羅云，張文靜，張洪亮，徐進(jìn)

（1.溫州大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，浙江 溫州325035； 2.大慶師范學(xué)院，黑龍江 大慶 163458）

雌馬酚（Equol），淡黃色粉末，分子式為C15H4O3，相對(duì)分子質(zhì)量為242.7，化學(xué)名稱(chēng)為3-(4-羥基苯基)四氫苯并吡喃-7-醇，結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。它屬于非甾體雌激素類(lèi)，具有兩種對(duì)映體形式，即S-雌馬酚和R-雌馬酚，結(jié)構(gòu)式如圖2 所示。

圖1 雌馬酚對(duì)映體的結(jié)構(gòu)式

圖2 雌馬酚單一對(duì)映體的結(jié)構(gòu)式

雌馬酚是高度親油性的，這使得它在水中極不溶。它的熔點(diǎn)約為189～190 ℃[1-2]。雌馬酚被認(rèn)為是所有大豆異黃酮中最活躍的代謝物，與前體大豆異黃酮相比，它具有更高的抗氧化和雌激素活性[3-5]，對(duì)抗腫瘤、抗氧化活性、抗炎活性、心血管保護(hù)等都具有一定作用。研究表明，S-雌馬酚對(duì)雌激素受體β的選擇性親和力比R-雌馬酚高11 倍左右。另外，不同的對(duì)映體在生物活性方面表現(xiàn)出多樣性，這表明它們適合多種臨床應(yīng)用[6]。目前，大豆異黃酮已經(jīng)被廣泛研究，雌馬酚是大豆異黃酮在體內(nèi)的主要活性代謝物。越來(lái)越多的證據(jù)表明，大豆異黃酮通常不會(huì)直接發(fā)揮雌激素活性，而大豆異黃酮的最終腸道代謝產(chǎn)物S-雌馬酚具有較高的雌激素活性，現(xiàn)已被廣泛研究[7-8]。但是，據(jù)推測(cè)，飲食習(xí)慣和遺傳因素也會(huì)影響體內(nèi)的雌馬酚的產(chǎn)生。因此，在體外生產(chǎn)雌馬酚的方法不斷發(fā)展。所以，對(duì)雌馬酚的拆分研究極其重要。

對(duì)雌馬酚的拆分是通過(guò)高效液相色譜法進(jìn)行的，色譜技術(shù)是利用不同物質(zhì)對(duì)固定相有不同的吸附解析能力導(dǎo)致的保留時(shí)間不一樣，來(lái)達(dá)到分離的目的[9]。批處理分離方法憑借分離穩(wěn)定、快速、成本低等優(yōu)勢(shì)應(yīng)用在各個(gè)化工領(lǐng)域的生產(chǎn)中[10]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

雌馬酚對(duì)映體（＞98%），上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；正己烷（95%）和無(wú)水乙醇（99.9%），HPLC級(jí)， 百靈威科技公司； 1,3,5- 三叔丁基苯（TTBB），＞98%，TCI；Chiralpak AD 柱（100 mm×10 mm，20 μm），大賽璐手性技術(shù)公司；高效液相色譜儀，Agilent 1260，Agilent 公司；Sartorius BSA224SCW 電子天平；Julabo F34-ED 超級(jí)恒溫水??；德國(guó)Brand 電子移液槍?zhuān)籗B-4200D 超聲波清洗機(jī)。

1.2 雌馬酚對(duì)映體紫外全波長(zhǎng)掃描實(shí)驗(yàn)

使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)配制好的25 mL 0.01 g·L-1雌馬酚對(duì)映體溶液進(jìn)行200～500 nm 波段全波長(zhǎng)掃描，取同一容量瓶中準(zhǔn)備好的兩份樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 色譜條件

Chiralpak AD 手性制備柱，正己烷與乙醇體積比例分別為80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40 的流動(dòng)相，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用中央空調(diào)和水浴控溫為25 ℃。

1.4 泵流量的校正實(shí)驗(yàn)

高效液相色譜的泵的精準(zhǔn)性不是固定不變的，會(huì)因?yàn)槭褂媚p等原因使其存在一定的誤差，所以在實(shí)驗(yàn)之前要對(duì)泵的流量進(jìn)行校正。本實(shí)驗(yàn)所用的高效液相色譜Aglient 1260 是二元泵，假定為A 泵、B 泵，需要對(duì)其分別進(jìn)行校正。

