張 琳，于 蕊，宗兆文，葉 釗，鐘 鑫，賈益君，蔣仁慶，周小林，楊昊洋，杜文瓊

400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))陸軍衛(wèi)勤訓(xùn)練基地戰(zhàn)救技能訓(xùn)練教研室/創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室1；050083 石家莊，陸軍軍醫(yī)大學(xué)士官學(xué)校戰(zhàn)術(shù)衛(wèi)勤系2；400037 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第二附屬醫(yī)院骨科3

大出血及出血性休克是戰(zhàn)場上導(dǎo)致可預(yù)防性死亡的最常見原因，占所有創(chuàng)傷性傷亡的40%以上。死亡的主要機(jī)制是失血性休克引發(fā)心臟驟停，被稱為失血引發(fā)的創(chuàng)傷性心跳驟停(hemorrhage-induce traumatic cardiac arrest, HiTCA)。HiTCA的救治成功率非常低，一度被認(rèn)為對其進(jìn)行心肺復(fù)蘇是徒勞的。后經(jīng)臨床實踐和研究表明，使用全血和血液制品及時進(jìn)行復(fù)蘇可促進(jìn)自主循環(huán)恢復(fù)(return of spontaneous circulation, ROSC)，成功率接近內(nèi)科性心跳驟停(medical cardiac arrest, MCA)。創(chuàng)傷和失血后出現(xiàn)的高血糖、高血鉀、酸中毒等病理變化，對創(chuàng)傷性心跳驟停(traumatic cardiac arrest, TCA)復(fù)律和臟器功能可能有重要的影響。其中，血糖和血鉀變化是失血后常見的變化，對心肌能量代謝和TCA后的復(fù)律有明顯影響。目前尚末有針對上述病理變化的救治策略的研究。假設(shè)通過補(bǔ)充三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)和使用改進(jìn)的極化液(glucose-insulin-potassium, GIK)方法促進(jìn)心肌能量代謝，可改善HiTCA后的ROSC和臟器功能恢復(fù)，本文針對這一假設(shè)進(jìn)行驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

三磷酸腺苷、胰島素、氯化鉀、葡萄糖購自重慶醫(yī)藥公司；酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自美國Signalway Antibody LLC公司；手持式血氣分析儀購自新加坡Flextronics公司；BC-5180 CRP型全自動全血細(xì)胞計數(shù)儀購自中國深圳邁瑞公司；HB-P01全自動干式生化分析儀購自光寶醫(yī)療器械常州有限公司；rac-030自動凝血分析儀購自中國深圳雷諾生命科學(xué)有限公司；微孔板光密度儀(MR-96A)購自中國深圳邁瑞公司。

1.2 動物分組和制模

20只家兔[實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(渝)20170002，使用許可證號為(渝)20170002]。本實驗已獲陸軍軍醫(yī)大學(xué)校倫理委員會許可(AMUWEC 20192178)，雌雄不拘，質(zhì)量(2.82±0.43)kg，(9.5±0.45)月齡，通過隨機(jī)數(shù)字分組法分為A、B兩組(

n

=10)，通過控制性失血法制備HiTCA模型。制模前，1%戊巴比妥鈉以5 mL·kg的劑量腹腔注射麻醉家兔，然后左側(cè)頸總動脈置管用于持續(xù)監(jiān)測平均動脈壓(mean arterial pressure, MAP)、收縮壓、舒張壓和心率以及采集動脈血做血氣分析。右側(cè)頸內(nèi)靜脈置三通管用于采集血樣，檢測血常規(guī)、常規(guī)凝血象和血生化以及用于輸注復(fù)蘇液體。左側(cè)股動脈置管，用于控制性抽取血液降壓。完成上述工作后，從股動脈置管中以2 mL/(kg·min)的速度抽取血液，直至收縮壓<20 mmHg，且持續(xù)20 s以上；此時，判定HiTCA動物模型制備成功。抽取的血液用檸檬酸磷酸葡萄糖儲存，室溫20 ℃下保存，用于下述的復(fù)蘇策略。

