卜義凡 樸圣愛 李紫薇 胡曉陽

作者單位:150000 哈爾濱,黑龍江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院[卜義凡(碩士研究生)、李紫薇(碩士研究生)、胡曉陽];黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院兒一科(樸圣愛)

酒精性肝損傷(alcoholic liver disease,ALD)是由于過量攝入酒精導致的肝臟相關疾病的總稱,主要表現(xiàn)形式有酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化,四種表現(xiàn)形式可單獨或混合存在[1]。目前ALD治療方法較為局限,一般為戒酒和對癥治療,晚期主要為肝移植。傳統(tǒng)醫(yī)學憑借整體審查、辨證論治的特點,在ALD防治方面具有一定優(yōu)勢。尖葉假龍膽是蒙醫(yī)學中清熱解毒、利膽退黃的藥物,其味苦、性涼,常用來治療黃疸、肝炎等疾病,現(xiàn)代藥理學研究表明其有保肝、抗腫瘤、抗心律失常、抗炎和抗氧化等作用[2-3]。課題組在前期研究中已證實了尖葉假龍膽對ALD的治療作用[4-5],本研究主要探索尖葉假龍膽各組分拮抗ALD效果,通過建立慢性ALD大鼠模型,用滲漉法分離尖葉假龍膽的不同組分,測定其對ALD模型大鼠脂代謝系統(tǒng)、氧化—抗氧化系統(tǒng)、乙醇代謝酶、炎性細胞因子等指標的影響以及觀察肝臟病理變化來驗證尖葉假龍膽不同組分的護肝作用效果并分析其對肝臟的保護機理,確定其中作用效果最優(yōu)的組分,從而為今后對酒精性肝損傷的預防與治療提供新的思路,并為尖葉假龍膽的更深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠80只,體質量為180～220 g之間,購自黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心,許可證編號:SCXK(黑)2018-001。實驗動物飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學方劑學實驗室,實驗經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準后進行。

1.2 藥品與試劑

蒸餾水(實驗室自制);56°紅星二鍋頭(北京紅星股份有限公司,批號20180524);烏拉坦(上海山浦化工有限公司,批號20180917);谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、白介素6(interleukin-6,IL-6)、白介素8(interleukin-8,IL-8)、白介素10(interleukin-10,IL-10)、轉化生長因子-β1(transforming growth factorβ,TGF-β1)、乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)、乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)ELISA試劑盒(購自上海素爾生物科技股份有限公司,貨號20181202B、20180906、DECO0195、DRE20142、DECO0008、DEE20030、DECO0007、DEE20031、 DEE20033、 DEE20035、 E04727r-1、03148B、03739B)。尖葉假龍膽全草(保存于黑龍江中醫(yī)藥大學的方劑學實驗室,購自黑龍江省大興安嶺地區(qū),經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學王振月教授鑒定為龍膽科假龍膽屬的尖葉假龍膽植物的干燥全草);復方蛋氨酸膽堿片(白求恩醫(yī)科大學制藥廠,批號17050158)。

1.3 儀器

旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠,RE52CS-1);循環(huán)水真空泵(鄭州長盛實驗儀器有限公司,SHB-Ⅲ);恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠,B-260);中藥材粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司,FY130);電子天平(上海精密科學儀器有限公司,JH3102);滲漉筒(自制);超薄切片機(德國萊卡公司,2135);顯微影像成像系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)公司,Moticam3000);全自動生化分析儀(美國M.D公司,Glamour 2000);臺式離心機(德國Hettich公司,Mikro22/22R);紫外可見光分光光度計(日本島津制作所,UV-2550);多功能酶標儀(瑞士Tecan公司,Infinite M200 pro)。

