岳瑤，蒲夢凡，王文瑞，趙儉波，，曹輝

（1 塔里木大學(xué)新疆兵團(tuán)南疆化工資源利用工程實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300；2 北京化工大學(xué)北京市生物加工過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029）

聚天冬氨酸（polyaspartic acid，PASP）由單體天冬氨酸通過肽鍵相互鏈接而成，其側(cè)基帶有大量未反應(yīng)的羧基，具有良好的反應(yīng)性。北京化工大學(xué)國家能源生物煉制中心以乙二醇二縮水甘油醚（EGDE）為交聯(lián)劑，將PASP 分子鏈相互鏈接可以得到微觀結(jié)構(gòu)呈空間網(wǎng)絡(luò)狀的PASP凝膠。PASP凝膠能夠吸收大量去離子水，與土壤混合具有減少水層蒸發(fā)滲漏、提高土壤的保水性以及改良土壤結(jié)構(gòu)等作用，常用作農(nóng)林保水劑，除此之外，PASP 凝膠在生物醫(yī)藥、生態(tài)修復(fù)、碳材料等領(lǐng)域均有應(yīng)用潛力。

PASP 凝膠由于具有類似蛋白質(zhì)的多肽主鏈結(jié)構(gòu)，易受到霉菌、細(xì)菌等微生物侵襲降解為低分子肽、氨基酸、NH、CO和HO等，其降解受自身結(jié)構(gòu)影響。當(dāng)前，以乙二醇二縮水甘油醚為交聯(lián)劑制備的PASP 凝膠存在降解速率過快、難以與農(nóng)作物生長周期相適應(yīng)的問題，盡管提高交聯(lián)度可以延遲降解，但會(huì)抑制凝膠的吸水保水性，因此控制PASP 凝膠的降解速率且保證較高的吸水率，使之與作物生長周期相匹配是當(dāng)前研究工作的重點(diǎn)。

丙三醇三縮水甘油醚（GTE）與乙二醇二縮水甘油醚結(jié)構(gòu)相似，均屬于環(huán)氧化合物（圖1），由圖1可以看出，GTE帶有三個(gè)環(huán)氧基團(tuán)，可在較低交聯(lián)度下形成更致密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。本文擬通過控制GTE 用量制備不同交聯(lián)度的PASP 凝膠，考察其生物降解性，探究交聯(lián)度對(duì)降解性的影響，并與以EGDE交聯(lián)PASP凝膠進(jìn)行對(duì)比。

圖1 環(huán)氧類交聯(lián)劑的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

（1）試劑 聚琥珀酰亞胺（PSI），環(huán)渤海生物產(chǎn)業(yè)研究院提供，分子量(1～2)×10，純度98%；EGDE 與GET 均由常州潤天遠(yuǎn)新材料有限公司提供；磷酸、NaOH、(NH)SO、KHPO、KHPO、NaCl、FeSO·7HO、MgSO·7HO，瓊脂等均為分析純。

（2） 儀器 SHJ-6A 恒溫測速磁力攪拌器；ST170 磁力攪拌水浴鍋；PHSJ-3F 便攜式pH 計(jì)；S·SW-CJ-2F超凈臺(tái)；THZ-98AB恒溫?fù)u床；XFH-40CA 高溫滅菌鍋； KM-330 恒溫培養(yǎng)箱；Multiskan Sky 微孔板酶標(biāo)儀；HH-6 型COD 測定儀；Nicolet iS10 傅里葉紅外光譜儀；SU8020 場發(fā)射掃描電子顯微鏡；AR2000ex 旋轉(zhuǎn)流變儀；TA449F3熱重分析儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)

1.2.1 丙三醇三縮水甘油醚交聯(lián)聚天冬氨酸凝膠的制備

GTE 交聯(lián)PASP 凝膠制備方法與EGDE 交聯(lián)PASP 凝膠相似，具體方法如下：準(zhǔn)確稱取6g PSI 溶于36mL 濃度為2mol/L 的氫氧化鈉溶液中，在磁力攪拌器上攪拌1～2h，待PSI完全溶解后，用85%磷酸調(diào)節(jié)pH 至4.8 左右，然后加入一定量的GTE，置于50℃磁力攪拌水浴鍋中反應(yīng)12h即可制得凝膠。將PASP 凝膠剪碎后置于60℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥24h，研磨過60目篩，備用。

本文制備了兩種交聯(lián)度分別為40%、50%、60%的凝膠，交聯(lián)度的計(jì)算如式(1)。

式中，為交聯(lián)劑的質(zhì)量，g；為交聯(lián)劑的相對(duì)分子質(zhì)量；為聚琥珀亞酰胺（PSI）的質(zhì)量，g；為琥珀亞酰胺環(huán)的相對(duì)分子質(zhì)量；為交聯(lián)劑中環(huán)氧基團(tuán)的個(gè)數(shù)。

