周杰 李敬東 權(quán)剛 孫驥

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院肝膽一科，四川 南充 637000)

急性胰腺炎(AP)是一種常見的胃腸道疾病，其發(fā)病率不斷上升，且死亡率較高〔1〕。研究表明，在AP細胞系和動物模型中會出現(xiàn)miRNA的差異表達，與胰腺腺泡細胞凋亡和自噬及炎癥進展有關(guān)，減少自噬相關(guān)蛋白胞漿型LC3(LC3-Ⅰ)向膜型LC3(LC3-Ⅱ)轉(zhuǎn)化，并抑制 Beclin1的表達〔2～5〕。miR-539在AP模型中高表達〔6〕。miR-539可調(diào)節(jié)體內(nèi)外線粒體分裂與凋亡〔7〕。甘油3-磷酸脫氫酶1樣蛋白(GPD1L)在AP組織中較正常組織低表達(Genbank ID：D42047)〔8〕。但miR-539和GPD1L在AP腺泡細胞中的影響尚未可知。本實驗以雨蛙素(Cerulein)誘導(dǎo)胰腺腺泡細胞AR42J產(chǎn)生的AP細胞損傷為模型，研究miR-539和GPD1L的表達水平對雨蛙素誘導(dǎo)的AP模型AR42J細胞凋亡和自噬的影響。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠胰腺腺泡細胞株AR42J購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；胰蛋白酶、Cerulein購自美國Sigma-Aldrich公司；GPD1L抗體、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、LC3-Ⅰ抗體、LC3-Ⅱ抗體、Beclin1抗體、p62抗體購自Abcam公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α 、白細胞介素(IL)-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；總RNA提取試劑盒、實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；流式法Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；引物、GPD1L干擾劑(si-GPD1L)、GPD1L過表達載體(pcDNA-GPD1L)、miR-539 mimics(miR-216a-5p)、miR-539抑制劑(anti-miR-539)、陰性對照、GPD1L野生型(WT)和突變型(MUT)報告載體購自上海吉瑪制藥有限公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒購自美國Promega公司；二喹啉甲酸(BCA)定量檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；流式細胞儀購自美國BD公司；實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和AP模型建立〔3〕細胞傳代：將胰腺腺泡細胞AR42J培養(yǎng)于含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、 5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液，每2～3天消化傳代1次。AP模型建立：將對數(shù)生長期的AR42J細胞以1×106個/ml的濃度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，細胞融合度達到80%，然后加入終濃度為15 nmol/L的雨蛙素，對照組加入等體積的培養(yǎng)液，分別在培養(yǎng)至0、4、8、12、24 h時收集細胞，進行實驗確認建模培養(yǎng)時間。

1.2.2檢測培養(yǎng)上清中淀粉酶(AMY)、IL-6和TNF -α水平 收集經(jīng)15 nmol/L Cerulein培養(yǎng)至0、4、8、12、24 h的AR42J細胞，然后取上清，根據(jù)AMY檢測試劑盒、IL-6和TNF -α ELISA試劑盒說明書操作，檢測上清中AMY、IL-6和TNF -α水平。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測miR-539和GPD1L mRNA的表達 收集經(jīng)Cerulein處理的對數(shù)生長期AR42J細胞，提取細胞總RNA，然后合成cDNA，以cDNA為模板，按照實時熒光定量PCR說明書進行反應(yīng)，檢測miR-539和GPD1L mRNA含量。miR-539 上游引物 5′-GGAGAAATTATCCTTGGTGTGT-3′，下游引物采用通用引物；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′，下游引物5′-CGAATTTGCGTGTCATCCT-3′；GPD1L上游引物5′-CGCTGGGAATCACCCTCATC-3′，下游引物5′-CATTACTTTGCTGCCGATGGT-3′；β-actin上游引物5′-ATCGTCCACCGCAAATGCTTCTA-3′，下游引物5′-AGCCATGCCAATCTCATCTTGTT-3′。用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析，并以內(nèi)參β-actin進行校正。

1.2.4細胞轉(zhuǎn)染 收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期的AR42J細胞，用培養(yǎng)液稀釋至5×105個細胞/ml，以每孔200 μl細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，進行轉(zhuǎn)染。將anti-miR-con、anti-miR-539、miR-con、miR-539、pcDNA-NC、GPD1L、anti-miR-539+si-con和anti-miR-539+si-GPD1L等載體，轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)好的AR42J細胞中，分別以轉(zhuǎn)染載體或片段命名組別，轉(zhuǎn)染48 h，收集細胞，進行檢測驗證和AP細胞建模。