1.4 藥液制備

尖葉假龍膽全草以10倍量蒸餾水浸泡1小時后,煎煮藥物1小時,過濾藥渣,取其水煎液,再將過濾后的藥渣以10倍量的水加熱回流提取0.5小時,過濾藥渣,取其水煎液,將兩次取得的藥液合并,于旋轉蒸發(fā)儀中將合并后的提取液減壓濃縮成浸膏,加入適量的蒸餾水稀釋成濃度為0.5 g/mL藥液,冷藏備用,為實驗中全草組使用藥物。取尖葉假龍膽全草600 g粉碎成粗粉,10倍量蒸餾水密閉浸泡24小時。將藥材粗粉加入滲漉筒,均勻壓平,分別以蒸餾水、30%乙醇、60%乙醇、90%乙醇十倍體積洗脫,收集洗脫液進行減壓濃縮成浸膏,再加適量蒸餾水稀釋成相同體積的稀釋液備用。將復方蛋氨酸膽堿片粉碎后用蒸餾水稀釋成0.04 g/mL的溶液。

1.5 造模與分組

80只雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)一周后隨機分為空白組、模型組、陽性藥組、全草組、水洗脫組、30%乙醇洗脫組、60%乙醇洗脫組及90%乙醇洗脫組共8組。本實驗模擬人類飲酒習慣,采取梯度酒精灌胃配合高脂飼料喂養(yǎng)造模,實驗第1周,除空白組外,各組大鼠以8 mL/kg的56°紅星二鍋頭灌胃。第2周開始,各組大鼠給予的酒精量每周遞增1 mL/kg,至第8周酒精灌胃量達到15 mL/kg,空白組大鼠則全程給予相同體積的生理鹽水灌胃,同時空白組大鼠予以普通飼料喂養(yǎng),其余各組以普通飼料與高脂飼料每隔一日交替喂養(yǎng)。由于長期酒精灌胃導致動物死亡無可避免,造模過程中模型組和60%乙醇洗脫組實驗動物分別死亡3只,陽性藥組、全草組、30%乙醇洗脫組分別死亡2只,水洗脫組與90%乙醇洗脫組分別死亡1只。

1.6 給藥方法

實驗第5周至第8周除空白組和模型組外,其余各組均通過灌胃法給予實驗大鼠相應的藥物。為了模擬人類飲酒和用藥的過程,并為大鼠消化吸收留出相應的時間,每日給藥與酒精灌胃錯時6小時,即采取于上午給予酒精造模而下午(間隔6小時)給予藥物灌胃的方法,給藥體積為10 mL/kg。具體方法為:陽性藥組給予復方蛋氨酸膽堿片稀釋液(0.04 g/mL)10 mL/kg進行灌胃,全草組給予尖葉假龍膽全草水煎稀釋液10 mL/kg,水洗脫組給予尖葉假龍膽水洗脫液10 mL/kg,30%乙醇洗脫組給予尖葉假龍膽30%乙醇洗脫液10 mL/kg,60%乙醇洗脫組給予尖葉假龍膽60%乙醇洗脫液10 mL/kg,90%乙醇洗脫組給予尖葉假龍膽90%乙醇洗脫液10 mL/kg,空白組和模型組給予10 mL/kg生理鹽水灌胃。陽性藥組給藥量相當于復方蛋氨酸膽堿片0.4 g/kg,其余各實驗組給藥量相當于尖葉假龍膽生藥材5 g/kg。

1.7 樣本采集與指標檢測

1.7.1 尖葉假龍膽不同組分對ALD大鼠血清轉氨酶及脂代謝的影響 末次給藥6小時后禁食水,12小時后腹腔注射20%濃度的烏拉坦溶液(0.5 mL/100 g)麻醉,腹主動脈采血,離心機配平后條件設置為4℃、3500 r/min,離心10分鐘,分離血清,按照試劑盒要求的操作方法于全自動生化儀分析血清中ALT、AST、TG、TC含量。

1.7.2 尖葉假龍膽不同組分對ALD大鼠炎性細胞因子的影響 末次給藥6小時后禁食水,12小時后腹腔注射20%濃度的烏拉坦溶液(0.5 mL/100g)麻醉,腹主動脈采血,離心機配平后條件設置為4℃、3500 r/min,離心10分鐘,分離血清,按照試劑盒要求的操作方法于全自動生化儀分析血清中IL-6、IL-8、IL-10和TGF-β1含量。

