡反映DRP1的Ser637位點(diǎn)磷酸化表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)毒死蜱抑制了DRP1的Ser637位點(diǎn)磷酸化表達(dá)，從而促進(jìn)線粒體損傷和細(xì)胞凋亡。

依達(dá)拉奉是臨床中常用的腦保護(hù)藥物。在此前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉能通過抑制5-脂氧合酶 (5-LOX)的激活來維持線粒體的超微結(jié)構(gòu)，保護(hù)神經(jīng)元免受缺血損傷[18]；同時(shí)依達(dá)拉奉能通過NRF2減輕毒死蜱對(duì)PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[19]。此外，依達(dá)拉奉的預(yù)防給藥具有抗炎作用，抑制肺中毒小鼠的細(xì)胞凋亡[20]。但是依達(dá)拉奉通過DRP1分子保護(hù)線粒體，減少細(xì)胞凋亡的研究較少。我們這次實(shí)驗(yàn)側(cè)重探究毒死蜱損傷下，依達(dá)拉奉與線粒體DRP1蛋白的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉使線粒體碎片化減少、細(xì)胞核形態(tài)恢復(fù)正常；也促進(jìn)了DRP1蛋白的Ser637位點(diǎn)磷酸化表達(dá)。因此，依達(dá)拉奉通過抑制線粒體分裂，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞的作用得以證實(shí)。

綜上，本文的研究發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉通過促進(jìn)DRP1的Ser637位點(diǎn)磷酸化的表達(dá)減輕毒死蜱所致大鼠腦損傷。這為治療毒死蜱所致中樞神經(jīng)病變提供新的實(shí)驗(yàn)思路，同時(shí)我們也希望進(jìn)行更深入研究來探討依達(dá)拉奉促進(jìn)p-DRP1-Ser637表達(dá)的潛在途徑。