1.2.2 PASP凝膠表征

采用FTIR對(duì)PASP凝膠進(jìn)行表征，將樣品交替用水和無水乙醇浸泡洗滌，烘干，研磨，KBr壓片后置于儀器中測定；采用SEM觀察PASP凝膠的表面形貌，將處理后樣品導(dǎo)電膠固定，噴金后觀察；采用熱重分析儀分析PASP 凝膠的熱性能，N保護(hù)，升溫速率5℃/min；采用旋轉(zhuǎn)流變儀監(jiān)測凝膠的彈性模量和損耗模量，保持1%的恒定應(yīng)變和1 rad/s的頻率。

1.2.3 PASP凝膠吸水性測定

PASP 凝膠的吸水性能可通過茶袋法測定。分別稱取0.1g 不同交聯(lián)度的PASP 凝膠粉末置于茶袋中，將袋口系緊后浸入盛有蒸餾水的燒杯中保持懸掛狀態(tài)，且袋口應(yīng)避免浸入蒸餾水中。常溫下吸水一段時(shí)間后取出靜置，控干水分后稱重，并及時(shí)補(bǔ)充燒杯中的水。吸水率的計(jì)算如式(2)。

式中，為水凝膠的溶脹率，%；為吸水后凝膠的質(zhì)量，g；為PASP凝膠的質(zhì)量，g。

1.2.4 PASP凝膠的生物降解性

以被測樣品作為唯一碳源和能源，所接種的細(xì)菌和放線菌菌種由塔里木大學(xué)新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，由本地土壤中分離培養(yǎng)得到。采用平板培養(yǎng)法觀察細(xì)菌和放線菌在平板上的生長情況。

采用液體培養(yǎng)法評(píng)價(jià)材料的生物降解性。通過測量液體培養(yǎng)基的值和COD值評(píng)價(jià)PASP凝膠的降解性。采用滴定法分別在第1 天、第3 天、第5 天、第7 天、第9 天測量發(fā)酵液的COD 值，平行測定三次，凝膠降解率計(jì)算如式(3)。

式中，COD為初始發(fā)酵液的化學(xué)需氧量，mg/L；COD第天發(fā)酵液的化學(xué)需氧量，mg/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 PASP凝膠的表征

2.1.1 FTIR分析

采用FTIR 分析PSI、EGDE 交聯(lián)PASP 凝膠和GTE 交聯(lián)PASP 凝膠的官能團(tuán)，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可以看出，PSI 在3600cm處是游離的O—H鍵的吸收峰，在2950cm處是—CH—的吸收峰，1712cm處是琥珀酰亞胺五元環(huán)結(jié)構(gòu)的吸收峰，1400cm處是酰胺鍵里C—N鍵的伸縮振動(dòng)峰，可以看出與PASP 相比，這幾個(gè)峰均出現(xiàn)了明顯減弱甚至消失。GTE 為交聯(lián)劑制備的PASP 凝膠與以EGDE為交聯(lián)劑制備的PASP凝膠紅外譜圖極相似，都存在3200cm處的羧基的O—H 鍵吸收峰，600cm處C==O 雙鍵的吸收峰，1392cm處C—N的伸縮振動(dòng)峰，1050cm處的C—O—C 鍵吸收峰，說明可以采用丙三醇三縮水甘油醚為交聯(lián)劑制備PASP凝膠。

圖2 PSI、EGDE交聯(lián)PASP凝膠、GTE交聯(lián)PASP凝膠紅外吸收光譜

2.1.2 SEM分析

采用SEM 觀察EGDE 交聯(lián)PASP 凝膠和GTE 交聯(lián)PASP凝膠的表面形貌，結(jié)果如圖3所示。由圖3(a)可以看出，EGDE 為交聯(lián)劑制備的PASP 凝膠表面疏松粗糙，且存在大量的孔洞結(jié)構(gòu)，孔徑較大，有利于水分子進(jìn)入。由圖3(b)可以看出，以GTE為交聯(lián)劑制備的PASP 凝膠表面較光滑，有一定程度褶皺和少量孔。

圖3 以EGDE、GTE為交聯(lián)劑的PASP凝膠SEM圖

2.1.3 熱性能分析

采用TG-DTG分析交聯(lián)度為50%的EGDE交聯(lián)PASP凝膠和GTE交聯(lián)PASP凝膠的熱性能。

由圖4(a)可知，以EGDE為交聯(lián)劑制備的PASP凝膠在250℃左右質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降到85%，而以GTE為交聯(lián)劑的凝膠在300℃左右質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降至85%；以EGDE為交聯(lián)劑的PASP凝膠在430℃左右質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降到18%，而以GTE 為交聯(lián)劑的凝膠在470℃左右質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降至28%，之后質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本保持不變，PASP凝膠結(jié)構(gòu)完全斷裂，轉(zhuǎn)變?yōu)樘疾牧稀?/p>