1.7.3 尖葉假龍膽不同組分對ALD大鼠肝臟指數(shù)和肝組織病理形態(tài)的影響 末次給藥6小時后禁食水,12小時后將大鼠逐一稱重,腹腔注射20%烏拉坦溶液(0.5 mL/100 g)麻醉,將整個肝臟取出并用生理鹽水沖洗。用濾紙將整個肝臟吸干,電子天平稱重,計算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)計算公式為:肝臟指數(shù)=肝臟重量/體重×100%。剪取3 mm3左右大小的肝臟組織,戊二醛固定后常規(guī)漂洗、逐級脫水、包埋、固化后切片,片厚6μm,電鏡下觀察肝組織形態(tài)。

1.7.4 尖葉假龍膽不同組分對ALD大鼠TNF-α、ICAM-1蛋白表達的影響 肝組織經(jīng)甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋、切片等常規(guī)處理后,按照試劑盒說明操作,采用SP兩步法進行免疫組化染色,400倍顯微鏡下觀察。染色評分計算方法:染色總分=染色強度×染色面積,染色強度以無染色記0分,輕度著色記1分,重度著色記3分;染色面積以陽性細胞著色記分,無染色記0分,低于10%記1分,10%～50%記2分,50%～80%記3分,高于80%記4分。

1.7.5 尖葉假龍膽不同組分對ALD大鼠氧化-抗氧化系統(tǒng)的影響 剪取約1 g肝組織置于加入9 g生理鹽水的勻漿器中,充分研磨得到10%的肝組織勻漿液。將肝組織勻漿液在4℃,3500 r/min條件下離心10分鐘,取上清液,根據(jù)試劑盒說明書操作,測定肝組織中MDA、SOD、GSH、ADH、ALDH含量。

1.8 統(tǒng)計學方法

本實驗的數(shù)據(jù)選用SPSS 22.0軟件進行處理,實驗計量資料均符合正態(tài)分布且方差齊,故統(tǒng)計學結果以均值±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用Dunnett's檢驗,以P＜0.05有顯著性差異,P＞0.05則沒有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 尖葉假龍膽不同組分對ALD大鼠血清轉氨酶及脂代謝的影響

如表1所示,相較空白組,模型組大鼠血清中ALT、AST、TG和TC含量顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。相較模型組,陽性藥組、全草組、60%乙醇洗脫組和90%乙醇洗脫組ALT、AST、TG和TC值均降低,具有顯著差異(P＜0.05);在降低TG值方面90%乙醇洗脫組優(yōu)于全草組、水洗脫組、30%乙醇洗脫組和60%乙醇洗脫組(P＜0.05)。水洗脫組和30%乙醇洗脫組作用效果較弱,其AST和TC的含量變化無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 尖葉假龍膽不同組分對ALD大鼠轉氨酶及脂代謝的影響(±s)

表1 尖葉假龍膽不同組分對ALD大鼠轉氨酶及脂代謝的影響(±s)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05;與90%乙醇洗脫組相比,c P＜0.05。

組別 鼠只 ALT(U/L) AST(U/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L)空白組 10 31.56±4.99 20.18±6.25 4.30±0.47 4.04±0.83模型組 7 64.53±3.99a 46.58±5.61a 7.85±0.61a 7.36±0.45a陽性藥組 8 37.10±5.66b 24.11±6.38b 4.86±0.59b 4.58±1.06b全草組 8 45.87±7.43b 34.26±8.88b 6.08±0.78bc 5.72±1.02b水洗脫組 9 54.76±10.02bc 37.96±7.36 6.84±0.65bc 6.25±1.02 30%乙醇洗脫組 8 55.65±5.10bc 39.48±6.59 6.77±0.48bc 6.43±0.45 60%乙醇洗脫組 7 47.40±5.43b 32.98±6.07b 5.95±0.49bc 5.58±0.89b 90%乙醇洗脫組 9 39.56±5.37b 26.76±6.19b 5.12±0.47b 4.87±0.98 b

2.2 尖葉假龍膽不同組分對ALD大鼠炎性細胞因子的影響

如表2所示,與空白組相比,模型組血清IL-6、IL-8和TGF-β1含量升高,IL-10含量降低,具有顯著差異(P＜0.05)。相較模型組,陽性藥組、全草組、60%乙醇洗脫組和90%乙醇洗脫組IL-6、IL-8和TGF-β1含量降低,IL-10含量升高,具有顯著差異(P＜0.05)。水洗脫組和30%乙醇洗脫組作用效果較弱,其IL-8和IL-10含量變化無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表2 尖葉假龍膽不同組分對ALD大鼠細胞因子的影響(±s,pg/mL)