1.3 復(fù)蘇策略

制模成功后10 min內(nèi)，2組動物分別接受全血回輸和全血回輸+三磷酸腺苷+改進(jìn)GIK治療。兩組均回輸抽取的全血，輸注速度均為3 mL·kg·min。上述時間點的選擇模擬我軍《戰(zhàn)傷救治規(guī)則》中規(guī)定，即戰(zhàn)現(xiàn)場急救在傷后10 min內(nèi)完成。改進(jìn)的GIK方法為：根據(jù)測量的葡萄糖和鉀濃度應(yīng)用GIK療法，即根據(jù)測量的葡萄糖和鉀濃度調(diào)整胰島素、葡萄糖與鉀離子之間的比例：如果葡萄糖水平>6.0 mml/L，鉀離子濃度>5.5 mmol/L，則胰島素劑量為0.1 U/kg在5 min內(nèi)泵入，不補(bǔ)充氯化鉀；如果葡萄糖水平在3.0～6.0 mml/L之間，鉀離子濃度在3.5～5.5 mmol/L之間，則使用相同劑量胰島素的標(biāo)準(zhǔn)GIK方案(200 g/L葡萄糖、50 U/L胰島素和80 mmol/L氯化鉀)。如果鉀離子濃度<3.5 mmol/L且葡萄糖水平<3.0 mml/L(大出血后非常罕見)，則使用高糖和適當(dāng)體積的氯化鉀調(diào)整GIK；如果只有血糖或鉀水平異常，則相應(yīng)地調(diào)整GIK治療。ATP使用方法：每小時每只動物靜推0.1 mL。

收縮壓恢復(fù)至50 mmHg、維持1 min以上且可觸及頸總動脈搏動判定為ROSC。從復(fù)蘇結(jié)束至恢復(fù)ROSC計時，各組間進(jìn)行比較。ROSC后，持續(xù)監(jiān)測MAP和心率，TCA后1 h內(nèi)每隔20 min記錄1次MAP和心率，1～4 h每隔1 h記錄1次MAP和心率，4～8 h每隔2 h記錄1次MAP和心率，8～24 h每隔4 h記錄1次MAP和心率。

1.4 實驗室檢測指標(biāo)和方法

麻醉后制模前(0 h)、制模后1、4、8、24 h取血檢測各項實驗室指標(biāo)。使用手持式血氣分析儀測定動脈血氣，記錄乳酸和血氧飽和度(SaO)。使用全自動全血細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)血細(xì)胞，記錄紅細(xì)胞和血小板數(shù)量。各時相點1.5 mL靜脈血低速離心后取血漿使用HB-P01全自動干式生化分析儀檢測血糖、鉀離子、肌酐、尿素氮、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酸激酶同工酶-MB的濃度；使用rac-030自動凝血分析儀檢測常規(guī)凝血象，記錄國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(international ratio, INR)。

制模后24 h，所有血液標(biāo)本收集后，以過量氯化鉀溶液靜推致死動物。如果在實驗終點前動物發(fā)生死亡，其各項測量指標(biāo)統(tǒng)計至其死亡前一時相點。死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)：收縮壓為0 mmHg，無自主呼吸，持續(xù)時間>3 min。

1.5 ELISA檢測

ELISA檢測指標(biāo)包括S100β蛋白, C反應(yīng)蛋白(C-reaction protein, CRP)和Syndecan-1。1.5 mL血液低速離心后取血漿按照說明書進(jìn)行ELISA檢測，方法簡述如下：將100 μL各稀釋液(標(biāo)準(zhǔn)、空白和樣品)添加到適當(dāng)?shù)目字?，并用平板密封劑覆蓋平板，在37 ℃下培養(yǎng)2 h。然后從每個孔中取出液體，將100 μL檢測試劑A工作溶液添加到每個孔中，然后在37 ℃下將培養(yǎng)皿再培養(yǎng)1 h。孵育后，吸入溶液，并用300 μL洗滌液洗滌孔3次。隨后，向每個孔中添加100 μL檢測試劑B工作溶液，并在37 ℃下培養(yǎng)1 h。培養(yǎng)后，再次清洗孔，然后向每個孔中添加90 μL底物溶液，并將平板再培養(yǎng)15 min。最后，向每個孔中添加50 μL終止液，并通過輕敲板的側(cè)面進(jìn)行混合。從平板底部去除所有水滴和指紋，并確認(rèn)液體表面沒有氣泡，然后立即用微孔板光密度儀在450 nm處測量吸光度來測量上述標(biāo)記物的濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ROSC、生存率和生理指標(biāo)變化情況

