周美玉，王 偉，劉 立，楊在亮，譚永紅

(重慶市涪陵中心醫(yī)院腫瘤血液科，重慶 408000)

食管癌是消化道的常見腫瘤之一，其不但發(fā)病率高，且死亡率更高，居全球癌癥死亡數(shù)的第6位[1-2]。食管癌多見于中老年男性，其中90%以上為鱗狀細(xì)胞癌，其次為腺癌。食管癌具有高度侵襲性、浸潤性、轉(zhuǎn)移性等特征，可導(dǎo)致患者預(yù)后較差，5年生存率不超過20%[3-4]。食管癌患者出現(xiàn)進(jìn)行性吞咽梗阻、聲音嘶啞、飲水嗆咳等典型臨床表現(xiàn)時，多數(shù)已進(jìn)展至中晚期，即使給予手術(shù)、化療、放療及免疫治療等多種治療方式，該類患者仍不能很好地達(dá)到根治目的且容易復(fù)發(fā)[5]。隨著病情進(jìn)展，食管癌患者胃腸道反應(yīng)逐漸加重，進(jìn)食困難，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，同時也限制了后線治療方案的實施[6]。既往有研究表明，中醫(yī)中藥在降低食管癌放療及化療不良反應(yīng)、協(xié)助抗癌治療、改善進(jìn)食、延長患者生存時間等方面均取得了很好的效果[7-8]。

中藥復(fù)方黃連湯(載于《圣濟(jì)總錄》卷一七八)主要由中藥單體黃連、烏梅、艾葉和干姜組成，具有平調(diào)寒熱、和胃降逆之藥效，主要用于消化系統(tǒng)疾病[9]。現(xiàn)代研究表明，黃連湯能夠保護(hù)胃腸道黏膜[10]，對于多種消化系統(tǒng)腫瘤具有不同程度的抑制作用。復(fù)方黃連湯中有效成分在食管癌治療中具有潛在功效和靶點，但目前尚無更多系統(tǒng)性文獻(xiàn)報道。本研究通過構(gòu)建“復(fù)方黃連湯-有效成分-靶點-食管癌”網(wǎng)絡(luò)，以生物信息學(xué)分析方法尋找復(fù)方黃連湯與食管癌治療靶點之間的有效聯(lián)系，探索其分子機制，并用分子對接給予驗證，為復(fù)方黃連湯治療食管癌提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料來源 檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)及DrugBank、UniProt、GeneCards、OMIM、TTD、PharmGKB等數(shù)據(jù)庫。

1.2方法

1.2.1復(fù)方黃連湯有效成分篩選 在TCMSP中分別檢索“黃連”“烏梅”“艾葉”“干姜”的活性成分，篩選條件設(shè)置為類藥性(DL)≥0.18、口服生物利用度(OB)≥30%[11]。將候選化合物在DrugBank中匹配靶點，利用UniProt數(shù)據(jù)庫對藥物靶點英文全名進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.2黃連湯治療食管癌潛在靶點篩選 利用GeneCards、PharmGKB、DrugBank、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞Esophagus cancer，篩選、下載與食管癌相關(guān)的靶標(biāo)，匯總數(shù)據(jù)庫后去除重復(fù)值，獲得疾病靶點。

1.2.3“中藥-化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 對復(fù)方黃連湯活性成分的對應(yīng)靶點及食管癌的靶點蛋白取交集后獲得共同靶點，繪制韋恩圖，并在Cytoscape3.8.0軟件中構(gòu)建“中藥-化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，借以研究復(fù)方黃連湯的中藥成分。

1.2.4蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 利用STRING數(shù)據(jù)庫繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，采用Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可視化處理。根據(jù)Degree值中位數(shù)篩選核心靶點[12]。

1.2.5基因富集分析 為探討中藥化合物對應(yīng)的預(yù)測潛在靶點在基因功能和通路中的作用，將1.2.4收集的共同靶點蛋白導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫,對獲得的潛在有效靶點，采用R軟件進(jìn)行基因本體論(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，分析其主要的生物學(xué)過程和代謝通路，將結(jié)果繪制成柱狀圖和氣泡圖進(jìn)行可視化。

1.2.6分子對接 小分子配體的2D結(jié)構(gòu)文件從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載，應(yīng)用ChemOffice軟件將其轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)文件。從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫下載蛋白分子結(jié)構(gòu)文件，采用PyMOL軟件刪除溶劑分子和小分子。采用AutoDock Tools軟件通過調(diào)整X、Y、Z坐標(biāo)軸并進(jìn)行分子對接模擬，并利用PyMOL軟件對其進(jìn)行可視化。