圖4 PASP凝膠的TG、DTG圖

由圖4(b)可知，以EGDE為交聯(lián)劑制備的PASP凝膠在溫度為250℃左右有一個(gè)尖銳峰，在此處發(fā)生了水分子丟失、大量的長鏈斷裂變成短鏈，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞降解為二氧化碳等小分子，質(zhì)量分?jǐn)?shù)急劇下降。以GTE 為交聯(lián)劑制備的PASP 凝膠在溫度270℃左右出現(xiàn)了一個(gè)較寬峰，但峰高約為0.4，可能是水分子逸出導(dǎo)致，在溫度380～410℃又出現(xiàn)了一個(gè)較寬的雙頭峰，峰高可達(dá)到0.5 左右，主要是PASP 凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，并且破壞的速率較慢，質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有發(fā)生急劇地上升和下降。綜上所述，以GTE為交聯(lián)劑的PASP凝膠耐熱性更優(yōu)。

2.1.4 黏彈性能分析

采用旋轉(zhuǎn)流變儀測定交聯(lián)度為50%的EGDE交聯(lián)PASP 凝膠和GTE 交聯(lián)PASP 凝膠的彈性模量和損耗模量。

圖5為PASP凝膠的黏彈性能曲線。如圖5(a)所示，角頻率為50rad/s時(shí)，GTE交聯(lián)的凝膠比EGDE交聯(lián)的凝膠的彈性模量'高出約1750Pa，說明GTE 交聯(lián)凝膠有更高的強(qiáng)度。且GTE 交聯(lián)的凝膠比EGDE 交聯(lián)的凝膠損耗模量低[圖5(b)]，說明GTE交聯(lián)的凝膠在相同的形變條件下?lián)p耗的能量更少。對(duì)比GTE 交聯(lián)的凝膠的彈性模量'和損耗模量可以發(fā)現(xiàn)其彈性模量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于損耗模量，說明在外力的作用下主要發(fā)生了彈性形變，產(chǎn)生的損耗較少，更加充分證明GTE交聯(lián)PASP凝膠更致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，材料的韌性顯著增強(qiáng)。

圖5 PASP凝膠的黏彈性能

2.2 PASP凝膠的吸水性能分析

采用茶袋法分別測定EGDE 和GTE 交聯(lián)PASP凝膠不同交聯(lián)度下的吸水率，試驗(yàn)結(jié)果如圖6 所示。由圖6可以看出，以EGDE 為交聯(lián)劑交聯(lián)度為40%的PASP 凝膠吸水率最高，72h 時(shí)吸水率達(dá)193g/g，主要是由于交聯(lián)度較低時(shí)，PASP 凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較為稀疏，易于水分子的吸附與擴(kuò)散，增大交聯(lián)度，PASP 凝膠的吸水率降低；以GTE 為交聯(lián)劑交聯(lián)的PASP 凝膠也具有相似規(guī)律，交聯(lián)度為40%時(shí)，其最大吸水率為178g/g，低于相同交聯(lián)度下EGDE 交聯(lián)的PASP 凝膠，主要是由于交聯(lián)劑分子官能度更大，在相同交聯(lián)度下分子結(jié)構(gòu)更為緊密，水分子的滲透與擴(kuò)散更為困難。

圖6 EGDE與GTE交聯(lián)PASP凝膠不同交聯(lián)度下的吸水率曲線

2.3 PASP凝膠生物降解性分析

2.3.1 平板培養(yǎng)法

采用放線菌分別接種EGDE 交聯(lián)不同交聯(lián)度PASP 凝膠和GTE 交聯(lián)不同交聯(lián)度PASP 凝膠，平板培養(yǎng)10天后的照片如圖7所示。

圖7 放線菌接種EGDE交聯(lián)不同交聯(lián)度PASP凝膠和GTE交聯(lián)不同交聯(lián)度PASP凝膠照片

從圖7 可以看出，放線菌在平板上生長明顯，EGDE交聯(lián)PASP凝膠和GTE交聯(lián)PASP凝膠均可被降解，降解程度與交聯(lián)度并不明顯。

采用細(xì)菌分別接種EGDE 交聯(lián)不同交聯(lián)度PASP 凝膠和GTE 交聯(lián)不同交聯(lián)度PASP 凝膠，平板培養(yǎng)10 天后的照片如圖8 所示。從圖8 可以看出，EGDE交聯(lián)PASP凝膠和GTE交聯(lián)PASP凝膠均具有良好的生物降解性，且細(xì)菌在EGDE 交聯(lián)PASP 凝膠中生長更為明顯，出現(xiàn)了較大的菌體，菌體量與交聯(lián)度有直接關(guān)系，這說明交聯(lián)度較低時(shí)，PASP 凝膠更易于降解，降解產(chǎn)物能給細(xì)菌提供C、N等營養(yǎng)物質(zhì)，細(xì)菌生長速率加快，菌體量增多。