表2 尖葉假龍膽不同組分對ALD大鼠細胞因子的影響(±s,pg/mL)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05;與90%乙醇洗脫組相比,c P＜0.05。

組別 鼠只 IL-6 IL-8 IL-10 TGF-β1 7±249.85模型組 7 131.83±12.87a 202.80±45.62a 31.91±6.96a 1738.64±215.19a陽性藥組 8 67.95±6.55b 97.80±43.96b 54.46±7.18b 857.40±226.80b全草組 8 85.27±11.32b 132.49±44.88b 45.44±7.27b 1194.77±317.31b水洗脫組 9 110.67±14.03bc 152.31±41.40 40.24±8.98 1384.22±247.00bc 30%乙醇洗脫組 8 107.94±11.55bc 161.31±47.23 40.05±6.80 1397.11±230.25bc 60%乙醇洗脫組 7 90.74±10.74bc 134.49±46.46b 46.36±7.18b 1193.48±239.54b 90%乙醇洗脫組 9 75.45±10.36b 106.83±45.16b 52.15±7.10b 974.38±243.71空白組 10 58.96±10.30 80.83±46.95 58.06±7.10 768.1 b

2.3 尖葉假龍膽不同組分對ALD大鼠肝臟指數(shù)和肝組織病理形態(tài)的影響

如表3所示,與空白組相比,模型組的肝臟指數(shù)升高,具有顯著差異(P＜0.05)。與模型組相比,陽性藥組、全草組、60%乙醇洗脫組、90%乙醇洗脫組肝臟指數(shù)降低,具有顯著差異(P＜0.05)。水洗脫組和30%乙醇洗脫組作用效果較弱,其肝臟指數(shù)變化無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表3 尖葉假龍膽不同組分對ALD大鼠肝臟指數(shù)的影響(±s)

表3 尖葉假龍膽不同組分對ALD大鼠肝臟指數(shù)的影響(±s)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05。

組別 鼠只 肝臟指數(shù)(%)10 2.49±0.18模型組 7 2.83±0.32a陽性藥組 8 2.58±0.10b全草組 8 2.54±0.15b水洗脫組 9 2.73±0.24 30%乙醇洗脫組 8 2.63±0.26 60%乙醇洗脫組 7 2.50±0.11b 90%乙醇洗脫組 9 2.57±0.18空白組b

肝組織形態(tài)見圖1?？瞻捉M核型正常,線粒體正常。模型組線粒體明顯變形,核型不整。陽性藥組形態(tài)相對較好,溶酶體增多,內質網(wǎng)增多。全草組線粒體輕度腫脹,核型不整,脂滴略多。水洗脫組肝細胞核固縮,線粒體增多,脂滴多。30%乙醇洗脫組線粒體輕度腫脹,核型不整,脂滴增多。60%乙醇洗脫組線粒體輕度腫脹,核型不整。90%乙醇洗脫組核型基本正常,線粒體輕度腫脹,可見少量脂滴。

圖1 各實驗組大鼠肝組織病理形態(tài)變化(透射電鏡,×10000)

2.4 尖葉假龍膽不同組分對ALD大鼠TNF-α、ICAM-1蛋白表達的影響

如表4所示,與空白組相比,模型組TNF-α和ICAM-1染色評分升高,具有顯著差異(P＜0.05)。與模型組相比,陽性藥組、全草組、60%乙醇洗脫組、90%乙醇洗脫組TNF-α和ICAM-1染色評分降低,具有顯著差異(P＜0.05)。水洗脫組和30%乙醇洗脫組作用效果較弱,其變化無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表4 尖葉假龍膽不同組分對ALD大鼠TNF-α、ICAM-1蛋白表達的影響(±s,分)

表4 尖葉假龍膽不同組分對ALD大鼠TNF-α、ICAM-1蛋白表達的影響(±s,分)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05。