1.2.5流式細胞術(shù)測定細胞凋亡率 收集轉(zhuǎn)染和(或)Cerulein處理后的各組AR42J細胞，胰酶消化，離心收集細胞，洗滌3次，按照流式法 Annexin V/PI 試劑盒說明書進行操作，加入500 μl緩沖液重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC標記和5 μl碘化丙啶(PI)混勻，室溫避光孵育20 min，流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.2.6Western印跡檢測蛋白表達 收集各組AR42J細胞，破碎細胞并提取細胞蛋白，測定總蛋白濃度。進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的對應(yīng)一抗，4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，然后加入稀釋的二抗，室溫孵育2 h，以β-actin為內(nèi)參照，分析蛋白表達水平。

1.2.7雙熒光素酶報告實驗 根據(jù)1.2.4進行轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建的GPD1L的野生型(WT)和突變型(MUT)報告載體，分別與miR-con或miR-539共轉(zhuǎn)染AR42J細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞，裂解細胞，離心收集上清，根據(jù)試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析和t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Cerulein處理對AR42J細胞AMY、TNF-α和IL-6表達的影響 與0 h組相比，Cerulein處理4～24 h組AR42J細胞中AMY、TNF-α和IL-6含量顯著上升(P<0.05)，8 h時上升至最高水平，12 h和24 h含量又逐漸降低，見表1。根據(jù)結(jié)果后續(xù)選擇Cerulein處理AR42J細胞8 h。

表1 Cerulein處理AR42J細胞對AMY、TNF-α和 IL-6表達的影響

2.2Cerulein處理對AR42J細胞miR-539和GPD1L表達的影響 與Control組相比，Cerulein組AR42J細胞中miR-539含量顯著升高(P<0.05)，GPD1L mRNA和GPD1L 蛋白含量顯著降低(P<0.05)，見圖1和表2。

圖1 Cerulein處理對AR42J細胞GPDIL蛋白表達的影響

2.3敲減miR-539抑制Cerulein處理的AR42J細胞凋亡和自噬 與Control組相比，Cerulein組AR42J細胞中miR-539含量和細胞凋亡率、Bax、LC3-Ⅱ Beclin1均顯著升高，Bcl-2、p62含量顯著降低(P<0.05)；與Cerulein+anti-miR-con組相比，Cerulein+anti-miR-539組結(jié)果相反(P<0.05)，見圖2、3、4和表3。說明敲減miR-539可抑制Cerulein誘導(dǎo)的AR42J細胞凋亡和自噬。

表2 Cerulein處理對AR42J細胞miR-539、GPD1L mRNA 和蛋白表達的影響

1～4：Control組、Cerulein組、Cerulein+anti-miR-con組、Cerulein+anti-miR-539組圖2 敲減miR-539對Cerulein處理的AR42J細胞 自噬相關(guān)蛋白表達的影響

圖3 敲減miR-539對Cerulein處理的AR42J 細胞凋亡率的影響

圖4 敲減miR-539對Cerulein處理的AR42J細胞凋亡 相關(guān)蛋白表達的影響

表3 敲減miR-539對Cerulein處理的AR42J細胞凋亡率、凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達的影響

2.4miR-539靶向負調(diào)控GPD1L 通過StarBase預(yù)測結(jié)果顯示，GPD1L的3′UTR序列中含有與miR-539互補的位點，見圖5。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果如表4所示，與miR-con組相比，miR-539組野生型GPD1L(WT)的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)，而突變型GPD1L(MUT)的螢火蟲熒光素酶相對活性無明顯變化(P>0.05)。與miR-con組相比，過表達miR-539的Cerulein處理組細胞中GPD1L mRNA和蛋白含量均顯著降低(P<0.05)；抑制miR-539組的Cerulein處理組細胞中GPD1L mRNA和蛋白含量均顯著升高(P<0.05)，見圖6和表5。說明miR-539靶向負調(diào)控GPD1L的表達。

2.5過表達GPD1L抑制Cerulein處理的AR42J細胞凋亡和自噬 與Cerulein+pcDNA-NC組相比，Cerulein+GPD1L組的AR42J細胞中GPD1L、Bcl-2、p62水平顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率、Bax、LC3 Ⅰ、LC3 Ⅱ和Beclin1含量均顯著降低(P<0.05)，見圖7、8、9、10和表6。說明過表達GPD1L可抑制Cerulein誘導(dǎo)的AR42J凋亡和自噬。

圖5 GPD1L的序列中含有與miR-539互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶活性檢測AR42J細胞中miR-539與 GPD1L的靶向關(guān)系