因流動(dòng)相的配比對(duì)泵流量的校正實(shí)驗(yàn)沒(méi)有影響，所以選取流動(dòng)相為正己烷、乙醇（體積比80∶20）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 色譜系統(tǒng)管路死體積和色譜柱孔隙率的測(cè)定實(shí)驗(yàn)

0.50 g·L-1TTBB 溶液和0.50 g·L-1雌馬酚對(duì)映體溶液的配制：分別用分析天平稱(chēng)取0.012 5 g 的TTBB和雌馬酚于小燒杯中，然后用配置好的流動(dòng)相進(jìn)行溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中進(jìn)行定容，搖勻后標(biāo)記待用。對(duì)高效液相色譜系統(tǒng)死體積和色譜柱孔隙率采用以TTBB 作為示蹤劑的示蹤法進(jìn)行測(cè)定。

1.6 雌馬酚對(duì)映體線(xiàn)性吸附常數(shù)的測(cè)定實(shí)驗(yàn)

用正己烷與乙醇體積比分別為80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40 的流動(dòng)相分別配置0.5 g·L-1的雌馬酚溶液備用。開(kāi)啟儀器，設(shè)置紫外波長(zhǎng)為280 nm，在二通連接的狀態(tài)下用正己烷、乙醇（體積比80∶20）作為流動(dòng)相將系統(tǒng)基線(xiàn)沖至平穩(wěn)；打開(kāi)恒溫水浴，調(diào)整溫度為25 ℃，將流動(dòng)相、色譜柱、雌馬酚溶液以及系統(tǒng)管路放進(jìn)水浴中恒溫至少1 h；溫度穩(wěn)定之后，采取針進(jìn)樣的方式，每次進(jìn)樣0.5 g·L-1的雌馬酚溶液20 μ雌，采集在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL·min-1流速下的數(shù)據(jù)；流動(dòng)相將系統(tǒng)基線(xiàn)沖至平穩(wěn)，將流動(dòng)相換為下一組配比重復(fù)步驟實(shí)驗(yàn)并分別保存數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 雌馬酚對(duì)映體紫外全波長(zhǎng)掃描實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)兩次的掃描結(jié)果進(jìn)行處理，取平均值進(jìn)行做圖，得出雌馬酚的最佳紫外吸收波長(zhǎng)在225 nm 和280 nm 左右，本文選擇敏感波長(zhǎng)280 nm 進(jìn)行線(xiàn)性實(shí)驗(yàn)。雌馬酚的紫外全波長(zhǎng)掃描圖如圖3 所示。

圖3 雌馬酚的紫外全波長(zhǎng)掃描圖

2.2 泵流量的校正實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)得到的A 泵和B 泵數(shù)據(jù)進(jìn)行處理可以得到二者在固定條件下的實(shí)際流量，將實(shí)際流量和設(shè)定流量進(jìn)行做圖，可以得到校正曲線(xiàn)。

通過(guò)兩個(gè)泵的校正曲線(xiàn)可以看出，設(shè)定流量和試劑流量還是有一定誤差的，所以，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，按照校正曲線(xiàn)進(jìn)行流量的設(shè)定，例如A 泵需要流量為1 mL·min-1時(shí)，則設(shè)定值為1.028 mL·min-1。

2.3 色譜系統(tǒng)管路死體積和色譜柱孔隙率的測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)所獲得的以TTBB 為示蹤劑的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，因TTBB 所流出的峰并不是對(duì)稱(chēng)的，所以流出時(shí)間采用公式（3）進(jìn)行計(jì)算。

再根據(jù)公式（4），以1/Q和μt分別為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)作圖，即可得出系統(tǒng)死體積。

可得兩個(gè)泵的曲線(xiàn)方程如下。

從A 泵和B 泵的曲線(xiàn)方程可以得到，系統(tǒng)死體積V0為0.35 mL。

色譜柱的孔隙率εt是進(jìn)行后續(xù)色譜分離實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重要的基礎(chǔ)參數(shù)，也是以后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合時(shí)所需要的重要參數(shù)[11]，所以，對(duì)孔隙率的測(cè)定一定要準(zhǔn)確。以TTBB 作為示蹤劑，通過(guò)公式（7）直接求得色譜柱總空隙率εt。

