李永榮， 謝海彬， 李 紅， 孫 杰

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肺病科， 蘭州 730020； 2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科， 蘭州 730020；3. 深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院呼吸科， 深圳 518001； 4. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心肺康復(fù)科， 廣州 510405)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病。COPD定義為氣道進(jìn)行性下降和呼吸短促，這與氧化應(yīng)激和慢性炎癥有關(guān)，可導(dǎo)致體重減輕和組織消耗。吸煙是引起COPD的主要原因之一[1]。然而，現(xiàn)有的治療方法僅通過減少疾病連鎖反應(yīng)來幫助改善COPD患者生活質(zhì)量。糖皮質(zhì)激素在控制氣短方面有益處，但在減少炎癥方面效果很差，特別是長期使用[2]。此外，吸煙與糖皮質(zhì)激素抵抗相關(guān)[3]。因此，我們需要更多關(guān)于COPD治療藥物的研究。纈沙坦在臨床上廣泛用于治療高血壓、心力衰竭和糖尿病腎病。此外，纈沙坦對香煙所致小鼠肺損傷具有抗氧化和抗炎作用[4]。我們假設(shè)地塞米松聯(lián)合纈沙坦可以更有效對吸煙誘導(dǎo)COPD發(fā)揮保護(hù)作用。因此，本研究旨在探討地塞米松和纈沙坦聯(lián)合應(yīng)用對吸煙誘導(dǎo)COPD小鼠的保護(hù)作用，并對其機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

纈沙坦(北京諾華制藥有限公司)；地塞米松(吉林敖東藥業(yè)集團(tuán)延吉股份有限公司)；芙蓉牌香煙(湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司)；比色診斷試劑盒及ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組

40只雄性C57BL/6小鼠(20～25 g)，購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物中心。在整個研究過程中對動物處理均按照國家頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》和甘肅中醫(yī)藥大學(xué)研究倫理委員會要求執(zhí)行。雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組(n=8)：對照組、COPD組、地塞米松組、纈沙坦組和地塞米松+纈沙坦聯(lián)合處理組。對照組小鼠腹腔注射生理鹽水，同時暴露于室內(nèi)空氣中；COPD組小鼠持續(xù)8周進(jìn)行香煙暴露，5日/周，2次/日，每次75 min。地塞米松組小鼠在香煙暴露8周基礎(chǔ)上，在5～8周香煙暴露前30 min腹腔注射地塞米松(2 mg/kg)，5日/周，1次/日[5]；纈沙坦組小鼠在香煙暴露8周基礎(chǔ)上，1～8周香煙暴露前30 min腹腔注射纈沙坦(30 mg/kg)，5日/周，1次/日[6]；地塞米松+纈沙坦聯(lián)合處理組小鼠在香煙暴露8周基礎(chǔ)上，5～8周香煙暴露前30 min腹腔注射地塞米松(2 mg/kg)，5日/周，1次/日，同時1～8周香煙暴露前30 min腹腔注射纈沙坦(30 mg/kg)，5日/周，1次/日。8周處理后，提取各組小鼠肺組織，并收集支氣管肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid, BALF)，進(jìn)行HE染色和相關(guān)生化檢測。

1.3 BALF和肺組織樣本采集

各組小鼠8周處理后，腹腔麻醉。然后將所有小鼠左肺置于10%福爾馬林中進(jìn)行固定。取小鼠右肺用6 ml無菌生理鹽水灌洗5次，收集BALF，BALF在4 000 r/min下離心10 min。BALF細(xì)胞懸浮在1 ml生理鹽水中，并用血細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分化計(jì)數(shù)。

1.4 組織病理學(xué)檢查

病理組織學(xué)檢查，左肺中段用石蠟包埋。從每個肺樣本中切取3～4 mm切片，用HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。用放大鏡對載玻片進(jìn)行掃描。根據(jù)肺病變的嚴(yán)重程度，按0.5～4分進(jìn)行評分：0.5=輕微，1=輕度，2=中度，3=嚴(yán)重，4=非常嚴(yán)重[5]。

1.5 氧化應(yīng)激、一氧化氮及炎癥參數(shù)測定

采用比色診斷試劑盒檢測BALF中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性，以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)和一氧化氮(nitric oxide, NO)含量；采用ELISA試劑盒檢測BALF中基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)活性，以及細(xì)胞內(nèi)黏附分子(intracellular adhesion molecule 1, ICAM-1)和C反應(yīng)蛋白(c-reactive protein, CRP)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 聯(lián)合處理對組織病理學(xué)影響