ICAM-1空白組組別 鼠只 TNF-α 10 1.40±0.52 1.30±0.48模型組 7 8.14±1.46 a 7.00±2.00 a陽性藥組 8 1.63±0.52 b 1.63±0.74 b全草組 8 2.88±1.25 b 2.88±0.99 b水洗脫組 9 5.44±1.67 5.44±1.67 30%乙醇洗脫組 8 5.38±1.77 5.88±1.55 60%乙醇洗脫組 7 2.86±1.07 b 3.14±0.90 b 90%乙醇洗脫組 9 1.89±0.93 b 1.67±0.71 b

TNF-α染色各組肝細胞呈不同程度陽性反應,陽性物質主要分布于胞漿,呈棕黃色細顆粒狀,見圖2。ICAM-1染色各組肝細胞呈不同呈度的陽性反應,陽性物質主要表達于肝細胞膜,部分肝細胞漿染色陽性,呈棕黃色細顆粒狀,見圖3。

圖2 各實驗組大鼠TNF-α染色情況(×400)

圖3 各實驗組大鼠ICAM-1染色情況(×400)

2.5 尖葉假龍膽不同組分對ALD大鼠氧化—抗氧化系統(tǒng)的影響

如表5所示,與空白組相比,模型組肝組織MDA升高,SOD、GSH、ADH和ALDH降低,具有顯著差異(P＜0.05)。與模型組相比,陽性藥組、全草組、60%乙醇洗脫組、90%乙醇洗脫組肝組織MDA降低,SOD、GSH、ADH和ALDH升高,具有顯著差異(P＜0.05),尤以陽性藥組和90%乙醇洗脫組效果最好;水洗脫組和30%乙醇洗脫組作用效果較弱,水洗脫組SOD、GSH和ALDH含量變化無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),30%乙醇洗脫組SOD含量變化無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表5 不同組分對ALD模型大鼠氧化-抗氧化系統(tǒng)的影響(±s,U/mg)

表5 不同組分對ALD模型大鼠氧化-抗氧化系統(tǒng)的影響(±s,U/mg)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05;與90%乙醇洗脫組相比,c P＜0.05。

組別 鼠只 SOD GSH(ng/mg) MDA(nmol/mg) ADH(U/mg) ALDH(U/mg).11 184.76±13.08模型組 7 25.51±4.06a 0.73±0.12a 0.91±0.05a 137.91±18.04a 91.18±9.58a陽性藥組 8 40.39±4.06b 1.34±0.11b 0.51±0.05b 254.34±13.05b 159.59±7.71b全草組 8 33.69±3.93b 1.18±0.06b 0.69±0.11bc 222.52±13.86bc 143.78±10.85b水洗脫組 9 29.03±5.44 0.86±0.12 0.79±0.09bc 168.03±11.28bc 104.11±10.61 30%乙醇洗脫組 8 29.55±4.86 0.92±0.14bc 0.78±0.08bc 174.54±15.33bc 114.70±15.93bc 60%乙醇洗脫組 7 35.45±3.18b 1.19±0.17b 0.70±0.07bc 228.51±17.78bc 139.44±15.99bc 90%乙醇洗脫組 9 38.28±5.82b 1.32±0.14b 0.55±0.09b 252.29±24.27b 160.21±22.01空白組 10 42.36±3.87 1.58±0.11 0.44±0.06 298.96±20 b

3 討論

傳統(tǒng)醫(yī)學認為,尖葉假龍膽具有清熱解毒、利膽退黃等功效,臨床中常用于治療黃疸、肝炎等病;現(xiàn)代研究表明,尖葉假龍膽主要化學成分為酮類化合物、萜類化合物、木脂素類化合物、黃酮類化合物和甾體類化合物,具有保肝、抗炎、抗氧化、抗心律失常、抗心肌缺血、抗腫瘤、降糖等藥理作用[2-3],并且前期研究已證實尖葉假龍膽水煎液能通過降低轉氨酶、調節(jié)脂代謝系統(tǒng)、減少氧化損傷等途徑發(fā)揮對ALD的保護作用[4-5],因此本研究具有充分的中醫(yī)學理論依據(jù)和藥理學研究基礎。然而,僅僅研究尖葉假龍膽飲片層面的效用,存在化學物質繁雜、作用機制難以明確以及質控標準不易把握等問題,制約了臨床療效,阻礙了其現(xiàn)代化開發(fā)應用。因此本研究選擇對其組分層面的作用效果進行探索,以期為未來進一步深入研究,開發(fā)藥效物質與作用機制相對明確的現(xiàn)代中藥奠定基礎。