式中：t—色譜柱連接時(shí)TTBB 的流出時(shí)間，min；

tplant—二通連接時(shí)TTBB 的流出時(shí)間，min；

Q—流速，mL·min-1；

Vcol—色譜柱總體積，mL。

根據(jù)V=Qt，聯(lián)立式（7），可得式（8）：

式中：V1—系統(tǒng)管路死體積V0和色譜柱的死體積之和。

已經(jīng)求出了系統(tǒng)管路死體積V0，按照同樣的方法對(duì)接有色譜柱的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理做圖，就能得出V1。A 泵測(cè)得的系統(tǒng)管路與色譜柱死體積如圖4 所示，B 泵測(cè)得的系統(tǒng)管路與色譜柱死體積如圖5 所示。

圖4 A 泵測(cè)得的系統(tǒng)管路與色譜柱死體積

圖5 B 泵測(cè)得的系統(tǒng)管路與色譜柱死體積

由圖4 和圖5 可得兩個(gè)泵的曲線(xiàn)方程如下。

從A 泵和B 泵的曲線(xiàn)方程可以得到，系統(tǒng)死體積和色譜柱死體積一共為V1=5.94 mL。色譜柱死體積為V1減去V0為5.59 mL，通過(guò)色譜柱基礎(chǔ)參數(shù)得出Vcol=7.85 mL，則根據(jù)式（8）可以得出εt=0.712。

2.4 雌馬酚對(duì)映體線(xiàn)性吸附常數(shù)的測(cè)定實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)在預(yù)設(shè)的5 個(gè)不同的流動(dòng)相配比下，通過(guò)進(jìn)樣濃度較低的對(duì)映體溶液在不同的流速下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)得到的流出曲線(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到各個(gè)條件下的亨利常數(shù)和柱效。圖6 是雌馬酚對(duì)映體的流出曲線(xiàn)，從圖6 中可以看出，兩種單一對(duì)映體的分離度不是很高，不能達(dá)到基線(xiàn)分離，所以采用式（11）和（12）來(lái)計(jì)算單一對(duì)映體的停留時(shí)間tR和N。

圖6 線(xiàn)性條件下的雌馬酚分離譜圖

式中：tR,i—保留時(shí)間；

?—孔隙率；

uint—色譜柱線(xiàn)流速；

L—色譜柱長(zhǎng)度；

W2/h—半峰寬；

α—約為5.54。

雖然雌馬酚對(duì)映體溶液無(wú)法達(dá)到基線(xiàn)分離，對(duì)于半峰寬的計(jì)算可以通過(guò)先得出半峰寬的一半，將其乘以2 來(lái)計(jì)算出準(zhǔn)確的半峰寬數(shù)據(jù)，再通過(guò)公式（12）可以得到各個(gè)單一對(duì)映體的理論塔板數(shù)。對(duì)于設(shè)定好的溫度、流動(dòng)相配比等條件，對(duì)tR.i和1/Q作圖如圖7 和圖8 所示，通過(guò)得到的直線(xiàn)斜率來(lái)求出組分i在此條件下的亨利常數(shù)。

圖7 1/Q 對(duì)t 作圖確定亨利常數(shù)

圖8 1/Q 對(duì)t 作圖確定亨利常數(shù)

通過(guò)以上對(duì)數(shù)據(jù)的處理，可以得到各個(gè)條件下的Hi和Ni。

在不同流動(dòng)相組成下的線(xiàn)性脈沖實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理所得到的結(jié)果匯總于表1。

表1 線(xiàn)性脈沖實(shí)驗(yàn)計(jì)算結(jié)果

3 結(jié) 論

利用5 個(gè)不同組成的流動(dòng)相使用Chiralpak AD柱對(duì)雌馬酚對(duì)映體進(jìn)行測(cè)定，以泵流量的測(cè)定、系統(tǒng)死體積的測(cè)定以及色譜柱孔隙率的測(cè)定作為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)不同組成流動(dòng)相雌馬酚對(duì)映體的流出曲線(xiàn)進(jìn)行分析計(jì)算，得出在不同流動(dòng)相下的柱效和亨利常數(shù)等參數(shù)。本研究對(duì)后續(xù)探究通過(guò)逆向法不同組成流動(dòng)相對(duì)模型參數(shù)的影響，以及在考慮溫度的基礎(chǔ)上加上溶解度對(duì)模型參數(shù)的影響的探究提供了有效的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，具有重要意義[12]。