采用HE染色評價聯(lián)合處理對肺組織病理改變的保護(hù)作用。如圖1所示，COPD組小鼠支氣管上皮細(xì)胞損傷，杯狀上皮細(xì)胞化生，炎性細(xì)胞浸潤，粘液分泌，支氣管腔細(xì)胞阻塞；此外，上皮細(xì)胞壞死，肺泡充血，肺泡間壁破壞(肺氣腫)。地塞米松組擴(kuò)張支氣管周圍可見中度淋巴細(xì)胞浸潤，伴有局灶性鱗狀上皮化生。纈沙坦組支氣管擴(kuò)張，可見杯狀細(xì)胞增生，周圍有少量慢性炎癥細(xì)胞。聯(lián)合處理組支氣管擴(kuò)張伴輕度杯狀細(xì)胞增生，聯(lián)合處理組各項(xiàng)指標(biāo)與COPD、地塞米松和纈沙坦組相比有明顯下降趨勢。病理組織學(xué)結(jié)果表明COPD模型成功建立，而聯(lián)合處理對COPD病理損傷有顯著改善作用(表1)。

Fig. 1 Typical HE staining of lung tissues in each group (100 μm). Control group showed normal bronchiole with intact lining of respiratory epithelium (blue arrow); COPD group showed necrosis of epithelial cells and dilated heavily congested alveoli with destructed wall in between (blue arrows); Dexamethasone group showed moderate lymphocytic infiltrate (red arrow) around dilated bronchus with focalsquamous metaplasia (blue arrow); Valsartan group showed dilated bronchi lined with goblet cellular hyperplasia (blue arrow) surrounded by few chronic inflammatory cells (red arrow); Combined group showed dilated bronchi lined with mild goblet cellular hyperplasia (blue arrow)

Tab. 1 Histopathological score and NO content in BAFL of mice in each n=8)

2.2 聯(lián)合處理對BALF氧化應(yīng)激參數(shù)影響

如表2所示，與對照組相比，COPD組小鼠BALF中SOD水平降低，MDA水平增加(P均< 0.05)。與COPD組相比，聯(lián)合處理組小鼠BALF中SOD明顯升高，MDA水平降低(P均<0.05)。另外，聯(lián)合處理組與地塞米松和纈沙坦組相比，SOD升高，MDA降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。聯(lián)合處理可提高COPD小鼠SOD抗氧化能力，降低MDA含量。

Tab. 2 Comparison of oxidative stress parameters in BAFL of mice in each n=8)

2.3 聯(lián)合處理對BALF中NO含量影響

內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO促進(jìn)平滑肌松弛。如表1所示，與對照組相比，COPD組小鼠BALF中NO水平降低(P<0.05)。與COPD組相比，聯(lián)合處理組小鼠NO水平升高(P<0.05)。然而，聯(lián)合處理組與地塞米松和纈沙坦組相比，NO含量升高(P<0.05)。

2.4 聯(lián)合處理對BALF炎癥參數(shù)影響

如表3所示，與對照組相比，COPD組小鼠BALF中CRP、MMP-9和ICAM-1水平升高(P均<0.05)。與COPD組比較，聯(lián)合處理組CRP、MMP-9和ICAM-1降低(P均<0.05)。此外，與地塞米松組和纈沙坦組相比，聯(lián)合處理組CRP、MMP-9和ICAM-1水平降低(P均<0.05)。結(jié)果表明，地塞米松與纈沙坦合用可抑制COPD小鼠炎癥細(xì)胞因子生成，從而抑制COPD引起的炎癥反應(yīng)。

Tab. 3 Comparison of inflammatory parameters in BAFL of mice in each n=8)

2.5 聯(lián)合處理對BALF炎性細(xì)胞影響

如表4所示，與對照組相比，COPD小鼠BALF中活細(xì)胞百分比降低，淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞總數(shù)增加(P均<0.05)。與COPD組相比，聯(lián)合處理組活細(xì)胞總數(shù)增加，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞減少(P均< 0.05)。與地塞米松組和纈沙坦組相比，聯(lián)合處理組活細(xì)胞百分率提高，淋巴細(xì)胞總數(shù)減少，巨噬細(xì)胞總數(shù)增加(P均<0.05)。

Tab. 4 Comparison of inflammatory cell parameters in BAFL of mice in each n=8)