各組動物達(dá)到HiTCA制模成功時的失血量之間無顯著性差異，分別為(67.4±5.87)mL和(62.6±8.06)mL(

P

>0.05)。2組家兔自主循環(huán)恢復(fù)率均為100%，從復(fù)蘇至獲得ROSC時間分別為(104±7.52)s和(98±6.03)s，無顯著差異(

P

>0.05)。恢復(fù)ROSC后，A組和B組動物MAP在1 h輸注血液后趨于穩(wěn)定，波動在(64.6±6.22)～(86.8±7.43)mmHg之間，B組動物稍高于A組，但無顯著性差異(

P

>0.05，圖1A)。心率在HiTCA后處于最高值，約為150～160次/min，然后逐漸降低并趨于平穩(wěn)，波動在88～115次/min左右，兩組之間無顯著差異(

P

>0.05，圖 1B)。兩組動物SaO在0 h最高，為100%；HiTCA后各個時相點波動在91.4%～96.7%，B組數(shù)值略高于A組，但兩組之間無顯著差異(

P

>0.05，圖1C)。

A：兩組平均動脈壓變化情況；B：兩組心率變化情況；C：兩組血氧飽和度變化情況

A組8～24 h內(nèi)死亡2只動物，B組動物24 h內(nèi)無死亡發(fā)生。

上述結(jié)果可見，全血回輸基礎(chǔ)上增加ATP和極化液后心率等生理指標(biāo)稍好于全血輸注，并可一定程度減少死亡率。

2.2 實驗室檢測指標(biāo)變化

與基礎(chǔ)值相比，HiTCA后葡萄糖和鉀離子濃度顯著升高(

P

<0.05，表1)；與A組相比，接受GIK治療的B組的葡萄糖和鉀濃度顯著降低(

P

<0.05，表1)。A組和B組的紅細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)顯著低于基礎(chǔ)值(

P

<0.05，表1)，且隨著時間延長，和基礎(chǔ)值相差越大；2組之間紅細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)無顯著差異(

P

>0.05，表1)。在0 h和1 h的時間點，2組間乳酸、肌酐、尿素氮、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和肌酸激酶同工酶-MB的濃度無統(tǒng)計學(xué)差異(

P

>0.05，表1)。HiTCA后4 h，B組乳酸、肌酐、尿素氮、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和肌酸激酶同工酶-MB的濃度顯著低于A組(

P

<0.05，表1)。這些數(shù)據(jù)表明ATP和GIK治療對心臟、腎臟和肝功能有保護(hù)作用。

表1 各組動物實驗室檢測指標(biāo)變化情況

與基礎(chǔ)值相比，2組的INR值顯著增加，呈創(chuàng)傷凝血病的表現(xiàn)。在0 h和1 h的時間點，兩組間INR無顯著差異(

P

>0.05，圖2)，而在4 h后的各個時相點，B組的INR值低于A組(

P

<0.05，圖2)。這一結(jié)果表明，ATP和GIK治療可改善HiTCA后的凝血功能障礙。

a: P<0.05,與A組比較

2.3 ELISA檢測結(jié)果

在HiTCA后4 h的各個時相點，B組CRP濃度低于A組(圖3A)，這一結(jié)果表明ATP和GIK治療有助于減輕HiTCA后的炎性反應(yīng)。

a: P<0.05,與A組比較

與基線值相比，各組的Syndecan-1濃度均明顯升高(圖3B)。從HiTCA后4 h的各個時相點，B組Syndecan-1濃度明顯低于A組(

P

<0.05)。因為Syndecan-1具有肝素效應(yīng)的內(nèi)皮糖萼成分，可能導(dǎo)致凝血病，因而B組中syndecan-1低于A組與B組INR值低于A組有關(guān)，表明ATP和GIK治療有助于減輕HiTCA后凝血病的嚴(yán)重程度。S100β是腦損傷的有效標(biāo)志物。在HiTCA后8 h和24 h兩個時相點，B組S100β濃度低于A組(

P

<0.05)。這表明全血復(fù)合ATP、GIK治療對HiTCA后腦組織有保護(hù)作用(圖3C)。

3 討論

HiTCA后會發(fā)生高血鉀、高血糖等病理生理改變，目前研究結(jié)果顯示高血鉀對創(chuàng)傷修復(fù)是負(fù)向作用，但高血糖在HiTCA中的作用尚存一定的爭議。