2 結(jié) 果

2.1復(fù)方黃連湯有效成分篩選結(jié)果 通過TCMSP檢索黃連湯的化學(xué)成分，獲得黃連14個，烏梅8個，艾葉9個，干姜5個，去重后共計30個，對應(yīng)靶點211個。通過UniProt數(shù)據(jù)庫校正后最終得到183個靶點。

2.2復(fù)方黃連湯治療食管癌潛在靶點篩選結(jié)果 共檢索到食管癌相關(guān)靶點5 965個，其中GeneCards數(shù)據(jù)庫5 332個，OMIM數(shù)據(jù)庫168個，PharmGkb數(shù)據(jù)庫388個,TTD數(shù)據(jù)庫11個,DrugBank數(shù)據(jù)庫66個。利用韋恩圖取交集得到5 625個靶點。見圖1。進(jìn)一步分析食管癌相關(guān)靶點與黃連湯化學(xué)成分相關(guān)靶點的相互交集，最終得出藥物與疾病共同靶點154個，即為復(fù)方黃連湯治療食管癌的潛在靶點。見圖2。

圖1 食管癌交集靶點韋恩圖

圖2 藥物與食管癌交集靶點韋恩圖

2.3“中藥-化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建情況 網(wǎng)絡(luò)圖見圖3，其中有154個食管癌癌靶點基因(圖中右側(cè)節(jié)點)，節(jié)點越大代表與之相連的化合物越多，網(wǎng)絡(luò)中有22個化合物成分。

圖3 “中藥-化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析情況 PPI網(wǎng)絡(luò)中共有109個節(jié)點，通過307條邊發(fā)生相互作用。在該網(wǎng)絡(luò)中，每條邊代表靶點之間的靶向相互作用關(guān)系。篩選潛在核心目標(biāo)，創(chuàng)建子網(wǎng)絡(luò)，見圖4。結(jié)果顯示，JUN、RELA、TP53、TNF、MAPK1、FOS、MYC、CDKN1A、CCND1、IL6、RB1 11個基因是復(fù)方黃連湯治療食管癌的潛在關(guān)鍵靶基因。

圖4 核心網(wǎng)絡(luò)圖

2.5富集分析情況 GO富集分析確定了2 598個條目，其中生物學(xué)過程2 331條，包括對脂多糖、細(xì)菌起源分子、金屬離子、營養(yǎng)水平的反應(yīng)等，尤其對脂多糖反應(yīng)顯示出較高的調(diào)節(jié)能力。細(xì)胞成分77條，分別是膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)域、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、核轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、蛋白激酶復(fù)合物、小凹、神經(jīng)元細(xì)胞體。復(fù)方黃連湯作用區(qū)域主要是細(xì)胞膜，其次是線粒體和細(xì)胞體等結(jié)構(gòu)。分子功能189條，主要包括DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、RNA聚合酶Ⅱ-特異性、組蛋白激酶活性等。取排名靠前的10個條目作圖。見圖5。

圖5 GO富集分析柱狀圖

KEGG通路富集分析中獲得166條通路(P<0.05)，排序后取前30條信號通路(富集基因數(shù)目降序排列)作圖，見圖6。復(fù)方黃連湯作用于食管癌的主要靶點集中在脂質(zhì)和動脈粥樣硬化信號通路(39個靶點，占27%)、乙型肝炎信號通路(31個靶點，占21%)、晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)信號通路(30個靶點，占20%)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路(28個靶點，占19%)、腫瘤壞死因子信號通路(24個靶點，占17%)等。

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.6分子對接 通過查閱文獻(xiàn)從核心基因中篩選與食管癌密切相關(guān)的關(guān)鍵基因RELA、TN及JUN、TP53、MAKP1、FOS、MYC、CDKN1A、CCND1、IL6、RB1，分別與治療食管癌的有效成分山柰酚、槲皮素進(jìn)行分子對接，以結(jié)合能小于或等于-5.0 kcal/mol作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，復(fù)方黃連湯核心活性成分槲皮素、山柰酚與食管癌關(guān)鍵分子對接結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol。