3 討論

COPD是一種與氣道阻塞和肺部異常炎癥反應(yīng)相關(guān)的慢性氣道炎癥性疾病。慢性香煙煙霧暴露是慢性炎癥的主要原因，導(dǎo)致氣道重塑、肺泡組織破壞、進(jìn)行性粘液高分泌和肺功能下降[7]。類固醇治療對COPD患者是有益的，但其結(jié)果受到一些患者不確定和多變臨床反應(yīng)的限制。此外，大劑量類固醇對COPD患者肺功能迅速下降，并顯示出許多副作用[8]。本研究通過組織病理學(xué)檢查確定COPD模型的建立(支氣管上皮細(xì)胞損傷，杯狀上皮細(xì)胞化生，炎性細(xì)胞浸潤，粘液分泌和支氣管腔細(xì)胞阻塞，上皮細(xì)胞壞死，肺泡充血和肺泡壁破壞)。我們的研究還表明，與單獨(dú)處理相比較，地塞米松和纈沙坦聯(lián)合處理可通過減少氧化應(yīng)激、炎癥介質(zhì)和組織病理學(xué)更有效抑制COPD。

COPD發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。眾所周知，氧化應(yīng)激會加劇氣道炎癥。由于煙霧中含有自由基和活性氧，對氣道上皮細(xì)胞和炎癥反應(yīng)有直接損害作用[9]。肺部慢性炎癥和支氣管上皮細(xì)胞損傷后，SOD合成下降，MDA水平升高，導(dǎo)致機(jī)體失代償。在本研究中，腹腔注射纈沙坦后SOD活性增加，可能與其通過抑制5-脂氧合酶和環(huán)氧合酶，以及減少循環(huán)中性粒細(xì)胞數(shù)量和超氧自由基產(chǎn)生有關(guān)。此外，纈沙坦還可以通過自由基清除作用消除超氧化物自由基，并通過抑制TNF-α和IL-1b誘導(dǎo)SOD酶基因表達(dá)[4]。纈沙坦降低MDA濃度的作用可能是通過其抗氧化和清除自由基的特性來實(shí)現(xiàn)的[10]。NO由L-精氨酸通過NO合酶獲得。許多研究表明NO是導(dǎo)致肌肉松弛和氣道高反應(yīng)性減弱的重要因素[11]。內(nèi)皮源性NO失活與氧化應(yīng)激增加有關(guān)，特別是超氧自由基產(chǎn)生[12]。本研究結(jié)果表明，聯(lián)合處理組與地塞米松或纈沙坦組比較，MDA含量降低，SOD活性和NO含量升高。因此，聯(lián)合處理可能通過抗氧化作用對香煙誘導(dǎo)COPD起保護(hù)作用。

CRP可作為COPD治療期間炎癥監(jiān)測的指標(biāo)[13]。肺內(nèi)侵襲性防御系統(tǒng)和保護(hù)性防御系統(tǒng)(蛋白酶和抗蛋白酶)之間失衡可能在COPD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。有三類重要的蛋白酶，包括基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)被認(rèn)為在COPD發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)COPD患者痰中MMP-9濃度可作為局部炎癥標(biāo)志物[14]。ICAM-1是一種重要的粘附分子，參與中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)等炎癥過程，在抗原呈遞中起輔助分子作用。一些研究指出ICAM-1表達(dá)在COPD發(fā)病機(jī)制中的作用[15]。COPD患者BALF中ICAM-1濃度升高，香煙煙霧提取物增加巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ICAM-1[16]。纈沙坦作為血管緊張素受體拮抗劑，其降低ICAM-1的作用是通過抑制TNF-α、NF-κB活化和MMPs介導(dǎo)的[17]。在本研究中，與單獨(dú)處理相比，聯(lián)合處理顯著降低CRP、MMP-9和ICAM-1，表明COPD癥狀減輕。而地塞米松對CRP、MMP-9、ICAM-1等炎癥介質(zhì)減少無明顯影響。聯(lián)合處理可預(yù)防COPD，并增強(qiáng)彼此的療效。炎癥是COPD發(fā)生發(fā)展的重要原因，它涉及到炎癥細(xì)胞浸潤，包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。炎癥細(xì)胞也通過有效釋放促炎細(xì)胞因子發(fā)揮關(guān)鍵作用。與地塞米松組和纈沙坦組相比，聯(lián)合處理組活細(xì)胞百分率提高，淋巴細(xì)胞總數(shù)減少，巨噬細(xì)胞總數(shù)增加。

總之，本研究結(jié)果表明，與地塞米松或纈沙坦單獨(dú)應(yīng)用相比較，地塞米松聯(lián)合纈沙坦可以對COPD小鼠發(fā)揮更有效的保護(hù)作用，其保護(hù)作用機(jī)制可能是通過其抗氧化和抗炎特性介導(dǎo)的。