1～4：Cerulein+miR-con組、Cerulein+miR-539組、Cerulein+anti-miR-con組、Cerulein+anti-miR-539組圖6 miR-539對GPD1L蛋白表達的影響

表5 miR-539對GPD1L蛋白表達的影響

1，2：Cerulein+pcDNA-NC組、Cerulein+GPD1L組，下圖同圖7 過表達GPD1L對Cerulein處理的AR42J細胞的 GPD1L蛋白表達的影響

1,2：Cerulein+pcDNA-NC組、Cerulein+GPD1L組圖8 過表達GPD1L 抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細胞 自噬相關(guān)蛋白表達的影響

圖9 過表達GPD1L對Cerulein處理的AR42J細胞 凋亡蛋白表達的影響

圖10 過表達GPD1L對Cerulein處理的AR42J細胞的 凋亡率的影響

表6 過表達GPD1L對Cerulein處理的AR42J細胞的凋亡率、凋亡及自噬蛋白的影響

2.6沉默GPD1L表達逆轉(zhuǎn)敲減miR-539對Cerulein處理的AR42J細胞凋亡和自噬的影響 與Cerulein+anti-miR-539+si-con組相比，Cerulein+anti-miR-539+si-GPD1L組AR42J細胞中GPD1L、Bcl-2、p62、細胞凋亡率均顯著下降，LC3 Ⅰ、LC3 Ⅱ和Beclin1、Bax顯著升高(P<0.05)，見圖11、12、13、14和表7。說明沉默GPD1L逆轉(zhuǎn)了敲減miR-539對Cerulein誘導(dǎo)的胰腺AR42J細胞凋亡和自噬的作用。

1，2：Cerulein+anti-miR-539+si-con組、Cerulein+anti-miR-539+si-GPD1L組，下圖同圖11 沉默GPD1L表達對敲減miR-539介導(dǎo)Cerulein 處理的AR42J細胞中GPD1L蛋白表達的影響

圖12 沉默GPD1L表達對敲減miR-539介導(dǎo)Cerulein 處理的AR42J細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

圖13 抑制GPD1L表達對敲減miR-539介導(dǎo)雨蛙素 處理的AR42J細胞自噬相關(guān)蛋白表達的影響

圖14 沉默GPD1L表達對敲減miR-539介導(dǎo)Cerulein 處理的AR42J細胞凋亡率的影響

表7 沉默GPD1L表達對敲減miR-539介導(dǎo)雨蛙素處理的AR42J細胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白、凋亡率的影響

3 討 論

AP發(fā)病率逐年上升，由此引起的高死亡率和相關(guān)并發(fā)癥嚴重威脅人類健康〔9〕。腺泡細胞的凋亡、壞死、程序性凋亡、自噬和凋亡等影響患者病情轉(zhuǎn)歸，凋亡減輕炎癥〔10〕，異常自噬則導(dǎo)致細胞損傷和炎癥〔11，12〕。多種miRNA在AP中異常表達，參與細胞凋亡、炎癥、自噬等多種生物過程，與AP的進展、診斷、治療靶點等有關(guān)〔13〕。AP模型建立方式眾多，Cerulein或Cerulein聯(lián)合脂多糖(LPS)處理AR42J細胞的方式運用較多〔14〕，且易操作。miR-539與細胞損傷和凋亡有關(guān)。miR-539可靶向基質(zhì)金屬蛋白酶-9調(diào)節(jié)腦缺血再灌注損傷中血腦屏障的通透性〔15〕，靶向ROCK1減輕膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷〔16〕。miR-539通過直接靶向胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)抑制胰腺導(dǎo)管腺癌細胞增殖、克隆形成和侵襲〔17〕，通過靶向TWIST1在胰腺癌中抑制腫瘤〔18〕。本文結(jié)果說明miR-539在AP的發(fā)展中起重要作用。在骨關(guān)節(jié)炎中，GPD1L可調(diào)節(jié)軟骨細胞的增殖、凋亡和炎癥〔19〕。GPD1L的缺失或突變導(dǎo)致炎癥、糖尿病、癌癥等多種疾病〔20，21〕。本文研究結(jié)果表明GPD1L在AP發(fā)展中具有重要作用，胰腺細胞AR42J中miR-539與GPD1L之間具有調(diào)控關(guān)系。本文闡述了在Cerulein誘導(dǎo)的AP模型AR42J細胞中，miR-539上調(diào)，GPD1L下調(diào)，miR-539可通過靶向GPD1L調(diào)控Cerulein誘導(dǎo)的AP AR42J細胞凋亡和自噬，提示miR-539是AP的潛在分子靶點。