3 討 論

食管癌屬于中醫(yī)“哽噎”范疇，病因一為飲食勞倦、情志不調(diào)；二為外感六淫、穢濁之邪。內(nèi)外之邪可單獨致病，也可交互影響，共同致病，最終導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)、氣血失和、邪氣阻滯、日久生癌，辨證多為氣郁、痰阻、血瘀、氣血津虧。臨床發(fā)現(xiàn)時多為中晚期，部分患者經(jīng)常規(guī)手術(shù)、放療、化療等治療后，氣血虧虛更嚴(yán)重，不利于疾病恢復(fù)。前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，中藥治療食管癌作用平穩(wěn)、不良反應(yīng)小，尤其在改善食管癌患者生活質(zhì)量和延長患者生存時間等方面療效顯著?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃連具有保護(hù)心腦血管、降糖、抗炎、抗腫瘤等藥理作用[13]。陳梅等[14]研究指出，黃連湯主要用于消化系統(tǒng)疾病，以及辨證屬上熱下寒、寒熱錯雜者，效果明顯。復(fù)方黃連湯具有抗氧化、病毒、炎癥、細(xì)菌，同時具有增強機體免疫等多種作用[15]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，共篩選出復(fù)方黃連湯的有效化學(xué)成分30個，對應(yīng)靶點183個，食管癌相關(guān)靶點5 625個，最終得出藥物與疾病共同靶標(biāo)154個；通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析得到網(wǎng)絡(luò)核心基因11個，分別為RELA、TNF、TP53、JUN、MAPK1、FOS、MYC、CDKN1A、CCND1、IL6、RB1。上述11個核心基因通過基因ID轉(zhuǎn)換，獲得復(fù)方黃連湯的活性分子為槲皮素、山柰酚。為了進(jìn)一步明確復(fù)方黃連湯治療食管癌的作用機制，本研究采用分子對接技術(shù)對關(guān)鍵化合物山柰酚與關(guān)鍵蛋白(RELA、TNF)、槲皮素與關(guān)鍵蛋白(JUN、TP53、MAKP1、FOS、MYC、CDKN1A、CCND1、IL6、RB1)進(jìn)行分子對接。結(jié)果顯示，山柰酚、槲皮素與靶蛋白均可進(jìn)行很好地結(jié)合。

槲皮素是一種具有潛在化學(xué)預(yù)防活性的多酚類黃酮，其可上調(diào)Bax蛋白及下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，從而誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡[16]。這種作用呈劑量依賴性地抑制食管癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、血管生成[17]，LIU等[18]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過降低血管內(nèi)皮生長因子A、基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)，從而抑制食管癌細(xì)胞侵襲和血管生成。WANG等[19]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過誘導(dǎo)miR-1-3p對食管癌細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用。槲皮素-3-甲基醚可有效抑制食管鱗狀細(xì)胞癌中蛋白激酶B(Akt)及下游雷帕霉素靶蛋白表達(dá)，減弱食管癌細(xì)胞增殖和錨定能力[20]。山柰酚可顯著抑制人Ea-109細(xì)胞增殖和凋亡[21]，參與調(diào)控細(xì)胞周期。此外，山柰酚還可明顯抑制腫瘤糖酵解和表皮生長因子受體活性，進(jìn)而抑制腫瘤生長，是治療食管癌的有效化合物[22]。

本研究結(jié)果顯示，復(fù)方黃連湯治療食管癌的靶點位于細(xì)胞膜，主要信號通路涉及脂質(zhì)和動脈粥樣硬化信號通路、AGE-RAGE信號通路、MAPK信號通路等。脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物4-hydroxynonenal(4-HNE)被認(rèn)為是一種氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑。ZHANG等[23]研究發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中4-HNE的表達(dá)水平顯著升高，且其表達(dá)水平與臨床分期和炎癥嚴(yán)重程度顯著相關(guān)，并隨著癌前病變的進(jìn)展而升高，與染色陰性患者相比，4-HNE染色陽性患者臨床結(jié)局較差。提示氧化應(yīng)激是食管癌患者癌變的驅(qū)動力。有研究發(fā)現(xiàn)，AGE-RAGE信號通路通過Rb蛋白磷酸化增強前列腺癌細(xì)胞的增殖，其在食管癌中的機制尚不明確[24]。

綜上所述，復(fù)方黃連湯中藥物有效成分山柰酚、槲皮素可能通過MAPK等信號通路發(fā)揮抑制食管癌的作用。復(fù)方黃連湯治療食管癌具有多成分、多靶點、多通路特點，為其臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從潛在化學(xué)成分、靶標(biāo)、信號通路、生物學(xué)過程等角度分析復(fù)方黃連湯治療食管癌潛在作用機制，為臨床提供了理論依據(jù)。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的局限性，后續(xù)基礎(chǔ)研究可圍繞預(yù)測得到的化合物、作用靶點及信號通路作進(jìn)一步研究。