既往研究認為ALD與過量攝入乙醇所引起的氧化應激、炎癥反應、脂代謝障礙、線粒體功能障礙、內毒素等多因素有關。長期大量攝入酒精可能導致肝臟脂質代謝紊亂和肝細胞微管創(chuàng)傷,脂肪和分泌性蛋白在肝細胞內堆積,導致肝臟指數(shù)升高[6]。肝臟受到損傷時,肝細胞膜通透性增高,肝細胞內的AST和ALT會順濃度差釋放入血,導致血液中ALT和AST升高。結合本研究結果來看,尖葉假龍膽組分能夠降低肝臟指數(shù),改善肝組織形態(tài),降低ALT、AST、TG和TC含量,提示其能通過調節(jié)脂代謝系統(tǒng)和調節(jié)轉氨酶發(fā)揮對肝臟的保護作用。

乙醇在代謝中產(chǎn)生的乙醛會打破機體中原本的氧化系統(tǒng)與過氧化系統(tǒng)之間的平衡出現(xiàn)氧化應激狀態(tài),肝組織中具有細胞毒性的氧化產(chǎn)物MDA升高,抗氧化物質GSH和SOD含量下降,機體抗氧化能力減弱,清除自由基能力下降,也會使肝細胞膜發(fā)生脂質過氧化反應,導致肝細胞損傷[7]。此外,酒精的代謝主要在ADH系統(tǒng)和ALDH系統(tǒng)參與下完成,ADH和ALDH含量降低,使乙醇和乙醛代謝速率下降,使乙醛堆積并產(chǎn)生乙醛蛋白加合物導致肝損傷[8]。本研究中,尖葉假龍膽組分能夠降低MDA含量,提高抗氧化物質和代謝酶含量,提示其能夠通過調節(jié)氧化-抗氧化系統(tǒng),加速酒精代謝達到拮抗ALD的作用。

與炎癥反應有關的細胞因子在ALD發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。酒精導致IL-6和IL-8刺激肝臟中的成纖維細胞、貯脂細胞和Kupffer細胞等分泌細胞因子,介導肝中性粒細胞浸潤,導致肝臟組織發(fā)生炎癥反應、脂肪堆積和纖維化[9-10];過量TNF-α可誘導肝細胞損傷和凋亡,乙醇可以刺激單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生過量TNF-α;TGF-β1是學界公認的導致纖維化的最強的一種細胞因子,能導致細胞外基質大量積聚,使肝細胞死亡、組織纖維化;ICAM-1是免疫球蛋白超家族的粘附分子中的一員[11],能介導中性粒細胞和肝竇內膜的黏附作用,然后向肝內浸潤,通過微循環(huán)障礙造成肝臟的損傷[12-15]。IL-10作為抑炎細胞因子,能抑制炎癥損傷拮抗ALD的發(fā)展。本研究中,尖葉假龍膽各組分能降低炎性因子含量,抑制TNF-α和ICAM-1蛋白表達,提升抑炎因子含量,提示其可能提高調節(jié)炎性因子水平,減輕炎癥反應,從而改善ALD。

綜上所述,用滲漉法分離提取出的尖葉假龍膽組分對ALD有拮抗作用,不同組分作用效果有所差異,其中最優(yōu)組分為90%乙醇洗脫組,其次為60%乙醇洗脫組和全草組,30%乙醇洗脫組和水洗脫組效果最弱,甚至對某些指標無效。尖葉假龍膽組分拮抗ALD機制可能是通過調節(jié)脂代謝系統(tǒng),促SOD、GSH生成,降低MDA,促進ADH、ALDH分泌,提高酒精代謝率,平衡氧化-抗氧化系統(tǒng),抑制IL-6、IL-8、TGF-β1等促炎細胞因子生成,促進抗炎細胞因子IL-10的生成以及抑制TNF-α、ICAM-1蛋白表達從而發(fā)揮作用。