廖彭瑩，陳敏玉，孫雪芹

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200)

楊桃根系酢漿草科植物楊桃(AverrhoacarambolaL.)的根，在我國(guó)主要分布于福建、臺(tái)灣、云南、廣西、廣東等地[1]，其味酸、澀，性平，具有祛風(fēng)除濕、行氣止痛、澀精止帶的功效[2]。研究表明楊桃根具有多種藥理活性，如楊桃根醇提取物對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟細(xì)胞具有保護(hù)作用[3]，具有降低血壓的作用[4]，可以緩解氧化應(yīng)激對(duì)腎組織造成的損傷，起到改善糖尿病小鼠腎損傷的作用[5]，能夠調(diào)節(jié)糖尿病小鼠的糖代謝酶活性，降低血糖，提高糖耐量和糖尿病小鼠肝臟的抗氧化能力[6]。

多糖類成分近年來(lái)備受關(guān)注，許多植物多糖已被證實(shí)具有多種生物活性，如香菇多糖自1968年提取出來(lái)就受到研究人員的持續(xù)關(guān)注，并已開(kāi)發(fā)成多種相關(guān)產(chǎn)品[7]，花椒葉多糖具有抗菌活性[8]，蘆筍皮多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性[9]等。楊桃根多糖具有抗氧化、降糖降血脂活性[10-13]，課題組在前期研究中采用單因素實(shí)驗(yàn)法和正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化了楊桃根多糖的熱水提取工藝[10]，但關(guān)于楊桃根多糖的醇沉工藝未見(jiàn)相關(guān)研究。多糖是極性物質(zhì)，不溶于醇等有機(jī)溶劑，常采用水提醇沉工藝進(jìn)行制備[11-12]。水提醇沉工藝簡(jiǎn)便易行，不需要額外設(shè)備，成本較低[14]。研究人員曾采用單因素實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化了荔枝核多糖、人參多糖和大蒜多糖的醇沉工藝，減少了有效成分損耗，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和產(chǎn)量均有所提高[14-16]。

本研究采用單因素結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了楊桃根多糖的醇沉工藝，為楊桃根活性多糖的深入研究提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楊桃根于2018年3月采于廣西南寧，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)朱意麟實(shí)驗(yàn)師鑒定為酢漿草科五斂子屬植物楊桃(AverrhoacarambolaL.)的根部，粉碎過(guò)40目篩后備用；濃硫酸(98%)、鹽酸、苯酚、D-(+)-葡萄糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所有化學(xué)試劑均為分析純；水為純化水。

1.2 儀器與設(shè)備

BS2204S型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；8453紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)安捷倫科技公司；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵，武漢亨泰達(dá)儀器設(shè)備有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；KQ-500DA型超聲波清洗機(jī)昆山市超聲儀器有限公司；EPED-E2-20TS型超純水儀，南京易普達(dá)科技發(fā)展有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 多糖提取與含量測(cè)定

稱取楊桃根粗粉500 g，按優(yōu)化工藝[10]進(jìn)行提取，將所得藥液濃縮至一定體積，于4 ℃下加入95%乙醇，靜置一定時(shí)間后，抽濾，所得沉淀用乙醚、丙酮洗滌，減壓干燥，得到多糖。精密稱取多糖用超純水溶解，配制成一定濃度溶液，按照文獻(xiàn)[10]方法操作，測(cè)定吸光值，按下式計(jì)算溶液中多糖含量。采用苯酚-硫酸法測(cè)定樣品溶液中多糖含量[10]。

多糖含量%=[(C × V ×D)/M]×100%

(1)

式中，C為樣品溶液中多糖的濃度，mg/mL；V為樣品溶液的體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；M為楊桃根多糖質(zhì)量，mg。

1.3.2 醇沉工藝優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取500 g楊桃根粗粉，按“2.1”項(xiàng)下操作進(jìn)行提取，將提取液分成若干等份，每份50 mL，考察醇沉濃度、醇沉?xí)r間和提取液濃度對(duì)多糖含量的影響，即設(shè)置醇沉濃度分別為40%、50%、60%、70%和80%，靜置12 h；醇沉濃度為60%，設(shè)置醇沉?xí)r間分別為4、8、12、16和20 h；醇沉濃度為60%，醇沉?xí)r間為12 h，設(shè)置提取液濃度分別為5.00、3.33、2.50、2.00和1.67 g/mL。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用采用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，進(jìn)行醇沉工藝優(yōu)化，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1所示。由圖1(A)可知，醇沉濃度為40%～60%時(shí)，多糖含量與醇沉濃度呈正相關(guān)，在60%時(shí)含量最高，可達(dá)53.59%。肖瓊等研究表明[17]，醇沉過(guò)程中存在臨界乙醇量值，當(dāng)乙醇總量低于該值時(shí)，醇溶物的量與乙醇用量成正比，高于該值時(shí)，增加趨勢(shì)減緩直至不再增加。綜合考慮乙醇用量及多糖含量，選擇60%乙醇為響應(yīng)面試驗(yàn)醇沉濃度的中心點(diǎn)。