創(chuàng)傷后的急性高血糖主要是由應(yīng)激引起的下丘腦-腎上腺低生理應(yīng)激反應(yīng)引起的，應(yīng)激反應(yīng)受創(chuàng)傷嚴(yán)重程度、休克發(fā)生率和年齡的調(diào)節(jié)。失血性休克是哺乳動物中最強(qiáng)烈的應(yīng)激源，可引發(fā)最高水平的皮質(zhì)醇和兒茶酚胺，進(jìn)而誘發(fā)顯著的高血糖。既往研究顯示，高血糖對創(chuàng)傷患者預(yù)后既有負(fù)面影響，也有正面的影響，TCA患者也是如此。一些研究支持高血糖在心跳驟停期間有益的假設(shè)。相反，RUSSO等發(fā)現(xiàn)，心跳驟?；颊呷朐汉?6 h內(nèi)平均血糖水平升高與死亡率增加和嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙相關(guān)。由于使用全血復(fù)蘇本身促進(jìn)ROSC的概率較高，因而本文研究發(fā)現(xiàn)，使用ATP和改進(jìn)后的GIK治療沒有明顯提高ROSC的概率，但這種治療方法卻明顯改善了乳酸濃度、血壓、凝血等指標(biāo)，并最終減輕了心臟、肝臟、腎臟和腦的功能損傷。

本研究表明，TCA后結(jié)局的關(guān)鍵是心臟能否有效利用葡萄糖，并滿足產(chǎn)生力量的能量需求。一方面，基于實際葡萄糖和鉀濃度的GIK治療可能增加心臟和其他臟器的葡萄糖利用率，ATP進(jìn)一步提供了臟器能量代謝所需物質(zhì)，這些有助于促進(jìn)ROSC和維持其他臟器功能；另一方面，它可以減少高血糖的負(fù)面影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATP和GIK治療后CRP濃度顯著降低，表明GIK治療可減輕HiTCA的炎癥反應(yīng)。此外，發(fā)現(xiàn)GIK治療后凝血各項指標(biāo)有所改善。研究結(jié)果顯示，急性高血糖會加劇創(chuàng)傷誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞和糖萼損傷，因此，ATP和GIK療法對凝血功能的改善可能是由對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用引起的。Syndecan-1是具有肝素效應(yīng)的內(nèi)皮糖萼的一種成分，已證明較高水平的Syndecan-1可能導(dǎo)致凝血病。ATP和GIK治療后血小板活化的降低也可能有助于凝血功能提高，如血小板計數(shù)和MA值升高。GIK降低酸中毒水平可進(jìn)一步改善凝血功能。凝血功能的改善可能會提高ROSC的獲得率和關(guān)鍵器官的整體功能。同時，改進(jìn)后的GIK治療明顯降低了HiTCA后的血鉀水平，其可能對維護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能有重要作用，進(jìn)而可進(jìn)一步減輕HiTCA后凝血病的嚴(yán)重程度，減輕各臟器損傷的嚴(yán)重程度。同時，GIK和ATP治療后的乳酸水平降低、能量利用增加和血鉀濃度降低對心臟、肝臟、腎臟和腦組織等有直接的保護(hù)作用，進(jìn)而減輕HiTCA導(dǎo)致的損傷。

本研究尚存在一定的局限性。一是本研究選用家兔作為研究對象，既往研究多以豬或狗作為研究對象，結(jié)果的可比性需要進(jìn)一步驗證。選擇家兔作為研究對象的主要原因是市場上針對家兔的抗體、ELISA等試劑盒明顯多于豬和狗，有利于進(jìn)行機(jī)制研究；次要原因是家兔的凝血系統(tǒng)同人比較接近，而狗或豬與人相比呈現(xiàn)高凝特性。二是本研究和其他研究一樣，使用單純失血制造HiTCA模型(因其操作方便，易于制備標(biāo)準(zhǔn)化動物模型)，與真實創(chuàng)傷中很少有單純失血導(dǎo)致HiTCA的情形。在以后的研究中，將驗證ATP+GIK治療對創(chuàng)傷合并大出血所致TCA 中的效果。三是本研究未觀察心肺復(fù)蘇對ROSC和臟器功能的效果，主要原因是許多研究證明心肺復(fù)蘇對HiTCA的結(jié)局是有害的。