圖8 細(xì)菌接種EGDE交聯(lián)不同交聯(lián)度PASP凝膠和GTE交聯(lián)不同交聯(lián)度PASP凝膠照片

2.3.2 液體培養(yǎng)法

在平板培養(yǎng)法中可以看出，細(xì)菌對(duì)PASP 凝膠的降解影響更明顯，以交聯(lián)PASP 為唯一碳源和氮源，接種細(xì)菌菌液，恒溫?fù)u床上發(fā)酵，測定發(fā)酵液的COD值，計(jì)算降解率，其結(jié)果如圖9所示。

PASP 凝膠降解后有大量短多肽鏈及小分子氨基酸等生成，有機(jī)質(zhì)含量增大，COD值增大。從圖9(a)可以看出，在液體培養(yǎng)過程中，以GTE為交聯(lián)劑的交聯(lián)度為40%的PASP 凝膠的第9 天降解率為59.8%，交聯(lián)度為60%的PASP 凝膠的降解率為49.3%，降低17.5%，交聯(lián)度越小，降解速率越快。如圖9(b)可知，以EGDE 為交聯(lián)劑交聯(lián)度為60%的PASP凝膠第9天的降解率為54.3%，比以GTE為交聯(lián)劑交聯(lián)度為60%的PASP 凝膠的降解率高9.2%，相同交聯(lián)度下GTE 交聯(lián)PASP 凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更致密，降解越慢。

圖9 液體培養(yǎng)法中同一交聯(lián)劑不同交聯(lián)度、同一交聯(lián)度不同交聯(lián)劑PASP凝膠的降解率曲線

是利用吸光度來測量細(xì)菌培養(yǎng)液的濃度，從而估計(jì)細(xì)菌的生長情況?？疾炝瞬煌宦?lián)劑及交聯(lián)度的PASP凝膠在發(fā)酵液中的值的變化，結(jié)果如圖10所示。由圖10(a)可知，在液體培養(yǎng)法中，以GTE 為交聯(lián)劑交聯(lián)度為40%的PASP 凝膠9h 的值為1.72，交聯(lián)度為60%時(shí)凝膠的值為1.2，菌體量明顯降低，降解度下降。由圖10(b)可以看出，以EGDE 為交聯(lián)劑交聯(lián)度為60%的PASP凝膠在9h時(shí)的值為1.4，比相同交聯(lián)度下GTE交聯(lián)的PASP 凝膠高14.2%，說明GTE 交聯(lián)的PASP凝膠降解速率更慢。

圖10 液體培養(yǎng)法中同一交聯(lián)劑不同交聯(lián)度、同一交聯(lián)度不同交聯(lián)劑PASP凝膠的OD600曲線

3 結(jié)論

聚天冬氨酸凝膠作為一種新型環(huán)境友好型高分子材料，在農(nóng)林保水、水處理、環(huán)境保護(hù)、生物醫(yī)藥、化妝品等諸多領(lǐng)域都有極大的應(yīng)用潛力。本文采用GTE 為交聯(lián)劑制備PASP 凝膠，并與EGDE 交聯(lián)PASP 凝膠進(jìn)行了對(duì)比，最后考察凝膠的生物降解性。結(jié)果表明：與EGDE 交聯(lián)PASP 凝膠相比，GTE 交聯(lián)凝膠吸水率較低，交聯(lián)度為40%時(shí)，吸水率為178g/g，具有良好的吸水保水性，而且耐熱性和黏彈性更優(yōu)，平板培養(yǎng)證明GTE交聯(lián)PASP凝膠也可被放線菌、細(xì)菌等微生物降解，液體培養(yǎng)法證明交聯(lián)劑種類和交聯(lián)度對(duì)凝膠的降解速率均有顯著影響，交聯(lián)度均為60%時(shí)，GTE 為交聯(lián)劑的凝膠第9 天降解率為49.3%，較EGDE 為交聯(lián)劑的凝膠低9.2%，相同交聯(lián)度下GTE 交聯(lián)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更致密，降解更慢；以GTE 為交聯(lián)劑時(shí)，交聯(lián)度為40%的凝膠第9 天降解率為59.8%，較交聯(lián)度為60%的凝膠提高了17.5%，交聯(lián)度越低，降解速率越快，通過測試發(fā)酵液中的值也顯示相同的趨勢。一般而言，PASP 凝膠越易形成致密網(wǎng)絡(luò)就越不利于水分子的滲透和擴(kuò)散，但材料的強(qiáng)度、韌性及耐久性均會(huì)增強(qiáng)，