由圖1(B)可知，醇沉?xí)r間為4～12 h時(shí)，多糖含量與醇沉?xí)r間呈正相關(guān)，在12 h時(shí)含量最高，可達(dá)36.58%，醇沉?xí)r間超過(guò)12 h，隨著醇沉?xí)r間增加，含量呈下降趨勢(shì)?？赡艿脑蚴请S著醇沉?xí)r間增加，蛋白質(zhì)、淀粉等大分子沉降顆粒之間互相作用、互相交聯(lián)，形成更大顆粒，沉降速度加快[18]。隨著醇沉?xí)r間增加，沉淀越多，但多糖含量減少，選擇12 h作為響應(yīng)面試驗(yàn)醇沉?xí)r間的中心點(diǎn)。

由圖1(C)可知，提取液濃度在1.67～5.00 g/mL范圍內(nèi)，多糖含量與提取液濃度呈正相關(guān)，在2.50 g/mL時(shí)含量最高，可達(dá)30.49%，而提取液濃度超過(guò)2.50 g/mL后，隨著提取液濃度增大，含量呈下降趨勢(shì)。這可能是由于提取液濃度過(guò)高時(shí)，藥液黏稠度增大，乙醇與藥液難以充分接觸，易溶于乙醇的大分子雜質(zhì)易沉淀，導(dǎo)致沉淀中多糖含量減少[19]，故選擇2.50 g/mL作為響應(yīng)面試驗(yàn)提取液濃度的中心點(diǎn)。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以醇沉濃度(A)、醇沉?xí)r間(B)和提取液濃度(C)為因素，以多糖含量(Y)為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，進(jìn)行醇沉工藝優(yōu)化。因素與水平見(jiàn)表1所示，試驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表2所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

續(xù)表2

對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到二元多次回歸方程：

Y=27.38+2.04A+0.68B+1.10C-1.00AB+1.97AC

-1.95BC-2.50A2-4.94B2-2.94C2

(2)

對(duì)其進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3所示。

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)A、B、C之間的交互作用對(duì)多糖含量的影響并確定各因素的最佳水平范圍，繪制了等高線圖和響應(yīng)面圖，結(jié)果見(jiàn)圖2所示。由圖2可知，當(dāng)醇沉濃度一定時(shí)，隨著醇沉?xí)r間延長(zhǎng)，多糖含量先增加后減??；當(dāng)醇沉?xí)r間一定時(shí)，隨著醇沉濃度增加，多糖含量呈先增加后減小趨勢(shì)。響應(yīng)曲面坡度相對(duì)較平，表明醇沉濃度和醇沉?xí)r間的交互作用對(duì)多糖含量的影響較弱。當(dāng)醇沉濃度固定時(shí)，隨著提取液濃度增大，多糖含量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)；當(dāng)提取液濃度固定時(shí)，隨著醇沉濃度增加，多糖含量呈先增加后減小趨勢(shì)。響應(yīng)曲面坡度相對(duì)陡峭，表明醇沉濃度和提取液濃度的交互作用對(duì)多糖含量影響較大。當(dāng)醇沉?xí)r間固定時(shí)，隨著提取液濃度增加，多糖含量先增加后減?。划?dāng)提取液濃度固定時(shí)，隨著醇沉?xí)r間延長(zhǎng)，多糖含量呈先增加后減小趨勢(shì)。響應(yīng)曲面坡度相對(duì)陡峭，表明醇沉?xí)r間和提取液濃度的交互作用對(duì)多糖含量的影響較大。根據(jù)試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷玫酱汲凉に囎顑?yōu)條件為：醇沉濃度68.95%，醇沉?xí)r間12.57 h，提取液濃度2.23 g/mL，預(yù)測(cè)多糖含量為28.06%。結(jié)合實(shí)際，將醇沉工藝優(yōu)化為醇沉濃度69.00%，醇沉?xí)r間 13 h，提取液濃度為2.22 g/mL。

表3 方差分析結(jié)果

圖2 各因素交互作用對(duì)多糖含量的效應(yīng)曲面圖和等高線

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)優(yōu)化醇沉工藝，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得多糖含量分別為28.20%，27.85%和27.78%，平均值為27.94%(RSD=0.81%，n=3)，與預(yù)測(cè)值28.06%相近，表明該模型預(yù)測(cè)性良好，優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié) 論

植物多糖常用提取方法很多，本研究選擇水提醇沉法，該法對(duì)儀器設(shè)備要求不高、操作簡(jiǎn)單，不需要對(duì)提取液進(jìn)行加熱，避免了對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的破壞，避免多糖裂解。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法優(yōu)化了醇沉工藝，影響多糖含量的各因素排序?yàn)椋捍汲翝舛?提取液濃度>醇沉?xí)r間，優(yōu)化醇沉工藝為醇沉濃度68.95%，醇沉?xí)r間12.57 h，提取液濃度為 2.23 g/mL，結(jié)合實(shí)際，調(diào)整為醇沉濃度69%，醇沉?xí)r間13 h，提取液濃度為2.22 g/mL。在此條件下所得楊桃根多糖含量為27.94%，與理論值28.06%接近，說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化多糖醇沉工藝穩(wěn)定可靠，可為其高效制備工藝開(kāi)發(fā)提供研究依據(jù)。優(yōu)化工藝常用方法有正交設(shè)計(jì)與響應(yīng)面設(shè)計(jì)，其中響應(yīng)面法采用非線性模型，得到的預(yù)測(cè)模型是連續(xù)的，而正交設(shè)計(jì)法是用線性數(shù)學(xué)模型進(jìn)行設(shè)計(jì)，只對(duì)孤立的點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，不能在整個(gè)區(qū)域上找到因素的最佳組合。故本論文采用響應(yīng)面法進(jìn)行了優(yōu)化。